电脉冲介导的治疗性双质粒HBV DNA疫苗的临床安全性及免疫原性研究

目的 观察电脉冲(EP)介导的治疗性双质粒HBV DNA疫苗的安全性及免疫原性.方法 将30名健康志愿者随机分为低(1mg)、中(2mg)、高(4mg)三个剂量组(n=10).于0、4、12、24周肌注联合EP导入治疗性双质粒HBVDNA疫苗.每个剂量组随机再分成两组(n=5),分别使用两种不同输出电压(36V和60V)导入DNA疫苗.观察受试者HBVDNA疫苗给药前后生命体征,物理学诊断指标(心电图、胸透、B超),实验室检查指标(血、尿常规、血液生化、凝血酶原时间、甲状腺功能、肿瘤标记物),免疫学检测指标[干扰素y(IFN-γ)、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体]、HBV血清标记物(HBsAg、HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBV DNA)及抗HBs等的变化.结果 所有志愿者接受疫苗后,耐受性良好、生命体征平稳,个别受试者出现一过性体检指标升高或轻度异常,怀疑与用药有关,但均能自行缓解或恢复;抗HBs在大剂量36V组中有升高趋势,其中1例受试者给药后达17.22mU/ml.结论 EP介导的治疗性双质粒HBVDNA疫苗在低、中、高三个剂量组中均显示较好的耐受性和安全性,且在大剂量组中具有一定的体液免疫原性.     

治疗型HBV DNA疫苗肌注-电转染法免疫恒河猴的效果及安全性观察

为观察肌注—电转染法接种治疗型HBVDNA疫苗对恒河猴的免疫效果，对健康恒河猴采用肌注—电转染法接种治疗型HBV DNA疫苗，剂量分别为0．2mg／只、1mg／只和2mg／只；前3次给药时间间隔1个月，主要观察免疫效果；此后6次给药为每天1次，观察重复给药的安全性。结果显示肌注—电转染法接种疫苗后，不同剂量组均可有效诱导恒河猴产生HBsAg特异性抗体(抗—HBs)；重复给药未见明显的各系统毒副反应及血液学和血生化异常，血清抗核抗体(ANA)阴性。表明治疗型HBV DNA疫苗用肌注—电转染法免疫可显著增强恒河猴的免疫效果；多次重复接种该疫苗未见恒河猴的毒性反应，疫苗具有安全性。     

治疗型HBV DNA疫苗在小鼠组织中的分布和长期毒性研究

为研究治疗型HBV DNA疫苗使用的安全性，观察质粒在小鼠组织中的分布和其长期毒性，采取给小鼠肌注—电转染治疗型HBV DNA疫苗10μg和50μg后，用PCR法检测外源基因在小鼠组织的分布和存留时间；另用小鼠肌注—电转染治疗型HBV DNA疫苗30、60和120μg，每周2次，连续4周，共8次，于末次给药后48h，各组活杀1／2，留下1／2继续观察4周，进行血液学、血生化、病理组织学及抗核抗体检查。结果单次肌注—电转染疫苗后，质粒DNA主要分布于注射部位肌肉组织，可存留8周，其他组织也有散在低水平分布，但持续时间较短；未发现动物有异常表现，血液学、血生化和病理组织学检查未见异常；未观察到抗核抗体的产生和自身免疫病理损害。上述结果表明，治疗型HBV DNA疫苗安全性良好。     

治疗性HBV DNA疫苗诱导健康Balb/c小鼠细胞免疫应答的实验研究

目的探讨治疗性HBVDNA疫苗对健康Balb/c小鼠表达Th1类细胞免疫应答的影响。方法治疗性HBVDNA疫苗(pS2·S+pFP)以剂量(50μg+50μg)/只对Balb/c小鼠进行接种,以酶联免疫斑点法(ELISPOT)、流式细胞术(FACS)分析特异性分泌IFN-γ阳性T细胞的免疫效果。结果免疫6周时,实验组用HBsAg刺激后其诱生的IFN-γ细胞频数(34±15.3)较不用HBsAg组(4±4.4)高(P<0.05,t=5.65),也较同期空载体免疫对照组(3±3.6)高(P<0.05,t=5.21);治疗性HBVDNA疫苗诱导小鼠CD4+T细胞表达IFN-γ的百分比实验组[(0.28±0.17)%]与对照组[(0.20±0.03)%]比较,无显著性差异(P>0.05,t=0.21);而诱导CD8+T细胞表达IFN-γ的百分比实验组[(0.69±0.08)%]与对照组[(0.24±0.12)%]比较,具显著性差异(P<0.05,t=4.167)。结论治疗性HBVDNA疫苗能有效诱导T细胞分泌HBsAg特异性IFN-γ因子,并以CD8+T细胞分泌占优而发挥细胞免疫应答的优势。     

电脉冲肌注法增强治疗型HBV DNA疫苗免疫效果的实验研究

为提高细胞内质粒DNA的导入率并增强DNA疫苗诱导的免疫效果 ,采用在体电脉冲肌注法接种治疗型HBVDNA疫苗。结果接受电脉冲(2 0 0V/cm)肌注的 8只BALB/c小鼠局部肌肉组织荧光素酶活性为 1 6 1 70± 1 2 5 33RLU ,未加电脉冲对照组为 8 0 2±8 0 0RLU ,相差 4个数量级 ,差异具非常显著性 (P <0 0 0 5 ,t=3 6 74 )。新西兰兔电脉冲肌注法接种后第 2、4周 ,双质粒 (pS2 ·S pFP)大剂量组 (5 0 5 0 μg/只 )血清抗 HBs阳性动物数明显较同期未加电脉冲对照组 (大剂量 :1 0 0 0 1 0 0 0 μg/只 )高 ,差异具显著性意义 (P <0 0 5 ) ;第 1 3周时 ,电脉冲免疫大 (5 0 5 0 μg/只 )、中 (2 5 2 5 μg/只 )、小 (5 5 μg/只 )剂量组均有血清抗 HBs阳性鼠出现 ,分别为 5、4和 4 只 ,组间阳性动物数并无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,但均较同期的对照组高 ,并具有显著性意义 (P <0 0 5 )。恒河猴电脉冲肌注法接种后 8周血清抗 HBs阳性动物数为大剂量 (1 0 0 0 1 0 0 0 μg/只)组 3/ 3只 ,中剂量 (5 0 0 5 0 0 μg/只 )组 2 / 3只 ,小剂量 (1 0 0 1 0 0 μg/只 )组 0 / 3只 ,大剂量组与小剂量组及非电脉冲对照组之间比较差异具有显著性意义 (P <0 0 5 ) ;至免疫第 1 3周时 ,电脉冲免疫的大、中、小 3个剂量组     

HBV DNA疫苗诱导健康及HBV转基因小鼠细胞免疫应答

采用HBVCTL表位多肽体外刺激或冲击免疫效 (E)、靶(T)细胞 ,以观察DNA疫苗诱导健康及HBV转基因 (Tg)小鼠细胞免疫效果。结果发现 ,DNA疫苗能有效诱导健康BALB/c小鼠CTL活性 ,活性强弱与E/T比值及其上清液中IFN γ分泌水平有一定关系。HBsAg表位多肽(pp2 0 )体外刺激DNA疫苗免疫组效应细胞 ,培养上清IL 1 2释放水平 (2 1 1 3± 39 8pg/ml)明显较对照组 (86 7±2 7 1 pg/ml)高(P <0 0 5 ,t=4 4 82 )。DNA疫苗免疫HBVTg小鼠诱导CTL活性 (1 2 7%± 6 7% )较蛋白疫苗免疫对照组(1 7%±3 2 % )高(P <0 0 1 ,t=3 6 2 9) ;其效应细胞体外受 pp2 0刺激后分泌IL 1 2水平 (4 0 0± 30 1pg/ml)明显高于同期空载体免疫对照组 (3 8±3 0 pg/ml,P <0 0 5 ,t=2 376 )。采用在体电脉冲法DNA疫苗接种的 5只HBVTg小鼠中 ,于 4周时有 2只血清HBsAg阴转 ,并于 8周时出现抗 HBs阳性 ,而对照组中无一例血清HBsAg发生变化。表明HBVDNA疫苗能有效诱导健康及HBVTg小鼠细胞免疫应答 ,提示其通过增强细胞免疫功能作为抗HBV免疫治疗的可行性     

治疗型双质粒HBV DNA疫苗的构建及其鉴定

为构建以人白细胞介素 2 /γ干扰素(hIL 2 /hIFN γ)融合基因为佐剂的治疗型HBVDNA疫苗 ,采用DNA重组技术分别构建含有HBV包膜中蛋白 (preS2 ·S)抗原和hIL 2 /hIFN γ融合蛋白的真核表达质粒即pcDNAS2 ·S和pcDNAIIF ,酶谱和测序分析表明克隆的preS2 ·S和hIL 2 /hIFN γ融合蛋白基因片段的方向、序列与预期相符。用脂质体转染试剂转染COS 7细胞 ,并用ELISA检测转染细胞培养上清中目的基因表达水平。结果显示 ,质粒转染后 4 8h达峰值 ,分别为HBsAg(P/N) =7.6 3、IL 2 =1 0 .35ng/ml、IFN γ =7.90ng/ml。以CTLL 2依赖细胞株/MTT比色法和微量细胞病变抑制法 (WISH VSV)检测pcDNAIIF转染后 4 8h培养上清中IL 2及IFN γ活性 ,结果分别为 998U/ml和 2 4 9U/ml。证明构建的重组质粒pcDNAS2 ·S和pcDNAIIF结构正确 ,在体外转染细胞其质粒得到分泌表达并保留生物学活性     

抗HBV的治疗性双质粒DNA疫苗的构建及初步药效学研究

目的：构建抗乙型肝炎病毒（HBV）的治疗性DNA疫苗并进行体外、体内鉴定。方法：采用PCR技术扩增含有HBV包膜中蛋白（preS2.S）抗原基因和hIL-2/hIFN-γ融合蛋白的基因,将目的基因分别亚克隆于pVAX1真核表达载体,并进行酶切和测序分析;转染双质粒于COS-7细胞检测基因及蛋白表达情况;利用Combinatotial Extension（CE）软件模建分析佐剂质粒表达融合蛋白的空间结构;双质粒联合在体电脉冲技术（EP）注射BALB/c小鼠以检测特异性的体液和细胞免疫应答。结果：经酶谱和测序分析表明,构建的双质粒pVAX1/S2.S（pS2.S）和pVAX1/IL-2IFN-γ（pIIF）的基因片段的方向、序列完全正确;ELISA法定量检测双质粒转染COS-7细胞后48小时目的基因（preS2.S和hIL-2/hIFN-γ）的蛋白表达水平较高,HBsAg、IL-2、IFN-γ的含量分别为45.1、10.03、11.5ng/ml;模拟空间结构分析表明佐剂质粒的融合蛋白中两细胞因子的活性部位均裸露在外;小鼠免疫试验结果表明,疫苗pS2.S能诱导健康小鼠的保护性抗-HBs的抗体产生,且具有剂量相关性;佐剂pIIF可显著增强疫苗pS2.S质粒的免疫效果;在EP辅助作用下,质粒pS2.S和pIIF共肌注BALB/c小鼠,低剂量就能诱导较强特异性的细胞和体液免疫。结论：成功构建了抗HBV的DNA疫苗pS2.S及佐剂pIIF质粒,并具有较特异的体内外活性。     

T-VISA-BikDD质粒对肿瘤细胞的抑制活性研究

探讨T-VI SA- B i kDD脂质体对肿瘤治疗的作用。方法 用阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000将T-VISA-BikDD和CMV-BikDD质粒转染入多种肿瘤细胞株中,MTT法检测细胞活性计算死亡率。结果 T-VISA-BikDD质粒经转染进入多种肿瘤细胞,对肿瘤细胞均有不同程度的杀伤作用;同一肿瘤系、不同细胞株间存在不同程度的差异,但存在一定的剂量依赖关系（P<0.01）。结论 T-VISA-BikDD质粒在体外对多种肿瘤细胞具有一定的杀伤作用,能有效地抑制肿瘤细胞的增殖,在临床抗肿瘤基因治疗中有重要意义。