表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白的转基因和缓艾美耳球虫的构建

H9N2亚型禽流感病毒已经被证实可以传播到人类,对它存在的潜在危害已受到越来越多的关注。因此,研究安全而有效的H9N2禽流感病毒疫苗已迫在眉睫。为研究和缓艾美耳球虫作为活载体表达及运输禽流感病毒抗原的潜能,本研究构建了可稳定表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白的转基因和缓艾美耳球虫。利用黄色荧光蛋白（YFP）及融合的乙胺嘧啶抗性基因（DHFR-TSm2m3）作为报告基因及筛选基因,我们将表达H9N2禽流感病毒HA1抗原的质粒载体核转球虫子孢子,接种鸡后在乙胺嘧啶药物的选择压力下进行筛选并连续传代获得转基因和缓艾美耳球虫系。利用染色体步移和免疫印迹证实了HA1基因的成功插入和表达;利用间接免疫荧光证实HA1蛋白定位于球虫子孢子细胞膜表面和头部。研究进一步发现,转基因球虫的繁殖力与野生球虫相当,感染后亦于第6d达到排卵囊高峰。该转基因和缓艾美耳球虫株具有作为疫苗活载体的潜能。     

和缓艾美耳球虫激发宿主免疫应答的初步研究

和缓艾美耳球虫Eimeriamitis是7种鸡球虫中致病力弱的虫种,对于其免疫原性的认识至今仍有争论。本研究以和缓艾美耳球虫涿州株为研究对象,以初次免疫及二次免疫后鸡的卵囊排出量为标准评估了其免疫原性。同时利用ELISA检测了免疫后鸡群血清中球虫特异性IgY抗体的水平,并通过ELISPOT技术分析了二免后鸡群外周血单核淋巴细胞（PBMC）中分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞的数量。结果显示,二次免疫后,鸡的卵囊排出量显著低于初次免疫,免疫组的血清特异性IgY抗体水平较低,而分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞的数量较高。这些结果表明和缓艾美耳球虫涿州株具备良好免疫原性,且其激发宿主产生的保护性免疫以细胞免疫应答为主,有作为疫苗株的潜力。     

艾美耳球虫子孢子从宿主细胞中逸出机制的初步研究

艾美耳球虫是一类重要的肠道病原,其裂殖生殖阶段的虫体逸出过程是造成畜禽肠道破坏的主要原因之一,但此逸出过程的机制仍鲜有报道。本研究以乙醇作为诱导剂研究柔嫩艾美耳球虫M2e株子孢子从宿主细胞中逸出的机制。结果显示,乙醇可诱导子孢子从MDBK细胞中逸出,此逸出过程依赖于虫体的运动能力;同时,乙醇可激发子孢子逸出相关的微线体蛋白2（Mic2）的分泌释放。进一步实验证实,螯合虫体内部钙离子明显阻断了子孢子逸出及Mic2蛋白的释放。本研究初步证实了与柔嫩艾美耳球虫逸出相关的蛋白和离子,为深入解析球虫致病的分子机制、研发新型抗球虫药物提供了新的研究方向。     

基于IFA技术检测微线体蛋白2在艾美耳属球虫的空间分布

微线体蛋白2（Microneme protein2,Mic2）是艾美耳球虫入侵宿主细胞时分泌的主要功能蛋白之一。本研究中,以抗柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2（EtMic2）单克隆抗体为检测抗体,利用间接免疫荧光实验（IFA）检测了Mic2在柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、斯氏艾美耳球虫和无残艾美耳球虫等不同种艾美耳属球虫的空间分布。结果显示,Mic2在不同种艾美耳属球虫中均定位于子孢子的顶部（微线体部位）,但表达强度存在差异。这提示Mic2可作为研究艾美耳属球虫相关蛋白空间分布的“参照物”。