治疗型HBV DNA疫苗在小鼠组织中的分布和长期毒性研究

为研究治疗型HBV DNA疫苗使用的安全性，观察质粒在小鼠组织中的分布和其长期毒性，采取给小鼠肌注—电转染治疗型HBV DNA疫苗10μg和50μg后，用PCR法检测外源基因在小鼠组织的分布和存留时间；另用小鼠肌注—电转染治疗型HBV DNA疫苗30、60和120μg，每周2次，连续4周，共8次，于末次给药后48h，各组活杀1／2，留下1／2继续观察4周，进行血液学、血生化、病理组织学及抗核抗体检查。结果单次肌注—电转染疫苗后，质粒DNA主要分布于注射部位肌肉组织，可存留8周，其他组织也有散在低水平分布，但持续时间较短；未发现动物有异常表现，血液学、血生化和病理组织学检查未见异常；未观察到抗核抗体的产生和自身免疫病理损害。上述结果表明，治疗型HBV DNA疫苗安全性良好。     

治疗型双质粒HBV DNA疫苗对食蟹猴免疫功能的影响

目的评价治疗型双质粒HBV DNA疫苗(简称HBV DNA疫苗)诱导食蟹猴HBV特异性体液免疫和细胞免疫的效果。方法30只食蟹猴随机均分为5组(雌雄各半),分别重复肌注高剂量2000μg/kg、中剂量660μg/kg、低剂量200μg/kgEP介导HBV DNA疫苗,330μg/kg EP介导的佐剂质粒和PBS对照。在不同时间点以酶联免疫吸附法(ELISA)及酶联免疫斑点法(ELIS-POT)检测其血清抗-HBs水平并计数外周血单个核细胞(PBMCs)HBsAg特异性分泌IFN-γ的T细胞频数。结果食蟹猴接种不同剂量HBV DNA疫苗后第10周起均产生不同滴度的特异性抗体。16周时EP介导的HBV DNA疫苗高、中、低剂量组各3只食蟹猴中分别有3、2、3只HBsAg特异性IFN-γT细胞计数阳性;29周时高、中、低剂量组全部动物应答呈阳性,其计数结果分别为30.0±13.5SFCs/3×105PBMCs,30.7±26.3SFCs/3×105PBMCs及17.7±6.4SFCs/3×105 PBMCs;而相同时间点佐剂组和PBS对照组3只食蟹猴均为阴性。结论EP介导的HBV DNA疫苗能有效诱导食蟹猴产生HBsAg特异性体液和细胞免疫应答。     

以恒河猴为模型的霍乱毒素B亚基与疟原虫多表位构建的DNA疫苗的免疫保护作用

研究以霍乱毒素B亚基 (CTB)为载体的重组疟疾多价抗原 (AWTE)表位的DNA疫苗在恒河猴中的免疫原性及对相应疟原虫感染的免疫保护作用。方法 :以恒河猴为模型 ,肌肉途径免疫编码CTB AWTE基因的质粒 ,免疫间隔为 15d ,免疫 3次 ,免疫剂量为每种质粒每次 50 0 μg/只。结果 :DNA疫苗组免疫 2次后即产生了较高水平的细胞免疫和体液免疫 ,免疫后 91d用 1.2 5× 10 8个猴疟原虫攻击 ,对照组 5只动物在攻击后 14d左右全部感染 ,感染持续 34d以上 ;DNA疫苗组的 5只动物在攻击后 60d没有感染。结论 :这种鸡尾酒式的抗原表位组合构建的DNA疫苗具有很好的免疫原性 ,同时也说明DNA疫苗在抗疟感染中起着举足轻重的作用。     

恒河猴肌注青蒿素亚急性毒性病理学研究

恒河猴30只,经连续14天肌注青蒿素油悬剂,于停药后3天,主要在每天肌注96和192mg/kg组中引起多种脏器组织的损伤。表现为:骨髓红系和粒系细胞数减少,成熟发育障碍,巨核细胞增生,心肌细胞变性和灶性坏死(以超微结构病变为主);肝、肾营养不良性改变;淋巴组织萎缩;注射部位的损伤等,其中以骨髓和心肌损伤较为明显。于停药后35天,上述病变明显减轻或消失,表明青蒿素的毒副作用是可逆性的。每天肌注青蒿素24和48mg/kg为轻微中毒剂量;96mg/kg为严重中毒剂量;192mg/kg为致死剂量。每天肌注192mg/kg组的4只猴,有3只于末次给药后1～3天死于严重心肌损伤。     

电脉冲介导的治疗性双质粒HBV DNA疫苗的临床安全性及免疫原性研究

目的 观察电脉冲(EP)介导的治疗性双质粒HBV DNA疫苗的安全性及免疫原性.方法 将30名健康志愿者随机分为低(1mg)、中(2mg)、高(4mg)三个剂量组(n=10).于0、4、12、24周肌注联合EP导入治疗性双质粒HBVDNA疫苗.每个剂量组随机再分成两组(n=5),分别使用两种不同输出电压(36V和60V)导入DNA疫苗.观察受试者HBVDNA疫苗给药前后生命体征,物理学诊断指标(心电图、胸透、B超),实验室检查指标(血、尿常规、血液生化、凝血酶原时间、甲状腺功能、肿瘤标记物),免疫学检测指标[干扰素y(IFN-γ)、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体]、HBV血清标记物(HBsAg、HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBV DNA)及抗HBs等的变化.结果 所有志愿者接受疫苗后,耐受性良好、生命体征平稳,个别受试者出现一过性体检指标升高或轻度异常,怀疑与用药有关,但均能自行缓解或恢复;抗HBs在大剂量36V组中有升高趋势,其中1例受试者给药后达17.22mU/ml.结论 EP介导的治疗性双质粒HBVDNA疫苗在低、中、高三个剂量组中均显示较好的耐受性和安全性,且在大剂量组中具有一定的体液免疫原性.     

电脉冲肌注法增强治疗型HBV DNA疫苗免疫效果的实验研究

为提高细胞内质粒DNA的导入率并增强DNA疫苗诱导的免疫效果 ,采用在体电脉冲肌注法接种治疗型HBVDNA疫苗。结果接受电脉冲(2 0 0V/cm)肌注的 8只BALB/c小鼠局部肌肉组织荧光素酶活性为 1 6 1 70± 1 2 5 33RLU ,未加电脉冲对照组为 8 0 2±8 0 0RLU ,相差 4个数量级 ,差异具非常显著性 (P <0 0 0 5 ,t=3 6 74 )。新西兰兔电脉冲肌注法接种后第 2、4周 ,双质粒 (pS2 ·S pFP)大剂量组 (5 0 5 0 μg/只 )血清抗 HBs阳性动物数明显较同期未加电脉冲对照组 (大剂量 :1 0 0 0 1 0 0 0 μg/只 )高 ,差异具显著性意义 (P <0 0 5 ) ;第 1 3周时 ,电脉冲免疫大 (5 0 5 0 μg/只 )、中 (2 5 2 5 μg/只 )、小 (5 5 μg/只 )剂量组均有血清抗 HBs阳性鼠出现 ,分别为 5、4和 4 只 ,组间阳性动物数并无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,但均较同期的对照组高 ,并具有显著性意义 (P <0 0 5 )。恒河猴电脉冲肌注法接种后 8周血清抗 HBs阳性动物数为大剂量 (1 0 0 0 1 0 0 0 μg/只)组 3/ 3只 ,中剂量 (5 0 0 5 0 0 μg/只 )组 2 / 3只 ,小剂量 (1 0 0 1 0 0 μg/只 )组 0 / 3只 ,大剂量组与小剂量组及非电脉冲对照组之间比较差异具有显著性意义 (P <0 0 5 ) ;至免疫第 1 3周时 ,电脉冲免疫的大、中、小 3个剂量组     

rhIL-1Ra对恒河猴肾脏毒性的病理组织学观察

目的 观察重组人白介素-1受体拮抗剂(rhIL-1Ra)的毒性靶器官及毒性的严重程度.方法 32只成年恒河猴分为rhIL-1Ra 2mg/(kg·d)(n=6)、10mg/(kg·d)(n=6)和50mg/(kg·d)(n=6)连续给药90天组,10mg/(kg·d)(n=4)连续给药30天组,正常对照组(n=5)和溶剂对照组(n=5).rhIL-1Ra为皮下注射给药,每日1次.观察指标包括一般药物反应、尿八项、心电图、眼底检查、外周血细胞计数及白细胞分类、凝血时间、血清生化、外周血T细胞亚群和猴抗rhIL-1Ra抗体测定、脏器重量和脏器系数、常规病理组织学检查.结果 给药后30天各给药组动物血清非特异性抗体明显升高.rhIL-1Ra 2mg/(kg·d)组其他检测指标均未见明显地改变.rhIL-1Ra 10mg/(kg·d)组给药后90天肾小球毛细血管基底膜明显增厚,但此剂量给药时间为30天时未见任何异常.rhIL-1Ra 50mg/(kg·d)组肾小球及肾小管中蛋白性液体量多,小球毛细血管基底膜增厚更为严重,且停药30天后基底膜增厚程度仍未见明显减轻或改善.结论 rhIL-1Ra的主要毒性靶器官为肾脏,2mg/(kg·d)为安全剂量,10mg/(kg·d)给药30天时为安全剂量,给药90天为恒河猴中毒性剂量,而50mg/(kg·d)为明显的毒性反应剂量,可产生难以恢复的肾脏纤维化.     

增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）自身增强子I（enhancerI，ENHI）对HBV DNA疫苗免疫应答的影响。方法 采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原（HBsAg）和HBsA-ENHI基因片段，重组到载体VR1012中，构建两种HBV DNA疫苗，转染CADS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB／c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果 转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHI的HBV DNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高，两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异；免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHI可使HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加，对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB／C小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

我国戊型肝炎病毒87A株实验感染恒河猴的研究

用组织培养分离的戊型炎病毒（ＨＥＶ）８７Ａ株病毒液，以后腿静脉内接种４只恒河猴，其中２只在感染后第５周血清转氨酶（ＡＬＴ）开始升高，最高值达到染前猴的将近２倍，升主后肝活检可见特征性病理学改变，并从混合粪便液中分离出相同的病毒；感染的动物ＨＥＶ特异性抗体全部转阳。而２只对照猴无上述感染症状。表明８７Ａ株是一种直病毒。     

美洛昔康注射液人体的药动学研究

目的研究单剂量和多剂量肌注美洛昔康后的药代动力学。方法30名健康志愿者单剂量肌注3．75、7．5、15mg和11名健康志愿者7次肌注7．5mg后，采用LC／MS／MS法测定血浆中美洛昔康的浓度，DAS软件对各组药-时曲线进行拟合，并计算药代动力学参数。结果其药-时曲线符合开放性二室模型，呈一级消除动力学；分别得到3个单剂量组及多剂量组美洛昔康的Cmax、Tmax、AUC0-96h、t1／2β、MRT0-∞、Vd／F、CL/F各值；单剂量组28名强代谢型的Cmax、AUC0-96h与给药剂量呈线性正相关。结论各组受试者注射后耐受性好，其在受试者体内的药动学存在明显个体差异。可为美洛昔康注射液在临床用药的安全性和有效性提供依据。     

抗HBV治疗性疫苗治疗HBV携带者的临床实验研究

目的　进一步验证抗HBV治疗性疫苗治疗HBV携带者的临床疗效。方法　将确诊为HBV携带者的 6 0 0例患者随机分为两组 ,一组为抗HBV治疗性疫苗实验组 ,30 0例 ,用抗HBV治疗性疫苗治疗 ,每月 1次 ,皮下注射 ,同时服用维生素C 5 0 0mg/d,疗程为1 2个月 ;另一组为对照组 ,30 0例 ,用生理盐水 2ml,皮下注射 ,每月 1次 ,同时服用维生素C 5 0 0mg/d,1 2个月为 1疗程。两组在年龄、性别、病程、HBV标记物状况方面均有良好的可比性。治疗过程中第 1 2、2 4、4 8周复诊 1次。治疗前及每次复诊时检测血清HBsAg、HBeAg、HBVDNA、抗 HBe、抗 HBs及ALT。上述指标第 4 8周的检验结果作为评价疗效的依据。疗程期满停止治疗后 ,对实验组 2 0 8例与对照组 1 96例进行为期 1 2个月的随访。随访期内第 1 2个月做上述HBV标记物检测 ,以评价终止治疗 1 2个月内HBV标记物的改变。结果　抗HBV治疗性疫苗实验组的HBsAg、HBeAg、HBVDNA的阴转率及抗 HBe与抗 HBs的阳转率分别为 1 4 7%、32 0 %、37 3%、2 0 0 %和 7 1 % ;对照组分别为 2 0 %、6 0 %、6 7%、1 3%和 0 % ,两组相比差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。实验组停止治疗后随访 1年 ,复发率为 5 9%。结论　抗HBV治疗性疫苗治疗对HBV携带者有一定的抗病毒疗效     

血清HBV-DNA检测在招收飞行学员筛选中的意义

目的 调查在ELISA方法检测血清HBsAg阴性飞行学员中，血清HBV-DNA的检出情况。方法 用ELISA法检测2224名应招飞行学员血清HBsAg。其中阴性者进一步检测抗-HBs、抗-HBc、HBeAg、抗-HBe，并用聚合酶链反应（PCR）检测HBsAg阴性者HBV-DNA。结果 在2224名应招飞行学员中HBsAg阳性158例，阳性率7.1%；HBsAg阴性者中，除单项抗-HBs阳性血清模式外，其他各模式均有不同例数的人检测到HBV-DNA。结论 本研究表明，仅检测血清中HB-sAg的表达状况。不足以将所有感染有HBV者筛选出去，应由灵敏度更高的分子生物学方法取代。     

合格库血与肝炎病毒的传播

目的　探讨合格库血在传播肝炎病毒方面所起的作用。方法　采用ELISA方法及PCR技术对合格库血进行了HBsAg ,抗 HBs ,HBeAg ,抗 HBe ,抗 HBc,抗 HCV ,HBV DNA ,HCV RNA的回顾性检测。 结果　 116 2袋合格库血中HBsAg ,抗 HBs,HBeAg ,抗 HBe ,抗 HBc ,抗 HCV ,HBV DNA ,HCV RNA检出率分别为 :0 .17% (2 / 116 2 ) ,2 7.4(318/116 2 ) ,0 .9% (10 / 116 2 ) ,5 .6 % (6 5 / 116 2 ) ,2 4.3(2 82 / 116 2 ) ,0 .17(2 / 116 2 ) ,15 .0 % (174/ 116 2 ) ,1.5 % (17/ 116 2 ) ,其中在 5 6 3份HBsAg ,抗 HCV全部阴性者中HBV DNA ,HCV RNA检出率分别为 :8.9% (5 0 /5 6 3) ,2 .8% (16 /5 6 3)。 结论　仅以HBsAg ,抗 HCV阴性作为排除HBV ,HCV的感染是欠妥的 ,应增加抗 HBs ,HBeAg ,抗 HBe ,抗 HBc的检测 ,同时采用PCR技术来筛出ELISA全部阴性 ,HBV DNA ,HCV RNA仍阳性的携带者 ,减少输血后肝炎的发生。     

乙肝疫苗预防相关性肝移植后乙肝复发的临床观察

目的观察乙型肝炎（简称：乙肝）相关性肝移植术后接种乙肝疫苗预防乙肝复发的临床指标,探讨影响疫苗应答的相关因素。方法观察了9例应用乙型肝炎基因重组疫苗主动免疫的乙肝相关肝移植术后患者,分别在术后0、1、2、6个月接种,每次60μg,检测血清抗-HBs的滴度。结果9例中,2例出现完全应答,停用乙型肝炎免疫球蛋白（hepatitisBim—munoglobulin,HBIG）;3例部分应答,HBIG减量,4例无应答。结论乙肝疫苗是预防乙肝相关性肝移植后乙肝复发的策略之一。接种时抗体滴度可能会增加疫苗的应答率。     

HBsAg阴性应招飞行学员血清HBV-DNA检测研究

目的为控制ＨＢＶ慢性携带者进入航校提供对策，对应招飞行学员中ＨＢｓＡｇ阴性者的ＨＢＶ感染情况及对ＨＢＶ的免疫状态作一探讨。方法用ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｓ、抗－ＨＢｃ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢｅ，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果ＨＢｓＡｇ阴性应招飞行学员中抗－ＨＢｓ阳性２０６／９６２例（２７．６％），抗ＨＢｃ阳性２２９／９６２例（２２．８％），ＨＢｅＡｇ阳性０／４５０例，抗ＨＢｅ阳性３／４５０例（０．６７％），ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性１５／２２８例（６．６％）。ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性主要集中在单一抗ＨＢｃ阳性者中１４／７５例（１８．７％）。获得ＨＢＶ免疫者为３４．０％。结论在应招飞行学员中对单一抗ＨＢｃ阳性者应做ＨＢＶ－ＤＮＡ检测，未获ＨＢＶ免疫者应接种乙肝疫苗     

复制型HBV转基因小鼠的建立与应用

尽管有了有效的疫苗,但乙肝病毒(HBV)感染依然是全球性公共卫生问题,在我国形势尤为严峻。由于HBV的自然宿主仅限于人和黑猩猩,现有的模型都有不同的缺陷,因此关于其生物学及治疗方法研究的诸多问题依然没有解决。复制型HBV转基因小鼠模型的建立,极大地提高了我们对HBV生活史、免疫生物学和肝脏病变的免疫发病机制的认识。本文简要介绍国际上由Francis V.Chisari实验室和国内由本实验室建立的复制型HBV转基因小鼠,以及利用该模型开展抗病毒药物和乙肝发病机制的研究工作。     

丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗－HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落。随机挑选60个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定。获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV核心蛋白特异性抗－Id scFv的编码序列进行测定分析。结果经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，在随机挑选的60个克隆中，有20株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应后，确定了其中有6株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆，提取质粒，进行DNA序列测定，DNA大小为768bp。本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗－HCV核心蛋白的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治慢性丙型肝炎的研究创造了条件。     

丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为探索新型治疗方法，制备抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗HCV NS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板，应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，随机挑选82个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定，获得与HCV NS4A单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV NS4A特异性抗－Id scFv的编码基因进行序列测定分析。结果：经过筛选82个克隆中有40株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应，确定其中有7株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆。提取质粒，进行DNA序列测定，DNA为789bp。本实验结果提示，用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCV NS4A的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件。     

HGV感染在慢性乙型肝炎抗乙肝胎盘肽治疗远期疗效及预后中的意义

目的　探讨庚型肝炎病毒 (HGV)感染对慢性乙型肝炎 (CHB)抗乙肝胎盘治疗的远期疗效及预后的影响。方法　对比观察经肝穿活检确诊 (G2 ～G3)的 11例合并与 2 2例未合并HGV感染的CHB抗乙肝胎盘肽治疗 (4ml,1次 /d ,肌注 ,疗程 4月 )的远期疗效及预后。两组患者在年龄、性别、病程、肝脏损害等方面具有可比性 ,且血清HBsAg ,HBeAg ,HBV DNA均阳性 ,ALT异常。结果　两组患者无论治疗结束时 ,治疗后 6个月、1年、2年ALT复常率、HBeAg ,HBV DNA阴转率 ,还是治疗结束时、治疗后 6个月、1年血清HBV DNA含量变化均无显著差异 (P >0 .0 5 )。 2年后肝功能水平变化也无显著性差别 (P >0 .0 5 )。抗乙肝胎盘肽治疗的 2年持续应答率达 42 4%。结论　HGV感染并不影响CHB抗乙肝胎盘肽治疗的远期疗效 ,也不影响CHB的预后。HGV至多仅有微弱的肝脏致病性。抗乙肝胎盘肽是一种有效的抗乙肝病毒药物。     

膦甲酸钠抗乙型肝炎病毒近期疗效观察

为观察磷甲酸钠抗乙型肝炎病毒（HBV）的近期疗效，将67例慢性乙型肝炎患者随机分为2组：治疗组47例，在常规保什治疗的基础上加用膦用甲酸钠；对照组20例，仅用常规保肝药物治疗。治疗前后观察患者功能、血清HBVDNA含量、乙肝病毒免疫学标志等的变化。结果显示，治疗2周后，治疗组肝功能均有恢复；47例患者中42例HBVDNA水平下降，以第1周明显，第2周时10例反跳；13例HBVDNA转阴，其中5例在用药1周后即转阴。30例HBeAg阳性患者中，2例出现血清转换，1例转为弱阳性。提示磷甲酸钠具有明显和快速的抑制乙肝病毒复制、降低病毒量的作用，可作为抗病毒序贯疗法的首程用药或联合用药的选择之一。