空肠弯曲菌PEB1-LTB DNA疫苗构建及其对小鼠免疫保护性的研究

目的:研究粘膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)辅助的空肠弯曲菌(C.jejuni)外膜蛋白PEB1基因重组DNA疫苗诱导小鼠免疫应答水平。方法:构建pcDNA3.1(-)-PEB1-LTB真核重组表达载体,转染Hela细胞,Westernblot鉴定蛋白表达。滴鼻免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,测定小鼠血清中IgG、IgA及气管、小肠粘膜冲洗液sIgA抗体;脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4水平。末次免疫后4周,采用空肠弯曲菌重复攻击的方式进行灌胃攻击,攻击后,根据动物疾病指数评价疫苗临床保护率。结果:构建的重组表达质粒能在Hela细胞内表达,重组蛋白。疫苗免疫小鼠后,不仅诱导了高水平血清IgG、IgA抗体,而且诱导了高水平粘膜sIgA抗体。其诱导的特异性免疫应答能有效保护免疫后小鼠免遭空肠弯曲菌的感染攻击。结论:构建的DNA疫苗经粘膜免疫能诱导小鼠产生较高水平的特异性免疫应答,能有效预防空肠弯曲菌感染。     

编码精子赤道段蛋白的质粒DNA免疫影响小鼠生育功能

目的 探讨编码小鼠精子赤道段蛋白(mESP)的DNA疫苗免疫避孕功能.方法 构建PcDNA3.1/mESP真核表达质粒,表达mESP蛋白N-端片段.将纯化后的质粒直接肌肉注射免疫8只BALB/c雌性小鼠,以空载质粒pcDNA3.1免疫作为对照组.通过RT-PCR检测重组质粒在小鼠体内的表达情况.通过ELISA和双重免疫...     

嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫应答及其保护力

目的:研究嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫原性以及对LP感染小鼠的保护能力。方法:用嗜肺军团菌免疫原蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFNγ-产生水平和CTL特异杀伤活性等指标,以评价疫苗的免疫原性。真核表达重组质粒pcDNA3.1-ipDNA疫苗重复免疫BALB/c小鼠2次,末次免疫2周后,用10倍LD50剂量攻击小鼠,计数小鼠的存活数及小鼠肺中的细菌数,观察感染鼠的肺部病理变化。结果:pcDNA3.1-ip免疫小鼠后诱导产生了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答,免疫组的免疫原性和免疫保护性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P<0.01)。结论:免疫原蛋白基因可作为嗜肺军团菌核酸疫苗的侯选基因。     

空肠弯曲菌DNA疫苗构建及其疫苗免疫程序研究

目的:构建空肠弯曲菌peb1A基因真核表达载体,探讨DNA疫苗不同免疫程序的免疫效果。方法:以重组pET28a(+)-peb1A质粒为模板,将空肠弯曲菌peb1A基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染COS-7细胞中表达,Western blot鉴定表达蛋白;昆明小鼠随机分组:设空白对照组、空载体对照组、pcDNA3.1(-)-peb1A实验组,用ELISA法检测免疫后的昆明小鼠血清IgG和IgM抗体水平。结果:重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经双酶切和PCR鉴定,构建正确。peb1A基因测序结果与GenBank中peb1A基因序列一致。重组质粒成功转染COS-7细胞,并能正确表达重组蛋白。裸DNA组IgG水平均高于两对照组,有显著性差异(P<0.05)。同一剂量短时间(0、10、20天)免疫程序优于长时间(0、15、25、35天)免疫程序(P<0.05)。结论:成功构建空肠弯曲菌真核表达重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A,其经肌肉注射免疫小鼠,具有较好的免疫原性,短时间免疫程序免疫效果好。     

SARS冠状病毒spike基因DNA疫苗的初步研究

目的　构建SARS病毒spike基因片段真核表达质粒DNA疫苗;检测spike基因片段的免疫原性;筛选SARS病毒疫苗构建的理想靶抗原。方法　采用RT PCR从SARS冠状病毒北京0 1(BJ0 1)株cDNA获取了spike基因cDNA的全长D12、编码N末端氨基酸的cDNA片段D14和编码C末端氨基酸的cDNA片段D2 3;构建重组真核表达质粒pcDNA3 /D12、pcDNA3 D14、pcDNA3 D2 /3;用3种重组质粒和pcDNA3空质粒载体(对照)DNA皮下注射免疫Wistar大鼠;ELISA检测免疫后大鼠血清S蛋白特异性抗体IgG的产生;同位素51 Cr实验检测特异性CTL应答;ELISPOT检测单细胞水平IFN -γ分泌。结果　pcDNA3 /D2 3疫苗免疫组大鼠血清有S蛋白阳性抗体IgG产生、抗体滴度>10 0 0 ;脾淋巴细胞可诱导特异的CTL应答和IFN γ分泌,pcDNA3 /D2 3疫苗组与其它组之间统计分析P <0 .0 5。结论SARS冠状病毒S蛋白的C末端具有较强的免疫原性,是疫苗构建的理想候选靶抗原,本研究结果为SARS病毒的疫苗研究提供了资料。     

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的 :探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性。方法 :将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中 ,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT。将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,用间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验 ,检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平 ,并观察其对免疫小鼠的毒副作用。结果 :用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后 ,在效靶比为 10 0∶1时 ,可诱导显著地特异性CTL应答 (P <0 .0 5 )。ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高 (P <0 .0 5 )。在BPT基因原核表达蛋白的刺激下 ,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著 (P <0 .0 5 )。RT PCR分析表明 ,IL 12mRNA的水平亦明显升高。结论 :HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答 ,为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据     

Cpn0308真核表达载体的构建及对小鼠免疫功能的影响

目的:构建Cpn0308重组质粒pcDNA3.1/His A-Cpn0308,将重组质粒腹腔注射小鼠后观察小鼠免疫反应变化,以期为进一步研究Cpn0308免疫保护性奠定基础。方法:构建pcDNA3.1/His A-Cpn0308,并用菌落PCR、双酶切、序列测定等多种技术确定其正确性;将重组质粒转染HeLa细胞,间接免疫荧光法检测细胞内蛋白表达情况;重组质粒免疫BALB/c小鼠,一定时间后Western blot检测血清Cpn0308抗体特异性,间接ELISA法检测小鼠血清中Cpn0308 IgG抗体水平、ELISA试剂盒检测血清中细胞因子。结果:pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒构建成功且序列正确;重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光;重组质粒组血清抗体A450x±s为0.343±0.024,pcDNA3.1/His A质粒组为0.174±0.018,PBS组为0.156±0.023,WB结果显示重组质粒组小鼠血清稀释800倍后仍有特异性目的条带出现,对照组不出现;重组质粒组小鼠IFN-γ浓度均值为264 ng/L,IL-4浓度均值为22 ng/L,pcDNA3.1/His A质粒组为:IFN-γ120 ng/L,IL-4 10 ng/L,PBS组为:IFN-γ99 ng/L,IL-4 9 ng/L。重组质粒组IgG抗体水平和细胞因子水平明显升高,与对照组相比有统计学差异。结论:pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表达重组质粒构建成功,且能够在真核细胞中表达目的蛋白;重组质粒对小鼠进行免疫后,提高了小鼠血清IgG抗体水平和细胞因子水平,为进一步研究Cpn DNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

弓形虫多表位DNA疫苗的构建及其免疫保护作用

目的:构建弓形虫多表位DNA疫苗并研究其免疫保护效果.方法:将编码含弓形虫多个T、B细胞表位的6段弓形虫多肽基因,以5个甘氨酸编码基因相间隔相连接,克隆入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成多表位弓形虫DNA疫苗.免疫BALB/c小鼠,测定其诱导的特异性抗体水平及T淋巴细胞增殖状况,同时进行弓形虫攻击感染保护实验.结果:成功构建了包含多个弓形虫表位的真核表达质粒pcDNA3.1/T-ME,以其作为DNA疫苗免疫小鼠,可诱导机体产生弓形虫特异性的体液及细胞免疫应答,产生有效的抗弓形虫保护性免疫应答.结论:构建的弓形虫多表位DNA疫苗能诱导机体产生有效的保护性免疫应答,在控制弓形虫感染上具有可行性.     

A族链球菌表面新发现蛋白Fba真核表达质粒的构建及其诱导的免疫应答

目的：构建新发现的A族链球菌（GAS）表面蛋白Fba的真核表达质粒,并将其以及Fba蛋白、M蛋白分别免疫小鼠,对它们诱导的体液免疫及细胞免疫应答进行评价分析。探讨Fba蛋白作为GAS候选疫苗的可能性。方法：以SSI-9菌株（GASM1血清型标准株）作为模板,采用PCR方法扩增Fba基因,测序正确后克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建真核表达质粒pcDNA3.1/fba;将雌性CD1小鼠随机分成6组,分别为Fba蛋白免疫组、M蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba＋Fba蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba免疫组、pcDNA3.1空质粒对照及PBS对照组。ELISA检测各免疫组血清IgG的动态变化水平;脾细胞增殖试验检细胞增殖水平,并用流式细胞术检测小鼠体内CD4＋、CD8＋淋巴细胞的变化。试验结果经SPSS10.0统计处理。结果：成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1/fba;质粒或蛋白免疫后小鼠IgG产生水平以Fba蛋白免疫组增高最为明显,其次为Fba质粒蛋白混合免疫组及Fba质粒组。特异性抗原诱导后体外脾细胞增殖试验显示：pcDNA3.1/fba免疫组增殖水平明显高于其它组,流式细胞检测结果与此一致,并显示以CD4＋T细胞水平升高为主,CD8＋T细胞水平在各组别之间也有一定的差异。结论：（1）Fba蛋白与M蛋白一样均能有效地诱导机体产生抗体,提示Fba蛋白很有希望成为GAS的候选疫苗。（2）成功构建了Fba蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1/fba,且该重组质粒能有效地诱导抗链球菌所需的抗体,并能增强CD4＋T细胞、CD8＋T细胞的增殖功能。     

布氏杆菌pCDNA3.1-L7/L12核酸疫苗的构建及其免疫学评价

目的 获得布氏杆菌保护性抗原L2／L12重组蛋白及pCDNA3．1-L7／L12重组质粒，并比较其诱导特异性免疫应答的能力。方法 PCR扩增布氏杆菌核蛋白L7／L12基因分别构建至原核表达载体PET32a( )和真核表达载体pCDNA3.1( )中；pET32a-L7／L12重组质粒转化BL21(DE3)，所表达蛋白经SDS-PAGE、免疫印迹分析、纯化后免疫小鼠；pCDNA3.1-12／L12重组质粒配以GM-CSF同时肌肉注射免疫小鼠，3次免疫后测定免疫功能进行免疫效果的评价。结果ELISA、Western blot检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生，蛋白苗所诱导的抗体效价远远高于DNA疫苗；通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发TH1型免疫为主。结论 所构建的布氏杆菌DNA疫苗和蛋白苗均具有诱导特异性细胞和体液免疫应答的能力，DNA疫苗诱导产生的细胞免疫反应强于蛋白苗，可作为潜在的布氏菌新型疫苗，有进一步研究的意义。     

两株登革2型病毒E基因重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较

目的 用含登革2型病毒(Dengue type 2 virus,DEN2)B株和NGC株E基因部分序列pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 用两株含DEN2 E基因部分序列(1～476 bp)的pcDNA3.1重组质粒与含有佐剂的重组质粒共同免疫BALB/c小鼠,初次免疫后第14天、28天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第14、28、42、70和98天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血浆特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异性抗体水平.结果 不同DEN2毒株E基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类抗体的产生存在差异,B株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DEN2两毒株E基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.     

人偏肺病毒DNA疫苗的构建和小鼠免疫反应的研究

目的 构建人偏肺病毒(hMPV)DNA疫苗,小鼠免疫后评价其细胞和体液免疫水平.方法 利用PCR方法,从hMPV的cDNA中扩增融合蛋白FATM(缺失跨膜区)基因和基质蛋白M基因,构建DNA疫苗pcDNA3.1His-FATM和pcDNA3.1His-M,瞬时转染后用Western Blot和间接免疫荧光方法检测F、M蛋白表达.疫苗肌内注射免疫小鼠,ELISA和ELISPOT方法分别检测血清IgG抗体和小鼠脾细胞CTL水平.结果 Western Blot和间接免疫荧光(IFA)方法证明构建的疫苗可表达FATM和M蛋白.peDNA3.1His-FATM单独免疫小鼠,血清抗体滴度为1:44;与pcDNA3.1His-M联合免疫后,血清抗体滴度为1:64.ELISPOT检测证明,联合免疫组小鼠脾细胞产生IFN-γ的效应CD8+T细胞数为42±8.9,高于单独免疫组32±7.4的水平.结论 DNA疫苗peDNA3.1His-F△TM可以诱导产生特异性的体液和细胞免疫,与pcDNA3.1His-M联合免疫,可以提高免疫水平.     

沙眼衣原体主要外膜蛋白核酸疫苗诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答

目的构建沙眼衣原体主要外膜蛋白核酸疫苗,并观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫。方法将核酸疫苗(pcDNA3.1MOMP)或对照空质粒(pcDNA3.1)注射于4～6周龄小鼠后腿股四头肌,每次剂量为100mg。间隔2周加强免疫2次。末次免疫后,ELISA法测定脾淋巴细胞培养上清液中IFNγ及小鼠血清中抗MOMP水平;MTT法测定脾淋巴细胞特异性增殖反应。结果小鼠接种核酸疫苗后,能产生特异性抗体,第3次免疫后抗体最高滴度达1∶1024,培养上清液中IFNγ达(532.0±45.4)pg/mL;实验组小鼠脾淋巴细胞刺激指数为3.94±0.25,其抗原特异性反应明显高于对照组。结论沙眼衣原体主要外膜蛋白核酸疫苗能刺激机体产生特异的细胞免疫和体液免疫。     

SARS冠状病毒S蛋白C端片段基因的克隆及其DNA疫苗的免疫学研究

目的：构建抗原基因为SARS冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoY）S蛋白C端片段基因的DNA疫苗，采用肌注和滴鼻的方法接种小鼠后观察肌肉注射途径和黏膜途径免疫使机体产生免疫应答的情况。方法：将S蛋白C端片段克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），随之将重组质粒进行小鼠肌肉和黏膜免疫，定期检测外周血中抗SARS-CoV的病毒特异性抗体水平，流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化，免疫组化检测抗原表达分布，脾细胞增殖实验评价CTL效果。结果：疫苗注射后15天就能在血清中检测出病毒特异性抗体。随着时问的延续，抗体水平逐步升高，至30天后达到稳定，以CTL为主的CD8^＋T淋巴细胞的百分比含量增加极显著，引起强大的体液免疫和细胞免疫；疫苗滴鼻后45天可在鼻黏膜检测到抗原表达；而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答。结论：以S蛋白C端片段基因为抗原基因的DNA疫苗通过肌注和滴鼻能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答。     

人巨细胞病毒gB和pp150融合基因真核表达载体的构建及其免疫活性研究

目的 构建人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）糖蛋白（gB）和胞膜蛋白（pp150）的单基因及融合基因的真核表达载体并比较其免疫学活性,为研制HCMV核酸疫苗奠定实验基础.方法 PCR扩增HCMV gB及pp150并将其连接成融合基因,分别克隆至peDNA3.1（＋）真核表达载体;制备纳米粒DNA疫苗并免疫BALB/e小鼠,检测其体液免疫与细胞免疫应答.结果 成功制备了peDNA3.1（＋）-gB、peDNA3.1（＋）-pp150和peDNA3.1（＋）-gB-pp150纳米核酸疫苗;gB和gB-pp150核酸疫苗均能刺激小鼠产生较强的特异性抗体（P〈0.01）;pp150和gB-pp150核酸疫苗免疫组的小鼠脾细胞能产生较多的IFN-γ和较高的刺激指数.结论 HCMV gB单基因核酸疫苗能诱导较强的体液免疫应答,pp150单基因核酸疫苗则能诱导较强的细胞免疫应答;而gB-pp150的融合基因疫苗能诱导较强的体液免疫和细胞免疫应答.     

呼吸道合胞病毒G蛋白基因重组质粒诱导小鼠免疫保护性及机制研究

目的 构建编码呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因的重组质粒,观察其对RSV感染小鼠的保护性及特异性免疫效应,为研制安全有效的RSV新疫苗提供线索和实验依据.方法 利用基因重组方法构建含RSV G蛋白编码基因的重组质粒,测序和酶切鉴定,Western blot检测目的 基因经体外表达后的免疫原性.重组质粒免疫小鼠后以RSV感染,病毒滴定法检测肺组织标本中RSV滴度,HE染色法检查肺组织病理改变,ELISA检测血清抗体水平,双抗体夹心ELISA测定肺泡灌洗液(BALF)内Th1/Th2细胞因子表达量,流式细胞术检测BALF中T淋巴细胞亚群数量及活化状态.结果 成功构建了编码RSV G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G.Western blot证实目的 蛋白在体外具有免疫原性.被免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低,肺组织中未见明显的炎性细胞浸润.小鼠血清中产生较高滴度的抗RSV-G IgG.小鼠BALF细胞中CD4~+CD25~+T淋巴细胞比例显著增加,并且IFN-γ(Th1)、IL-4(Th2)两类细胞因子表达显示平衡.结论 编码RSV G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G能诱导产生CD4~+ CD25~+T细胞亚群,对小鼠具有明显的保护作用.     

幽门螺杆菌Lpp20核酸疫苗的构建及其免疫活性的初步研究

目的 构建幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Lpp20,并在HeLa细胞中进行表达.通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平.方法 用PCR法扩增Lpp20全基因,再将Lpp20基因克隆至pcDNA3.1(+)真核细胞表达载体构建pcDNA3.1(+)/Lpp20重组体,观察其在HeLa细胞中的表达.将核酸疫苗PcDNA3.1(+)/Lpp20、对照空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分组通过肌肉注射免疫6周龄C57BL/6小鼠.隔2周免疫一次,共免疫4次.间接ELISA法测定小鼠血清中抗Lpp20 IgG抗体水平,双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应.通过PCR法检测小鼠肌细胞中Lpp20基因的存在.结果 小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,6周后ELISA测定血清抗体A450值为0.74,效价为1:1024.核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显升高[(410.36±56.23)ps/ml],与空质粒组[(25.26±10.85)pg/ml]之间差异有统计学意义(P<0.01).脾淋巴细胞增殖反应测定,核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数(2.37±0.22)明显高于空质粒组(1.53±0.47)和PBS组(1.20±0.13),P<0.01.PCR检测Lpp20基因可在小鼠肌细胞中存在.结论 成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗,且其在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答.为进一步研究该疫苗的免疫保护作用提供实验依据.