慢性乙型肝炎患者外周血淋巴及单核细胞表面B7-H1表达研究

目的 探讨B7家族共刺激分子B7-H1在慢性乙型病毒性肝炎(乙肝)患者外周血淋巴细胞及单核细胞表面的表达情况.方法 利用荧光抗体标记结合多色流式技术,检测慢性乙肝患者外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞群体表面B7-H1分子的表达.结果 在慢性乙肝患者,T、B淋巴细胞表面B7-H1低表达,与健康对照无差异;单核细胞表面B7-H1的表达率为(19.17±11.64)%,显著高于健康对照的(7.30±5.49)%(P＜0.01),且B7-H1的表达与患者血浆ALT水平成正相关(r=0.423,P＜0.01).结论 慢性乙肝患者外周血T、B淋巴细胞表面B7-H1低表达,单核细胞B7-H1表达上调,且与ALT水平正相关,提示B7-H1可能与乙肝病毒感染慢性化相关.     

HBV颗粒的纯化及生物学活性鉴定

目的优化纯化HBV患者血清中HBV颗粒的技术方法。方法在蔗糖介质中,分别以100 000 g和70 000 g进行不连续蔗糖梯度(60%,45%,35%,25%,15%)离心5 h,离心后,分段吸取6份收集液,PCR荧光定量检测各组分HBV滴度;收集前5份收集液进行超滤,去蔗糖,PCR荧光定量检测HBV超滤液;电镜观察70 000g纯化后的HBV超微形态;70000 g纯化后的HBV颗粒感染树鼩肝细胞,检验70 000 g纯化后的HBV感染活性。结果100 000 g离心造成大量HBV在离心过程中损失,收获率只有21%,70 000g离心不仅降低了离心中的病毒损失,而且可有效对HBV和血清进行分离,收获率达到78%以上,较100 000g还提高3.7倍多。电镜可观察到纯化后病毒液中有大量的病毒颗粒;纯化后的HBV颗粒感染活性良好,可有效感染原代树鼩肝细胞。结论70 000 g不连续蔗糖梯度离心可有效分离纯化HBV病毒,较100 000 g收获率明显提高,纯化后的HBV不但具有典型的HBV特征,还具有良好的生物学感染活性。     

应用CompBeads建立流式多色分析补偿的方法

目的 探讨一种快速简便的流式细胞仪多色分析时的关键参数(荧光补偿)设置方法.方法 以BD CompBeads、实验样品(本实验为慢性乙型肝炎患者外周全血)分别与单克隆荧光抗体染色,结合流式细胞仪Diva软件调节细胞仪光电倍增管(PMT)电压,计算建立荧光补偿矩阵.同时以获得的参数设置仪器,运行慢性乙型肝炎患者外周全血6色荧光标记实验样品.结果 用CompBeads建立的补偿参数稳定可靠,能有效消除荧光光谱之间的交叉重叠.6色荧光标记实验样品检测的结果,可见细胞亚群分布清晰,荧光强度比例表达适当,与通常采用的实验样品单染色方法补偿结果一致(P>0.05).结论 该方法能快速方便进行流式细胞仪检测时仪器参数最佳化设置调整,在多色免疫标记流式检测中有较大的应用价值.     

青藤碱促进树突状细胞分化抑制其成熟

目的 探讨青藤碱对树突状细胞(Dendritic cell,DC)体外分化发育、成熟、抗原递呈及刺激T细胞活化能力的影响.方法 DC体外培养时,青藤碱处理,观察细胞生长情况,流式检测细胞表型及抗原内吞能力,混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞活化的能力,E(I)ISA检测细胞因子分泌.结果 与对照组相比,青藤碱处理DCCD1a表达上调而CD14下调,IL-12分泌减少,共刺激分子表达减少,同种T细胞刺激活性降低.结论 合适剂量的青藤碱能刺激单核细胞分化为不成熟DC但能抑制其进一步成熟.     

补体C5b-9复合物促进树突状细胞成熟

探讨补体C5b-9复合物对树突状细胞成熟及免疫学功能的影响。rhGM-CSF+rhIL-4体外诱导单核细胞分化为不成熟树突状细胞,体外于不成熟树突状细胞表面用补体蛋白纯品组装CSb-9,37℃,5%CO_2温育96 h,流式分析细胞表型及抗原捕获能力;与同种异体CD4~+和CD8~+T细胞共培养检测其免疫刺激功能;ELISA检测细胞因子分泌。结果显示,亚溶解型C5b-9处理DC表面标志CD83、HLA、CD80、CD86、B7-H1、B7-H3、B7-H4以及BTLA等表达上调;DC分泌IL-12及TNF-α上调,抗原捕获能力降低;C5b-9处理DC刺激CD4~+T细胞活化及分泌IFN-γ、IL-2能力增强。结论:补体C5b-9复合物可以促进树突状细胞成熟,衔接天然免疫和特异性免疫。     

慢性乙型肝炎患者HBV特异性细胞毒性T细胞PD-1的表达研究

目的 检测慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中HBV特异性CD8 细胞毒性T淋巴细胞表面细胞程序性死亡受体1(programmed cell death 1,PD-1)的表达情况.方法 采集慢性乙型肝炎患者外周血,直接离体情况下利用MHC-I-肽-五聚体技术标定HBV表位特异性细胞毒性T淋巴细胞以及荧光抗体标记细胞表面PD-1分子,经流式细胞仪检测分析.结果 在慢性乙型肝炎患者,HBV核心抗原18-27特异性CTL表达PD-1上调,达(79.0±12.5)%,显著高于总CD8 T细胞(27.7±14.8)%,以及CMV特异性CTL(20.6±5.9)%.结论 慢性乙肝患者HBV特异性CTL高表达PD-1分子,可能与慢性乙肝患者HBV特异性CTL功能低下密切相关.     

LEF-1协助TCF-1决定蛋白免疫应答中滤泡辅助T细胞的功能

目的 探讨在蛋白免疫应答中转录因子TCF-1与LEF-1在滤泡辅助T细胞的分化与功能中的地位。方法 对他莫昔芬诱导的条件敲除Tcf7与Lef1小鼠采用NP-KLH联合铝佐剂免疫或者NP-CGG联合完全弗氏佐剂免疫，分析应答过程中滤泡辅助T细胞的分化与功能，检测蛋白免疫应答中T细胞与B细胞TCF-1与LEF-1的表达量，并用脾脏嵌合小鼠模型验证TCF-1与LEF-1对于滤泡辅助T细胞功能的重要性。结果 Tcf7与Lef1敲除小鼠的滤泡辅助T细胞分化是正常的，而B细胞应答严重缺陷。同时，Tcf7敲除小鼠的B细胞应答也是缺陷的，而Lef1敲除小鼠的B细胞应答是完整的；TCF-1与LEF-1在滤泡辅助T细胞中大量表达，而在B细胞中不表达；脾脏嵌合小鼠模型提示，在有正常滤泡辅助T细胞的帮助下，B细胞中TCF-1与LEF-1的缺失不会导致B细胞应答缺陷。结论 在蛋白免疫应答中，TCF-1与LEF-1对于滤泡辅助T细胞的分化是不重要的，LEF-1协助TCF-1通过影响滤泡辅助T细胞的功能而影响B细胞应答。