Pokemon表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建Pokemon表达慢病毒载体。方法通过PCR扩增Pokemon cDNA,将Pokemon cDNA连接于GV165载体,经测序确认后,将GV165/Pokemon与pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染至293T细胞中,收获病毒,通过Real time PCR测定滴度;将Pokemon表达慢病毒载体侵染293T细胞通过免疫荧光和Western blot检测Pokemon表达慢病毒载体的转染效率和Pokemon的表达能力。结果在感染Pokemon慢病毒载体293T细胞中能检查到Pokemon-GFP融合蛋白的表达。结论成功构建表达Pokemon的慢病毒载体。     

SOX17过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建

目的：构建性别决定区Y盒17 (SOX17)过表达慢病毒载体,使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。方法：在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列,将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接,构建GV492-SOX17过表达重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,筛选携带GV492-SOX17过表达重组质粒的阳性菌,克隆后测序。将GV492空载质粒和GV492-SOX17过表达重组质粒分别转染至人胚肾HEK 293T细胞中,转染48 h后收集GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将PC12细胞分为空白组、GV492对照组和GV492-SOX17组,空白组不作处理,GV492对照组和GV492-SOX17组分别采用相应慢病毒感染细胞(感染复数=100),10 mg·L^-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的PC12细胞,荧光显微镜观察各组PC12细胞生长状态及绿色荧光表达情况。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组PC12细胞中SOX17 mRN...     

重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础.方法 设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析.MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度.结果 成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E+8 TU/mL.结论 本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础.     

脂肪干细胞中慢病毒-血管内皮生长因子165过表达的研究

【摘要】背景与目的：目前,越来越多的研究探讨干细胞成为基因治疗载体的最可能性,但是有关于脂肪干细胞的研究还很少,因此我们拟构建慢病毒-VEGF165的过表达载体并转染脂肪组织来源的干细胞以产生能用于基因治疗的种子细胞。 方法：将克隆EHS1001-6895048 5313912通过PCR方法突变成VEGF165的转录本片段(NM_001025368)。采用三质粒系统（pGC-FU、pHelp1.0和pHelp2.0）包装过表达慢病毒载体。载体构建成功并行滴度测定后转染ADSCs。使用免疫荧光、ELISA和western blot分析鉴定VEGF165在ADSCs中的表达。 结果：使用DNA测序及将质粒转染293T细胞后的表达检测证明所构建的载体为VEGF165与GFP融合表达载体。RT-qPCR检测后计算得到的病毒滴度达到2×108TU/ml。免疫荧光证实大约95%的ADSCs能表达绿色荧光蛋白,ELISA检测出在转染VEGF165后的ADSCs培养基里VEGF浓度为850.86～1202.13pg/ml(平均 923±31.22pg/ml)而在只转染GFP的ADSCs培养基里并不能检测到(p<0.001),并且这一结果也得到western blot检测结果的证实。 结论：本研究通过慢病毒- VEGF165转染ADSCs获得稳定表达VEGF165的脂肪组织来源干细胞为广泛地进行血管再生研究,特别是糖尿病性勃起障碍奠定基础。     

一种活性缺陷型小鼠端粒酶催化亚基过表达慢病毒载体的构建及功能初步测定

目的:构建含活性缺陷型小鼠端粒酶催化亚基(去除氨基酸702~712的mTERT,命名为mTERTΔ)基因的慢病毒载体,检测其表达和功能?方法:从先前构建的表达mTERT全长的pDC315-EGFP-mTERT质粒中,通过缺失突变PCR扩增小鼠mTERTΔ基因,构建真核表达载体GV287-EGFP/mTERTΔ?鉴定正确后将目的基因克隆入慢病毒载体pGC-LV,得重组载体pGC-LV/mTERTΔ-EGFP,采用Lipofectamine2000将其转染293T细胞,包装慢病毒颗粒LV-mTERTΔ-EGFP后感染神经干细胞和原代神经元,TRAP-PCR方法检测端粒酶活性,荧光显微镜观察目的片段表达和细胞增殖情况?结果:成功构建TERTΔ基因片段,测序证明重组慢病毒载体pGC-LV/mTERTΔ-EGFP构建成功?包装慢病毒颗粒LV-mTERTΔ-EGFP可以感染神经干细胞和神经元,端粒酶活性测试证明目的蛋白的端粒酶催化活性缺陷,抑制神经干细胞增殖,抑制内源性mTERT功能?结论:慢病毒载体LV-mTERT-EGFP构建成功,可以表达无活性mTERT片段?     

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a（mWnt3a）与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达。方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组（GFP-NSCs组）和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照。免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs 进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达。结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108 TU/mL。Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性。Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7 d, Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组（P<0.01）。结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs。     

慢病毒介导RNA干扰沉默Fas 基因在脐带间充质干细胞中的表达

目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,构建Fas基因的siRNA慢病毒表达载体,建立Fas基因稳定干扰的人脐带间充质
干细胞（UC-MSCs）株,为下一步使用低表达Fas 基因的UC-MSCs治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法以人Fas 基因
mRNA序列作为干扰靶点,设计4组靶向Fas的shRNA序列,合成寡核苷酸,与经过BamHI、EcoRI双酶切后的LV3载体连接获
得重组慢病毒,通过感染293T 细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养人UC-MSCs,使用包装好的慢病毒感染
UC-MSCs,应用Real time- PCR和Western blotting检测感染后细胞中Fas mRNA及蛋白的表达情况。结果经酶切以及基因测
序鉴定证明慢病毒载体构建成功,病毒悬液滴度为3×108 TU/ml。Real time-PCR和Western blotting结果显示干扰组细胞的Fas
表达水平较对照组显著降低。结论慢病毒介导的SiRNA能有效沉默UC-MSCs中Fas基因的表达。
     

HIF-1α基因慢病毒载体的构建和鉴定

[目的]构建带有大鼠HIF-1α基因的慢病毒表达载体,并进行病毒颗粒的包装与对293T的转染.[方法]从pEGFP-N1-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将目的基因与pLenti6.3-MCS-RES2-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,并用磷酸钙转染法将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,48h后收集上清液并过滤,按不同感染复数感染293T细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度和感染效率.[结果]构建了共表达HIF-1α基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,经PCR及测序结果证实,并对其成功包装出慢病毒,病毒滴度为4×106TU/ml.[结论]成功构建出HIF-1α基因重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP并能有效的包装出慢病毒.     

慢病毒载体介导CG RP基因体外转染及对M SC生物学特性的影响

目的：探讨慢病毒载体介导降钙素基因相关肽（CGRP）基因体外转染间充质干细胞（MSC）及其对MSC生物学特性的影响。方法大鼠MSC进行分离、培养及鉴定。CGRP重组慢病毒转染MSC后,采用荧光显微镜和流式细胞技术测定其转染率。实时定量PCR、免疫荧光细胞化学及ELISA法检测MSC中CGRP的表达。慢病毒转染后通过MTT、β‐半乳糖苷酶染色和诱导分化评价MSC的增殖、衰老及分化能力。结果慢病毒载体介导CGRP基因转染 MSC后48 h可稳定表达,MOI＝30时,转染率达80％以上。与MSC组和空载病毒转染（MSC‐EGFP组）比较,CGRP修饰的MSC（MSC‐CGRP组）中CGRP的mR‐NA和蛋白表达水平增高（均 P＜0．01）。MTT、β‐半乳糖苷酶染色和诱导分化结果显示,病毒转染后对MSC增殖、衰老及向内皮分化基本没有影响。结论 MSC是一种理想的基因载体细胞,可作为CGRP基因转染的靶细胞用于基因治疗,为后续体内、体外实验奠定基础。     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

p38丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用

目的构建p38丝裂原激活蛋白激酶基因(MAPK)重组慢病毒载体并建立表达外源性p38基因的人前列腺癌稳定细胞株。方法采用限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接等方法,将EGFP/p38融合基因插入慢病毒载体pTYF-EF1α-IRES-EGFP中,构建启动子EF1α调控的EGFP/p38共表达慢病毒载体pTYF-EF1α-EGFP/p38,经酶切鉴定后,利用慢病毒三质粒系统,通过脂质体法转染包装细胞HEK 293T细胞,收集病毒上清后转导人前列腺癌DU145细胞株,经有限稀释法筛选重组EGFP/p38稳定细胞株,用Western blotting检测细胞总p38的表达,用计数法绘制细胞的生长曲线。结果经酶切鉴定,成功构建EGFP/p38重组慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为4.7×106 TU/ml,利用此病毒悬液感染DU145细胞,成功筛选到EGFP/p38稳定表达细胞株,Western blotting显示该细胞株能稳定表达外源性EGFP/p38融合蛋白,这种过表达p38的细胞株的生长速度明显低于对照组。结论成功构建p38 MAPK重组慢病毒载体并建立了表达外源性p38 MAPK基因的稳定细胞株EGFP/p38-DU145,细胞内p38过表达能够抑制DU145细胞的增殖。     

人Runx3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Runx3基因重组慢病毒载体。方法 PCR扩增Runx3基因,应用In-Fusion技术将Runx3基因PCR扩增产物交换进入线性化慢病毒载体pGC-FU以构建重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。对长出的阳性克隆进行PCR鉴定,并进行测序和比对分析。将构建成功的重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3与包装质粒pHelper 1.0、包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞进行病毒包装。荧光显微镜下观察重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3转染293T细胞后细胞内绿色荧光表达情况。Western blot检测Runx3与EGFP融合蛋白表达情况。实时定量PCR测定病毒滴度。结果重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3经测序和比对分析证实目的基因序列正确。三质粒共转染293T细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光。Western blot证实Runx3与EGFP融合蛋白在293T细胞内稳定表达。浓缩病毒后测定滴度为2.0×108TU/ml。结论成功构建携带人Runx3基因的重组慢病毒载体pGC-FU-Runx3,为进一步研究Runx3过表达对慢性乙型肝炎患者外周血Th细胞分化的影响奠定基础。     

精氨酸甲基转移酶CARM1 shRNA慢病毒表达质粒的构建及稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系的建立

目的 构建慢病毒表达小鼠CARM1基因shRNA的质粒,观察其在小鼠畸胎瘤P19细胞中对CARM1的表达抑制效率.验证CARM1 shRNA慢病毒表达质粒,进一步筛选得到稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系.方法 设计并且合成针对小鼠CARM1 mRNA不同部位的4组shRNA序列,以Age Ⅰ和EcoR Ⅰ克隆入pLKO.1慢病毒载体中,得到含shRNA的慢病毒表达质粒.氨苄青霉素筛选后,DNA测序鉴定结果.鉴定正确的质粒大量制备后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共同转染HEK293T细胞,包装得到具有感染能力的慢病毒.将含病毒的培养基上清感染P19细胞后,经嘌呤霉素筛选获得CARM1稳定敲低的P19细胞系,并用Western blot法和实时荧光定量PCR进行鉴定.结果 测序鉴定表明4组CARM1 shRNA慢病毒表达质粒构建成功.Western blot法检测和实时荧光定量PCR分析结果显示4组CARM1 shRNA慢病毒表达载体中的2组可有效地抑制小鼠畸胎瘤P19细胞中CARM1基因的表达,即pLKO.1/CARM1 shRNA2、pLKO.1/CARM1 shRNA3有明显的抑制效果.结论 成功构建了针对CARM1基因的shRNA的慢病毒表达质粒并筛选得到稳定敲低CARM1表达的P19细胞系,为进一步研究CARM1基因的功能奠定了基础.     

乙肝病毒X基因慢病毒载体的构建和鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白的重组慢病毒载体pRRLsincPPT-hPGK-X-IRES-eGFP-WPRE(pRRL-X),并感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,以验证其在体外的感染效率.方法 采用PCR技术扩增出HBV X基因的DNA片段,用IN-Fusion技术构建表达载体pRRL-X并鉴定,j...     

VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的构建VEGF基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组（MHCC97-200）、阴性对照组（MHCC97-NEGA）和空白对照组（MHCC97-空白）中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

SOX9基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建SOX9基因的慢病毒载体并使其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中表达.方法 通过RT-PCR获得人SOX9基因编码区(CDS)片段,将该片段克隆入质粒Pwpxl-MOD2中产生Pwpxl-MOD2/SOX9,将Pwpxl-MOD2/SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染293T细胞,获得携带目的基因SOX9基因的重组病毒.同时共转染Pwpxl-MOD2,pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G进另一组293T细胞包装产生空载体慢病毒作为阴性对照.包装好的慢病毒体外感染MSCs,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫印迹检测SOX9的表达;四甲基噻唑蓝(MTT)法测定慢病毒对细胞增殖能力的影响.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实慢病毒载体质粒Pwpxl-MOD中插入片段为基因SOX9.病毒感染MSCs后,经RT-PCR法和免疫印迹证实SOX9基因在MSCs中表达.MTT法检测示慢病毒感染对骨髓间克质干细胞的生长未产生显著影响.结论 成功构建SOX9基因的慢病毒载体并感染骨髓间充质干细胞后能够稳定表达SOX9.为研究椎间盘退变的基因及生物学治疗提供了实验依据.     

连环蛋白p120 shRNA重组慢病毒载体构建及鉴定

目的构建连环蛋白p120特异性shRNA重组慢病毒载体,感染胰腺癌PANC-1细胞,鉴定干扰效果。方法针对p120ctn mRNA设计合成3对shRNA序列,连接入酶切线性化的慢病毒载体pGCSIL-GFP,PCR鉴定及测序正确后与构建成功的含p120ctn基因的载体pGC-FU-p120ctn-3FLAG共转染293T细胞,蛋白质印迹分析筛选有效shRNA序列,包装慢病毒,测定病毒滴度。重组慢病毒感染胰腺癌PANC-1细胞,实时定量PCR及蛋白质印迹分析鉴定干扰效果。结果 PCR及测序证实成功构建出p120ctn-shRNA-LV慢病毒载体,病毒滴度达到3×109TU/ml。重组慢病毒感染PANC-1细胞后,实时定量PCR提示PANC-1细胞p120ctn mRNA表达下降82.6%(P0.05),蛋白质印迹分析提示p120ctn蛋白表达较转染前显著下降。结论成功构建出p120ctn基因shRNA慢病毒载体,为进一步研究p120ctn在胰腺癌浸润及转移中的作用奠定了基础。     

WWOX基因慢病毒载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的：构建及鉴定WWOX基因慢病毒载体,观察WWOX基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX基因的作用机制及其功能奠定基础。方法：采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX基因,将WWOX基因亚克隆到慢病毒载体PCDH—CMV—MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX,通过双酶切验证后,慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV,Pvsv-G共转染293T细胞,获得携带WWOX基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX,并转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT—PCR和Western Blot验证Lenti WWOX在PEO1细胞株中的表达。结果：测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX;表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60％,有WWOX基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶（IDO）基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应（PCR）方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况;采用Wester blot 检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108 TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。