慢性乙型肝炎患者ALT水平与HBV特异性CTL、非特异性CTL计数的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者丙氨酸转氦酶(ALT)水平与乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、非特异性CTL的关系.方法 148例CHB患者根据ALT水平分为3组:甲组35例,ALT≥2×正常值上限(ULN)-5×ULN(100～250 IU/L);乙组53例,ALT＞5×ULN～≤10×ULN(251～500 IU/L);丙组60例,ALT＞10×ULN(＞500 IU/L),用流式细胞仪检测非特异性CTL,对其中74例(甲组17例,乙组27例,丙组30例)人白细胞抗原(HLA)-A2阳性CHB患者检测HBV特异性CTL.比较三组的HBV特异性CTL、非特异性CTL、HBV DNA水平和HBeAg阳性率.结果 HBV特异性CTL:甲组[(0.42±0.10)%]高于乙组[(0.25±0.08)%],t=6.37,P＜0.01,乙组高于丙组[(0.17±0.004)%]t=5.14,P＜0.01.非特异性CTL:甲组[(15.01±3.01)%]低于乙组[(18.1±5.02)%],t=2.81,P＜0.01,乙组低于丙组[(21.5±6.11)%]t=3.07,P＜0.01.HBV DNA水平:甲组[(4.97±0.86)log10拷贝/m1]低于乙组[(5.92±0.92)log10拷贝/ml],t=4.87,P＜0.01,乙组低于丙组[(6.37±0.71)log10拷贝/ml]t=2.92,P＜0.01.HBeAg阳性:甲组15例(42.86%),低于乙组(32例,占60.38%),x2=2.59,P＞0.05,乙组低于丙组(41例,占68.33%),x2=0.788,P＞0.05,甲组低于丙组x2=5.929,P＜0.05.结论 CHB患者非特异性CTL越高,ALT水平越高[1],而HBV特异性CTL越低,HBV复制越强.     

乙型肝炎肝硬化患者病毒基因型与特异性、非特异性CTL的关系和意义

目的 探讨乙型肝炎肝硬化患者不同HBV基因型与外周血HBV特异性、非特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的关系和意义.方法 91例乙型肝炎肝硬化患者作HBV基因型检测,比较B、C基因型感染者之间HBV特异性、非特异性CTL的差别,并探讨其临床意义.结果 91例乙型肝炎肝硬化患者中,C基因型55例（60.44%）,B基因型35例（38.46%）,B、C混合型1例（1.1%）,C基因型人白细胞抗原（HLA）-A2阳性27例（49.09%）,HBV特异性CTL（0.18%±0.03%）,B基因型HLA-A2阳性18例（51.43%）,HBV特异性CTL（0.38%±0.04%）,高于C基因型,t=5.01,P＜0.01,非特异性CTL：C基因型（11.87%±1.50%）,B基因型（11.90%±1.51%）,t=0.14,P＞0.05.HBV DNA水平：C基因型[（6.01 ±0.81）log10拷贝/ml],高于B基因型[（5.01 ±0.54）log10拷贝/ml],t=5.01,P＜0.01,丙氨酸转氨酶（ALT）：C基因型（251.13 ±131.11）U/L,高于B基因型（121.25±63.21）U/L,t=3.61,P＜0.01,血清总胆红素（TBil 45.61 ±15.11）μmoL/L,高于B基因型（28.11 ±6.25）μmol/L,t=3.05,P＜0.01.结论 与乙型肝炎肝硬化B基因型感染者相比,C基因型感染者的HBV特异性CTL较低,导致HBV DNA水平较高,肝功能损害较重.     

阿德福韦酯对慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL的影响

目的 探讨阿德福韦酯对慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV特异性CTL的影响.方法 对HBV DNA阳性（HBV DNA≥1×104拷贝/ml）、ALT＞2×正常值上限（ULN）、人白细胞抗原（HLA）-A2阳性的CHB患者用阿德福韦酯（正大天睛药业公司生产）10 mg,口服,每日1次,3个月.用实时荧光定量PCR检测HBV DNA,流式细胞术检测HBV特异性CTL.结果 阿德福韦酯治疗3个月后,HBV特异性CTL（0.52±0.11）%高于治疗前（0.34±0.14）%,t=6.78 P＜0.01,HBV DNA阴转（＜1×103拷贝/ml）28例（62.22%）.17例未阴转的患者,HBV DNA水平治疗后3个月[（4.18±0.4）log10拷贝/ml]低于治疗前[（6.23±0.73）log10拷贝/ml]t=9.99,P＜0.01.结论 阿德福韦酯能提高CHB患者的HBV特异性细胞免疫功能.     

阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎HBeAg血清学转换与基因型、HBV特异性CTL的关系

目的 探讨阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎患者发生HBeAg血清学转换与HBV基因型、HBV特异性CTL的关系.方法 70例慢性乙型肝炎患者HBV DNA阳性（HBV DNA≥1×104拷贝/ml）,HBeAg阳性45例,其中B基因型23例（51.11%）,C基因型22例（48.89%）.ALT＞2×正常参考值上限（ULN）、人白细胞抗原（HLA）-A2阳性,用阿德福韦酯（正大天睛药业公司生产）10 mg,口服,每日1次.观察治疗12个月后HBeAg血清学转换与HBV基因型、HBV特异性CTL的关系.结果 阿德福韦酯治疗12个月后,HBV特异性CTL（0.68%±0.11%）高于治疗前（0.33%±0.11%）,t=8.36 P＜0.001,HBV DNA（3.01±0.2）log10拷贝/ml低于治疗前[（6.27 ±0.70）log10拷贝/ml]t=12.63 P＜0.001,HBV DNA阴转（＜500拷贝/ml）43例（61.43%）.HBeAg阳性45例中发生HBeAg转阴13例（28.89%）,HBeAg血清学转换8例（17.78%）,HBeAg血清学转换者HBV特异性CTL（0.86 ±0.05%）高于无HBeAg血清学转换者（37例,82.22%）的HBV特异性CTL（0.61%±0.07%）,t=7.88,P＜0.001.HBeAg血清学转换8例中,B基因型7例（占B基因型30.43%）,C基因型1例（占C基因型4.55%）,x2=5.15,P＜0.05.结论 阿德福韦酯能提高CHB患者的HBV特异性细胞免疫功能,治疗后HBeAg血清学转换的发生与HBV特异性CTL水平升高有关,并可能与基因型有关.     

慢性乙型肝炎患者HBV特异性细胞毒性T细胞PD-1的表达研究

目的 检测慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中HBV特异性CD8 细胞毒性T淋巴细胞表面细胞程序性死亡受体1(programmed cell death 1,PD-1)的表达情况.方法 采集慢性乙型肝炎患者外周血,直接离体情况下利用MHC-I-肽-五聚体技术标定HBV表位特异性细胞毒性T淋巴细胞以及荧光抗体标记细胞表面PD-1分子,经流式细胞仪检测分析.结果 在慢性乙型肝炎患者,HBV核心抗原18-27特异性CTL表达PD-1上调,达(79.0±12.5)%,显著高于总CD8 T细胞(27.7±14.8)%,以及CMV特异性CTL(20.6±5.9)%.结论 慢性乙肝患者HBV特异性CTL高表达PD-1分子,可能与慢性乙肝患者HBV特异性CTL功能低下密切相关.     

乙型肝炎肝硬化患者血清HBV DNA水平与细胞毒性T淋巴细胞的关系和意义

目的 探讨乙型肝炎肝硬化患者血清HBV DNA水平与HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、非特异性CTL的关系和意义.方法 120例HBV DNA阳性、HBeAg阳性、人白细胞抗原（HLA）-A2阳性的乙型肝炎肝硬化患者,用实时荧光定量PCR检测HBV DNA,流式细胞术检测HBV特异性CTL、非特异性CTL,并作肝功能检测.将120例乙型肝炎肝硬化患者根据HBV DNA水平分为甲、乙两组,甲组68例,HBV DNA水平为3～4 log10拷贝/ml,乙组52例,HBV DNA水平为5～6log10拷贝/ml,对两组患者的HBV特异性CTL、非特异性CTL和肝功能进行比较.结果 甲组HBVDNA水平为（3.68±0.19）log10拷贝/ml,乙组HBV DNA水平为（5.97±0.32）log10拷贝/ml,t=22.98,P＜0.001,甲组HBV特异性CTL（0.33%±0.04%）,高于乙组（0.11%±0.01%）,t=9.61,P＜0.001,甲组非特异性CTL为11.99%±1.51%,乙组为11.91%±1.61%,t=0.16,P＞0.05.结论 乙型肝炎肝硬化患者血清HBV DNA水平与HBV特异性CTL有关：HBV DNA水平高者,HBV特异性CTL低,由于HBV DNA水平高,肝功能损害相对较重.HBV DNA水平低者,HBV特异性CTL高,预示抗病毒疗效相对较好.     

慢性乙型肝炎患者HBV C、B基因型与特异性细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1表达的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV C、B基因型与HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表面程序性死亡受体-1（PD-1）表达的关系和意义.方法 共研究CHB患者71例,人白细胞抗原（HLA）-A2阳性,HBV DNA ＞103拷贝/ml,其中C基因型34例（47.89％）,B基因型36例（50.70％）.比较C、B基因型感染者外周血HBV特异性CTL表面PD-1的表达水平、HBV特异性CTL水平、HBV DNA水平、ALT和TBil的水平.结果 CHB C基因型感染者的HBV特异性CTL表面PD-1的表达水平（37.30±3.05％）高于B基因型感染者（26.19±3.06％）,t=15.47,P＜0.001,HBV特异性CTL水平（0.25±0.03％）低于B基因型感染者（0.45±0.13％）,t=21.54,P＜0.001,HBV DNA水平（6.75±0.77lo910拷贝/ml）高于B基因型感染者（4.96±1.12 log10拷贝/ml）,t=7.93,P＜0.001,ALT水平（487.39±87.36IU/L）高于B基因型感染者（235.25±90.91IU/L）,t=12.32,P＜0.001,TBil水平（49.73±6.45）高于B基因型感染者（28.48±5.89％）,t=9.01,P＜0.001.结论 CHB C基因型感染者外周血HBV特异性CTL表面PD-1表达水平高于B基因型感染者,导致C基因型感染者HBV特异性CTL水平低于B基因型感染者,HBV DNA水平高于B基因型感染者,因此,肝功能损害比B基因型感染者重.     

慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs的KIR表达研究

目的检测慢性乙型肝炎患者外周血中HBV特异性CTL细胞表面杀伤细胞抑制性受体（KIR）的表达情况。方法利用MHC-Ⅰ-肽-五聚体（pentamer）技术结合流式三色分析技术，直接离体情况下检测（direct ex vivo）慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL细胞表面KIR的表达情况。结果在慢性乙型肝炎患者，KIR阳性的CD8^＋ T细胞明显增加；KIR阳性的HBcAg（18-27）特异性CTL、HBeAg（335-343）特异性CTL、HBp（575-583）特异性CTL的百分比分别为12％、20％、35％。结论慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL表达KIR，这可能与慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL功能低下密切相关。     

苦参素对慢性乙型肝炎患者特异性、非特异性细胞免疫影响的研究

目的 探讨苦参素对慢性乙型肝炎(CHB)患者特异性、非特异性细胞免疫的影响.方法 74例CHB患者随机分为两组,治疗组36例,用苦参素葡萄糖注射液600 mg,静脉滴注,每日1次,1个月后改为苦参素胶囊200 mg,口服,每日 3次,2个月,水飞蓟宾葡甲胺片200 mg,口服,每日 3次,3个月.对照组38例,只用水飞蓟宾葡甲胺片,用法、用量同治疗组.比较两组患者的HBV特异性细胞毒性T细胞(CTL)、非特异性CTL、T细胞亚群、Th1、Th2水平的变化和HBV DNA、HBeAg阴转率.结果 治疗组苦参素治疗3个月后,HBV特异性CTL高于治疗前(P<0.01),也高于对照组治疗后(P<0.05),非特异性CTL高于治疗前(P<0.05),也高于对照组治疗后(P<0.01),CD4+高于治疗前(P<0.05),也高于对照组治疗后(P<0.01),Th1高于治疗前(P<0.05),也高于对照组治疗后(P<0.01),HBV DNA阴转和HBeAg阴转高于对照组(P<0.01).结论 苦参素能提高CHB患者的特异性、非特异性细胞免疫功能,是苦参素清除或抑制CHB患者HBV的机制之一.     

慢性乙肝患者外周血CD4CD25FOXP3 Tregs及HBV抗原特异性CTLs的检测和分析

目的: 检测慢性乙肝(CHB)患者外周血中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T淋巴细胞(Treg细胞)和乙肝病毒(HBV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的表达及意义。方法: 收集28例CHB患者和15例健康人外周血单个核细胞标本,运用流式细胞仪对Treg细胞亚群进行定量分析,同时采用酶联免疫斑点法检测HBV抗原特异性CTLs,并结合丙氨酸氨基转移酶(ALT)和 HBV DNA的临床情况进行分析。结果: CHB组CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Treg细胞的频率显著高于健康对照组 (3.14%±0.97% vs 1.95%±0.68%,P＜0.05);HBV抗原特异性CTL斑点计数为阳性(19.28±3.85)。CHB组Treg的频率与乙肝病毒载量呈正相关(r=0.831, P＜0.01),与HBV特异性CTL斑点计数值呈负相关(r＝-0.540,P＜0.01)。结论: CHB患者外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3^＋Treg细胞表达升高并与病毒载量相关,而与HBV反应的CTLs数量呈负相关,提示Treg细胞可通过抑制细胞免疫反应影响病毒清除。     

慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1表达的关系和意义

目的 探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者血清HBV DNA水平与HBV特异性CTL表面程序性死亡受体-1（PD-1）表达的关系和意义.方法 将133例CHB患者根据血清HBV DNA水平分为甲、乙两组,甲组70例（52.63％）,HBV DNA水平为104～105拷贝/ml,乙组63例（47.37％）,HBVDNA水平分107 ～ 108拷贝/ml,对两组患者作HBV特异性CTL、非特异性CTL,HBV特异性CTL表面PD-1表达和肝功能的比较.结果 甲组HBV DNA水平为（5.03±1.01）log10拷贝/ml,低于乙组（7.59±0.99） log10拷贝/ml,t=11.23,P＜0.01,HBV特异性CTL表面PD-1表达（26.32±2.56）％,低于乙组（39.35 ±2.86）％,t=18.69,P＜0.01,HBV特异性CTL （0.37±0.02）％,高于乙组（0.22±0.02）％,t=25.80,P＜0.01,非特异性CTL（16.26 ±2.17）％,低于乙组（19.94±2.47）％,t=3.19,P＜0.01,ALT （259.16 ±85.11） U/L,低于乙组（501.16±86.15） U/L,t=15.10,P＜0.01,TBil（27.99±6.13）μmol/L,低于乙组（44.86±9.51） μmol/L,t=3.92,P＜0.01.结论 CHB患者HBV DNA水平低者,HBV特异性CTL表面PD-1表达也低,HBV特异性CTL水平高,HBV DNA水平高者,HBV特异性CTL表面PD-1表达也高,导致HBV特异性CTL水平降低,并启动非特异性CTL,引起肝功能损害加重.     

慢性乙型肝炎抗病毒治疗后病毒学应答与特异性细胞免疫的关系

目的探讨阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎（CHB）患者病毒学应答与HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的关系。方法51例CHB患者,HBVDNA阳性（HBVDNA≥I×10^4拷贝／ml,HBeAg阳性32例（62．75％）、丙氨酸转氨酶（ALT）〉2×正常值上限（ULN）、人白细胞抗原（HLA）-A2阳性,用阿德福韦酯10mg,口服,每日1次。观察治疗72周后HBVDNA转阴和HBeAg血清学转换与HBV特异性CTL的关系。结果阿德福韦酯治疗72周后,HBVDNA转阴（〈500拷贝／m1）39例（76．47％）,其HBV特异性CTL（0．81％±0．06％）,高于12例（23．53％）的HBVDNA未转阴者（0．66％±0．06％）,t=7．93,P〈0．01,IqBeAg血清学转换8例（25％）,其HBV特异性CTL（0．97％±0．07％）,高于24例（75％）的无HBeAg血清学转换者（0．67％±0．07％）,t=7．61,P〈0．01。结论阿德福韦酯治疗CHB患者病毒学应答和血清学应答与HBV特异性CTL水平升高有关。     

苦参素联合甘草酸二铵对慢性乙型肝炎患者细胞免疫影响的研究

目的探讨苦参素联合甘草酸二铵对慢性乙型肝炎（CHB）患者特异性细胞免疫的影响。方法63例CHB患者随机分为2组,苦参素联合甘草酸二铵组（联合组）32例,用苦参素葡萄糖注射液600mg,静脉滴注,每日1次,1个月后改为苦参素胶囊200mg口服,每日3次,2个月。甘草酸二铵注射液150mg加入10％葡萄糖注射液250ml中静脉滴注,每日1次,1个月后改为甘草酸二铵胶囊150mg口服,每日3次,2个月;苦参素组（单用组）31例,只用苦参素,用法用量同治疗组。比较两组患者的HBV特异性细胞毒T细胞（CTL）、T细胞亚群、Th1、Th2水平的变化和HBV-DNA、HBeAg阴转率。结果联合组治疗3个月后,HBV特异性CTL、CD4＋、Th1高于治疗前,也高于单用组治疗后（P〈0．01）。HBV-DNA和HBeAg阴转率两组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论苦参素联合甘草酸二铵能进一步提高CHB患者的HBV特异性CTL、CD4＋和Th1水平。     

慢性乙肝患者抗病毒治疗前后特异性T细胞免疫观察

目的 了解抗病毒治疗前后慢性乙型肝炎患者特异性T淋巴细胞对HBV抗原蛋白免疫应答的变化及其特征.方法 收集17例慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前及治疗后1个月、3个月的外周血单个核细胞,以HBV特异性抗原蛋白HBsAg、HBcAg和HBeAg为刺激物,酶联免疫斑点法检测其分泌IFN-γ产生斑点的情况.同时对血清HBV DNA和HBsAg、HBeAg等病毒学指标及谷丙转氨酶(ALT)等生化学指标进行榆测并分析其相关性.结果 治疗前,所有患者ALT、总胆红素(TBiL)均高于正常上限,17例患者HBV DNA均大于104拷贝/ml;治疗1个月后,ALT复常率为35.3%,9例患者HBV DNA降为检测下限以下;治疗3个月后,ALT复常率为58.8%,有11例患者HBV DNA降为检测下限以下.抗病毒治疗前、治疗1个月、治疗3个月患者针对HBV特异性蛋白总的T细胞反应阳性率分别为64.7%、76.5%和82.4%,其差别无统计学意义.不论治疗前后,患者对HBeAg的特异性T细胞反应频率和平均反应强度最高;治疗后,对3种蛋白的特异性T细胞反应频率和平均反应强度各有不同程度的增加,其中以对HBcAg蛋白的平均反应强度的增强最明显,治疗前和治疗3个月,治疗1个月和治疗3个月之间的差别都有统计学意义.患者对HBcAg蛋白的特异性T细胞反应平均反应强度与病毒载量有明娃负相关,与血清ALT无明显相关性.结论 本研究结果提示抗病毒治疗后,患者对HBV的特异性T细胞免疫应答有所增强,这种改变可能与HBV DNA的下降有关,检测HBV特异性T细胞反应对丁解患者的免疫状态有重要的意义.

Abstract：

Objective To explore the responses of antigen-specific T cells stimulated by hepatitis B virus(HBV)-specific proteins in chronic hepatitis B patients accepting antiviral therapy. Methods Seventeen patients with chronic hepatitis B (CHB) accepting antiviral therapy were included in this study. The peripheral blood monocular cell ( PBMC) were separated from the whole blood collected at the three different time of before and one and three months after accepting antiviral therapy. ELISPOT assay was used to detect the frequency and strength of secreting IFN-γ cells of PBMC stimulated by HBsAg, HBcAg and HBeAg. HBV virus loading, HBsAg, HBeAg, ALT and AST in serum were detected at the same time. Results After three months therapy, ALT, TBiL were improved in all patients, and HBV DNA level were dropped and undetectable in 11 cases. The rates of T cell response in patients to HBV specific proteins were 64. 7% , 76. 5% and 82. 4% at the time of before and one and three months after accepting antiviral therapy, respectively. The frequency of responses of antigen-specific T cells stimulated by HBcAg was higher than that stimulated by HBsAg or HBeAg, and the frequency was enhanced after antiviral therapy. The average response magnitude was expressed as spot forming cells (SFC) per million input cells. SFC of T cell responses to HBcAg was also higher than to HBsAg or HBeAg. There was no significant difference in SFC of T cell responses to HBsAg or HBeAg at the time of before and after antiviral therapy, but there were significant difference in SFC of T cell responses to HBcAg at the time of before and after antiviral therapy. SFC of T cell responses to HBcAg was negatively associated with HBV DNA, and no associated with level of ALT in serum. Conclusion The responses of antigen-specific T cells were improved in CHB patients accepting antiviral therapy which associated with the decrease of HBV DNA. It suggested to investigate HBV specific T cell responses was important.