三株柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的繁殖力和免疫原性的比较研究

分别用柔嫩艾美耳球虫早熟弱毒株、鸡胚适应株和强毒株孢子化卵囊１０００个／只，给１０日龄无球虫雏鸡免疫接种，逐日检查粪便并进行克粪便卵囊（Ｏ．Ｐ．Ｇ．）计数，结果发现早熟弱毒株和鸡胚适应株的潜隐期均有不同程度缩短，繁殖力亦有不同程度的下降。同时进行了柔嫩艾美耳球虫不同株球虫的免疫原性比较：分别用三株卵囊免疫雏鸡，免疫剂量为１０００个／只，免疫后１４ｄ各用１０００个／只强毒株卵囊攻虫，逐日进行Ｏ．Ｐ．Ｇ．计数，发现各组免疫鸡攻虫后的卵囊产量均大大下降，其中以强毒株免疫攻虫组的排出卵囊量最低，仅为未免疫组的１．２３％，早熟株和鸡胚株免疫鸡攻虫的排出卵囊量相近，分别为未免疫组的７．３５％和７．２３％。由此可见，三株柔嫩艾美尔球虫均表现出良好的免疫原性。     

宿主日龄对艾美耳球虫 (Eimeria)早熟虫株感染力及雏鸡球虫免疫力的影响(英文)

用 10 0 0个柔嫩艾美耳球虫 (E .tenella)早熟株孢子化卵囊 ,10 0 0个毒害艾美耳球虫 (E .neca trix)早熟株孢子化卵囊和 5 0 0个巨型艾美耳球虫 (E .maxima)早熟株卵囊分别接种 1,7和 2 5日龄雏鸡 ,接种后 14天分别用相应的 2 0 0 ,2 0 0和 10 0个亲本毒株孢子化卵囊进行攻虫。初次接种和攻虫后分别检查卵囊总产量。结果表明 ,3种早熟虫株的卵囊都能够成功的感染 1日龄和 7日龄雏鸡。初次接种后雏鸡都产生了不同程度的球虫免疫力。本研究证实 ,艾美耳球虫早熟株卵囊能够诱导初生和幼龄雏鸡产生球虫免疫力     

宿主日龄对艾美耳球虫（Eimeria）早熟虫株感染力及雏鸡球虫免疫力的影响

用1000个柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)早熟株孢子化卵囊,1000个毒害艾美耳球虫(E.necatrix)早熟株孢子化卵囊和500个巨型艾美耳球虫(E.maxima)早熟株卵囊分别接种1,7和25日龄雏鸡,接种后14天分别用相应的200,200和100个亲本毒株孢子化卵囊进行攻虫.初次接种和攻虫后分别检查卵囊总产量.结果表明,3种早熟虫株的卵囊都能够成功的感染1日龄和7日龄雏鸡.初次接种后雏鸡都产生了不同程度的球虫免疫力.本研究证实,艾美耳球虫早熟株卵囊能够诱导初生和幼龄雏鸡产生球虫免疫力.     

肠艾美耳球虫张家口分离株致病性和免疫原性的初步研究

肠艾美耳球虫是兔球虫中的主要致病虫种之一,充分研究其生物学特性对兔球虫病的防治有十分重要的意义。本文对肠艾美耳球虫张家口分离株的致病性和免疫原性进行了初步研究。利用3个剂量（1×10^4、1×10^5、1×10^6）的肠艾美耳球虫张家口分离株孢子化卵囊感染35—45日龄无球虫兔,观察临床症状和体重变化,以研究其致病性;21d后,再用1×10。个肠艾美耳球虫孢子化卯囊进行攻毒,监测体重变化和卵囊排出量,评价其免疫原性。结果发现,接种1×10^4个卵囊,即可导致家兔出现临床症状,与空白对照组相比,日增重显著下降,更高感染剂量则会加重症状。攻毒后,免疫组增重未受影响,与空白对照组相比无差异,而不免疫攻毒组体重显著下降;同时免疫组的卵囊排出量显著低于不免疫攻毒组。结果表明肠艾美耳球虫张家口分离株对仔兔具有中等致病性;同时其免疫原性良好。因此可以把该株球虫作为原始株进行早熟虫株选育,并以此为基础,进行兔球虫病疫苗的开发。     

鸡感染巨型艾美耳球虫后的体液、粘膜与细胞免疫应答

鸡的7种艾美耳球虫中,巨型艾美耳球虫免疫原性最强。为研究巨型艾美耳球虫激发宿主产生的免疫应答,我们检测了巨型艾美耳球虫3次感染后鸡只的抗体应答及细胞应答特征。ELISA检测显示,感染鸡只产生了显著高于未感染鸡只的特异性IgY和sIgA（肠道及胆汁）抗体;而酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测显示,被感染鸡只脾脏中分泌IFN-γ的球虫特异性淋巴细胞的数量显著高于对照组。粪便中卵囊的检测则显示,第3次感染后的鸡只几乎无卵囊排出,证实巨型艾美耳球虫产生的免疫应答可对同源感染提供完全的免疫保护。     

福建三株柔嫩艾美耳球虫的分离、鉴定及致病性的初步研究

采用单卵囊分离技术,从福建省莆田市、福清市和连江县等三地鸡场的病鸡盲肠内容物样品中,分离获得3株柔嫩艾美耳球虫Eimeria tenella,代号分别为PT0705、FQ0709和LJ0711.为比较这3株柔嫩艾美耳球虫的致病性,分别用1×104、5×104和10×104个孢子化卵囊的剂量感染14日龄和21日龄健康无球虫雏鸡,通过临床表现、死亡率、增重、病变计分等指标进行统计和分析,确定PT0705为毒性最强虫株.     

和缓艾美耳球虫激发宿主免疫应答的初步研究

和缓艾美耳球虫Eimeriamitis是7种鸡球虫中致病力弱的虫种,对于其免疫原性的认识至今仍有争论。本研究以和缓艾美耳球虫涿州株为研究对象,以初次免疫及二次免疫后鸡的卵囊排出量为标准评估了其免疫原性。同时利用ELISA检测了免疫后鸡群血清中球虫特异性IgY抗体的水平,并通过ELISPOT技术分析了二免后鸡群外周血单核淋巴细胞（PBMC）中分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞的数量。结果显示,二次免疫后,鸡的卵囊排出量显著低于初次免疫,免疫组的血清特异性IgY抗体水平较低,而分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞的数量较高。这些结果表明和缓艾美耳球虫涿州株具备良好免疫原性,且其激发宿主产生的保护性免疫以细胞免疫应答为主,有作为疫苗株的潜力。     

特异性引物PCR鉴定鸡球虫种类与卵囊纯度的研究

为了建立鸡球虫种类的快速分子生物学鉴定方法,检测实验室保存虫株受污染状况,分别对单卵囊分离繁殖及实验室长期传代保存的6株巨型艾美耳球虫（EMSH01、EM4101、EMES01、EMBA01、EMTY01和EMTO01）、4株柔嫩艾美耳球虫（ETDS01、ETGD01、ETAD和ETAM）、1株堆形艾美耳球虫（EA1201）、1株变位艾美耳球虫（EMIS01）、1株毒害艾美耳球虫（ENGD01）收集卵囊,纯化、提取总DNA,根据巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、堆形艾美耳球虫的RAPD和SCAR分子标记、ITS-1区序列分别设计Tn-F与Tn-R、Mx-F与Mx-R、Ac-F与Ac-R、ET-1与ET-2、EM-1与EM-2、EA-1与EA-2等6对特异性引物,对13个虫株分别进行PCR扩增,1%琼脂糖电泳分析片段大小.结果显示：用引物Tn-F与Tn-R、ET-1与ET-2对ETDS01、ETGD01、ETAD、ETAM、EMTO01扩增出特异性条带,其余4种8个虫株未见条带;用引物Mx-F与Mx-R、EM-1与EM-2对EMSH01、EM4101、EMES01、EMBA01、EMTY01和EMTO01扩增出特异性条带,其余4种7个虫株未见条带;用引物Ac-F与Ac-R、EA-1与EA-2对EA1201扩增出特异性条带,其余4种12个虫株未见条带.结果说明特异性引物PCR方法鉴定的5种球虫与原常规生物学方法鉴定的结果一致,检测出保存的巨型艾美耳球虫EMTO01虫株受柔嫩艾美耳球虫污染,其余虫株未发现交叉污染.研究证明利用特异性引物建立的PCR方法可用于鸡球虫种类与卵囊纯度的鉴定.     

柔嫩艾美耳球虫田间分离株对马杜霉素耐药性检测

以对马杜霉素完全敏感和柔嫩艾美耳球虫豪顿株为参照 ,检测柔嫩艾美耳球虫 2个河北分离株(HBZ、HBH)、 2个山东分离株 (SDZ、SDT)对马杜霉素的耐药程度。按每羽 5× 1 0 4个孢子化卵囊的剂量接种 7日龄试验鸡只 ,接种后第 7天剖杀所有试验鸡 ,观察盲肠病变 ,计算平均增重、盲肠内容物卵囊数、粪便中卵囊排出量和抗球虫指数 (ACI)。以ACI值作为判定耐药程度的标准 ,ACI≥ 1 80判为敏感 ,1 6 0≤ACI<1 80判为部分耐药 ,ACI<1 6 0判为耐药。结果是柔嫩艾美耳球虫豪顿株的ACI为 1 98 3,柔嫩艾美耳球虫河北分离株HBZ、HBH组的ACI分别是 1 4 7 5、 1 5 3 7,山东分离株SDZ、SDT组的ACI分别是1 2 7 2、 1 30 0。试验证明柔嫩艾美耳球虫 2个河北分离株 (HBZ、HBH)、 2个山东分离株 (SDZ、SDT)对马杜霉素具有耐药性     

重组禽流感疫苗株rH5N3的生物学特性与免疫效果

目的评价重组禽流感疫苗株rH5N3的生物学特性和免疫效果。方法将rH5N3注射SPF鸡胚和SPF鸡，观察其致病性；rH5N3及其亲本毒株A／Goose／HLJ／QFY／04分别在MDCK细胞单层和SPF鸡胚中增值，研究其生长特性；rH5N3在SPF鸡胚中连续传代，测定第10代rH5N3的核酸序列，评价其遗传稳定性；制备油包水型灭活rH5N3疫苗接种SPF鸡，免疫后不同时间采血测HI抗体滴度；rH5N3灭活疫苗接种SPF鸡，免疫后3周采血测定HI抗体滴度，同时进行H5N1亚型强毒株攻击，观察其保护作用。结果rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性；其在鸡胚尿囊液和细胞培养上清液的HA效价极大提高，分别为1：2048和1：512；第10代rH5N3的核酸序列与其亲本毒株相同；灭活rH5N3疫苗免疫鸡后2周即可诱导产生高效价HI抗体，且免疫后18周依然保持较高水平；该疫苗对强毒株包括国内早期分离的A／Goose／Guangdon∥1196和近期分离的A／Goose／HLJ／QFY／04都能产生完全的保护作用，免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。结论rH5N3疫苗株具有安全、高产、稳定等特点，且具良好的免疫原性，免疫动物完全能够抵抗强毒株的致死性攻击。该疫苗株的成功研制为H5N1亚型高致病性禽流感的防控提供了新的技术保障。     

堆型艾美耳球虫cSZ1基因在减毒沙门氏菌的表达及免疫保护效果研究

用PCR方法扩增堆型艾美耳球虫广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的阅读框架 (ORF) ,与质粒表达载体pYA3342连接后转化大肠杆菌E-coliX6 2 12 ,获得阳性重组质粒后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)X4 5 5 0。经IPTG诱导获得了cSZ1基因在减毒S typhimurium的高效表达 ,表达产物占菌体总蛋白的 9 2 % ,重组蛋白分子量约为 19kDa。将重组减毒S typhimurium分别以 10 8或 10 9CFU 鸡经口免疫 4日龄岭南黄肉鸡 ,免疫后两周血清中可检测到抗cSZ1的特异性IgG ,3周时抗体水平达到峰值 ;2 5日龄时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫后 3周 ,试验鸡分别经口攻击感染 5 0 0个E acervulina孢子化卵囊 ,结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线 ;计数攻虫感染后第 3 5～ 9 5天卵囊总产量 ,2个免疫组分别能降低 2 5 . 1%和 4 6 . 4 %的卵囊产生。     

柔嫩艾美耳球虫山西分离株的分离与致病性观察

运用单卵囊分离技术，从山西省某鸡场鸡球虫感染粪便样品中获得l株纯种球虫，鉴定为柔嫩艾美耳球虫并命名为Eimeria tenella SX010323，并对其致病性进行了研究。（1）该球虫卵囊寄生于盲肠、为宽卵圆形，卵囊壁光滑、褐色，无卵膜孔，有极粒，无内、外残体。孢子囊呈长卵圆形，有斯氏体。卵囊大小范围为（16．80～28．80）μm×（14．40～25．20）μm，平均大小为（21．54±0．24）μm×（17．85±0．24）μm，形状指数为1．21±0．05。子孢子，大小范围为（10．20～12．75）μm×（4．40—7．25）μm，平均大小为（11．54±0．24）μm×（6．27±0．43）μm。潜隐期为141h，最短孢子化时间为19h；（2）63只11日龄的海兰白公雏随机分为7组，分别口服感染此新鲜卵囊1×10^3、5×10^3、1×10^4、2×10^4、5×10^4、1．0×10^5个，并设立不感染对照组。结果表明：所有感染组增重均低于对照组（P〈O．05），各感染组间随着感染剂量的增加，增重和增重率显著降低，血便率和盲肠病变记分增加（P〈0．05）；（3）将4℃分别保存17、13、10、4、1个月和新鲜孢子化的虫株卵囊，以1．5×10^4个／只的剂量感染11日龄雏鸡，每组10只。结果表明：保存1个月和4个月活力较高，保存10个月活力开始下降，保存13、17个月活力下降较大。     

巨型艾美耳球虫孢子化卵囊抗原免疫原性的研究

用脂质体包裹Ｅｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａ孢子化卵囊抗原给鸡口服免疫，以１０３个孢子化Ｅ．ｍａｘｉｍａ卵囊／只的剂量攻毒，可使鸡获得４６％的保护力。ＥＬＩＳＡ检测结果表明，鸡体在免疫后产生了特异性抗体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明，所提取Ｅ．ｍａｘｉｍａ孢子化卵囊可溶性抗原至少有１６条带，其中８条主带分子量分别为：＞９７．４ｋＤ、４７．９ｋＤ、４２．７ｋＤ、３５．５ｋＤ、２９．５ｋＤ、２３．４ｋＤ、１３．５ｋＤ、１０．５ｋＤ。用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明，口服活卵囊初次免疫１４ｄ后的鸡血清，可识别出４条带，其分子量分别为：＞９７．４ｋＤ、６０．３ｋＤ、４７．９ｋＤ、４２．７ｋＤ。     

兔球虫PCR检测方法的改进和应用

兔球虫病由艾美耳属球虫寄生于消化道而引起,对养兔业的危害极大。由于兔艾美耳球虫的11个虫种在致病性上有较大差异,因此进行准确的虫种鉴定对兔球虫病的诊断和防治有十分重要的意义。为提高和扩大PCR方法检测粪便样品中艾美耳球虫的灵敏度和应用范围,我们利用全基因组扩增技术对提取自粪便样品的球虫基因组进行预扩增,提高PCR反应初始模板含量,再利用兔艾美耳球虫ITS-1序列种特异性引物对WGA产物进行PCR扩增,以鉴定虫种。结果显示,经全基因组扩增后的样品的PCR检测能够在单个卵囊的水平上进行虫种鉴定。利用该方法,我们对10份卵囊含量较少的田间兔粪样品进行了PCR检测,对其中的虫种进行了的鉴定。检测结果显示,与卵囊形态鉴定相比,该方法不仅与能确定形态的形态学检测结果一致,还能够检测出形态学不易判断的虫种,体现了更高的准确性。该技术的应用可提高田间样品检测的敏感性和准确度,为兔球虫临床感染情况提供实践指导。     

鸡柔嫩艾美耳球虫cDNA文库构建与表达序列标签分析

为系统分析鸡球虫敏感虫株和抗药虫株不同发育阶段的基因表达情况,利用柔嫩艾美耳球虫敏感株和抗马杜霉素株(由敏感株诱导)的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子为材料构建了一个混合cDNA文库,并用该文库获得了2806条3'端高质量的表达序列标签(ESTs)。通过生物信息学分析:EST序列拼接出1424个假定独立转录本(TUTs),冗余度为49.3%。从cDNA文库中筛选出大量的低丰度表达基因,约占TUT总数的91.5%,且功能未知基因约占TUT总数的83.6%。在功能注释基因中,编码MIC2蛋白、BT1家族蛋白和核糖体蛋白等入侵和发育相关的基因高丰度表达。     

百球清（Baycox）对柔嫩艾美尔球虫的作用以及对球虫免疫力影响的研究

进行四项试验观察Ｂａｙｃｏｘ对柔嫩艾美尔球虫的作用及其对球虫免疫力影响。Ｂａｙｃｏｘ均以推荐浓度（２５ｐｐｍＴｏｌｔｒａｚｕｒｉｌ）混入水中任鸡自由饮用。以２０００卵囊剂量感染并立即给药的鸡，在感染后６－２０ｄ粪便中始终没有发现卵囊，表明Ｂａｙｏｏｘ具有杀虫作用而不是抑虫作用。以８×１０￣４卵囊剂量感染鸡，在感染前１ｄ和感染后０、１、２、３、４、５ｄ分别开始给药，根据血便数量和盲肠病变判断，Ｂａｙｃｏｘ的作用峰期是在感染后０－２ｄ之间。感染后第４ｄ再给药已无治疗作用。停药１ｄ后，药物残效对感染仍显出一定的抗球虫作用，但是停药２ｄ后，这种作用即基本消失。采用攻毒的方法表明Ｂａｙｃｏｘ不影响抗球虫免疫力的形成。     

柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）BJ株TA4基因的克隆的序列分析

对柔嫩艾美耳球虫（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）ＢＪ株ＴＡ４基因进行了克隆和测序分析。经纯化的Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａＢＪ株７ｈ孢子化卵囊的总ＲＮＡ为模板，根据国外报道的序列设计一对引物，用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出ＢＪ虫株的ＴＡ４基因。用常规基因克隆方法把ＢＪ株ＴＡ４基因插入ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体，选取正方向插入的一个阳性克隆进行酶切分析及插入片段的全序列测序分析。结果表明：该序列全长１２２７个核苷酸，有一个含２３０     

狂犬病毒CTN株糖蛋白重组鸡痘病毒与核酸疫苗的联合免疫

目的 构建狂犬病毒糖蛋白重组鸡痘病毒，研究联合运用重组病毒与同一抗原核酸疫苗对小鼠的免疫效果，为狂犬病疫苗的研究提供基础。方法 以中国鸡痘病毒疫苗株282E4为基础构建的表达载体pUTA-2的ATI-P7．5复合启动子下游，插入狂犬病毒CTN-18l株糖蛋白基因，构建了重组转移载体pUTA-RgC。以脂质体转染法将pUTA-RgC转染至已感染鸡痘病毒282E4株(FPV)2～3h的鸡胚成纤维(CEF)细胞中。待细胞出现明显病变后收获病毒，用BrdU进行连续3次加压筛选，挑取蚀斑毒株、纯化、扩增，间接免疫荧光鉴定。用重组鸡痘病毒vUTA-RgC单独及与核酸疫苗联合免疫小鼠，在细胞及体液免疫，攻毒保护水平评价所构建的重组病毒及联合免疫效果。结果 间接免疫荧光结果表明已成功构建重组鸡痘病毒，免疫后能诱导机体产生细胞与体液免疫，并能抵抗标准攻毒株的攻击，联合免疫效果较为理想。结论 获得一株能够表达狂犬病毒糖蛋白的vUTA．RgC，并证明有一定的免疫原性，与核酸疫苗联合应用能够克服各自的缺点。     

实时定量PCR检测马传染性贫血病毒载量方法的建立和应用

目的建立实时定量PCR检测血浆病毒载量的方法，对马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus，EIAV）强毒株攻毒马和疫苗免疫攻毒马血浆中病毒载量进行了跟踪检测，探讨病毒载量和临床疾病状态的相关性。方法以EIAV强毒株LN40序列为标准，在gag保守区设计1对引物和Taqman探针，用于实时定量PCR扩增，用含扩增目的基因的体外转录RNA作标准品，获得标准曲线，对扩增样品进行准确定量。强毒株LN40直接攻毒，或者疫苗株DLV免疫马6个月后用强毒株LN40进行攻毒，跟踪检测攻毒马及免疫攻毒马血浆中EIAV载量情况。结果反应在10^1～10^9copies／ml之间具有良好的线性关系，反应的检出下限为10copies／ml。强毒攻毒马出现发热并最终死亡，发热期间马血浆中EIAV载量与体温呈正相关，载量最高达10^7copies／ml。免疫攻毒马未出现发热，其血浆EIAV载量的总体水平低于强毒攻毒马，攻毒后3个月低至10copies／ml以下。结论成功建立了实时定量PCR检测血浆EIAV载量的方法，并证实了用实时荧光定量PER检测EIAV病毒载量的方法来监测动物感染状态具有可行性，为EIAV致病机制研究和弱毒疫苗免疫保护机制的研究提供良好的技术平台。     

鸡伤寒沙门菌减毒株1009ΔspiCΔcrp的保护效力评价

目的为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒活疫苗,该实验对鸡伤寒沙门菌减毒株1009ΔspiCΔcrp的安全性及保护力进行观察。方法以1×108集落形成单位的1009ΔspiCΔcrp对3日龄雏鸡口服免疫,在7 d后进行再次免疫,测定雏鸡的体质量变化、血清抗体水平和细胞因子水平,并对SG9强毒株攻毒后的保护力进行评价。结果免疫组鸡的体质量增长与对照组无明显差异,血清IgG水平持续上升并显著高于对照组,白细胞介素4(IL-4)、IL-6和IL-1β的水平也升高。以SG9强毒株攻击后,免疫组的保护率为100%,而对照组为20%。HE染色结果显示,免疫组鸡无病变,而对照组鸡脏器病变明显。结论1009ΔspiCΔcrp具有良好的安全性和免疫原性,是防治鸡伤寒理想的疫苗候选株。