分离纯化重组水蛭素Ⅲ工艺的优化研究及重组水蛭素Ⅲ的分子鉴定

目的优化分离纯化大肠杆菌发酵液中重组水蛭素Ⅲ的工艺并对所纯化产物进行分子鉴定. 方法通过三步纯化步骤,即大孔树脂层析、DEAE纤维素DE52层析和反相高效液相色谱层析,分离纯化发酵液中的重组水蛭素Ⅲ,优化纯化条件.通过SDS-PAGE和分析型反相高效液相色谱对重组水蛭素Ⅲ的纯度进行鉴定.以质谱对重组水蛭素Ⅲ的分子量进行鉴定.通过肽图的测定来鉴定重组水蛭素Ⅲ的结构. 结果通过优化后的分离纯化步骤得到了纯度为95.4786%的纯品,总产率为39%.得到的产物分子量为6 913.32 ± 6.55 Da,与重组水蛭素Ⅲ分子量的理论值相符,其结构亦与理论值一致. 结论优化后的分离纯化步骤可以有效地用于大肠杆菌发酵液中重组水蛭素Ⅲ的大规模分离纯化.所得的高纯度产物确为基因重组水蛭素Ⅲ.     

舟山眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化及镇痛作用研究

目的从舟山眼镜蛇毒中分离纯化神经毒素,并测定其部分理化性质及镇痛活性。方法应用SP-Sephadex C-50离子交换色谱法分离眼镜蛇毒粗毒,用Sephadex G-50凝胶过滤色谱、CM-Sephadex C-25离子交换色谱纯化神经毒素;SDS-PAGE(Tris-Tricine系统)鉴定纯度;用Meier方法测定毒性;用热板法观察神经毒素的镇痛作用。结果应用SP-Sephadex C-50离子交换柱层析,从舟山眼镜蛇毒中分离得到14个蛋白峰,其中6个组分(NNAV-Ⅶ ~Ⅻ)经鉴定为含有神经毒素组分,将神经毒活性最强的组分XI经Sephadex G-50、CM-Sephadex C-25纯化得神经毒素纯品NTⅪ。该纯品分子量12.3kD,小白鼠静脉注射和腹腔注射的LD50分别为1.9875、2.2217 mg·kg-1。NTXI能显著提高小鼠对热板刺激的痛阈。腹腔注射0.2mg·kg-1NTXI可使小鼠的热板痛阈提高84.35%。NTXI的镇痛作用具有时效性,给药后2h起效,4h作用达峰值。结论舟山眼镜蛇毒中分离得到一个神经毒素纯品NTⅪ,具有镇痛作用。     

广西圆斑蝰蛇毒凝血因子X激活剂的分离纯化及其止血作用的研究

目的从广西圆斑蝰蛇毒中分离纯化凝血因子X激活剂（factor X activator of Russell’sviper venom,RVV-X）并研究其止血作用。方法应用阴离子交换色谱和凝胶过滤从广西圆斑蝰蛇毒中分离纯化RVV-X,以复钙化时间进行活性鉴定,以SDS-PAGE测定纯度和分子量。观察RVV-X对家兔肝脏创伤出血模型出血时间及出血量,家兔和肝素化小鼠凝血时间的影响。结果广西圆斑蝰粗毒经阴离子交换色谱获得六个蛋白峰,将RVV-X所在第V峰用凝胶过滤获得的组分A为RVV-X纯品,其凝血活性具有钙依赖性。SDS-PAGE非还原性条件下呈单一蛋白条带,分子量约为97.8kDa,还原性条件下呈二蛋白条带,为一条重链（约76.3kDa）和一条轻链（约21.5kDa）。RVV-X可显著减少家兔肝脏切口的失血量,缩短切口出血时间;能显著缩短家兔及肝素化小鼠凝血时间。结论用层析方法从广西圆斑蝰蛇毒中分离得到的凝血因子X激活剂具有较强的止血活性。     

单链聚乙二醇化重组人干扰素ω的制备及其性质

采用直链PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯 (mPEG-SS) 选择性修饰重组人干扰素ω (rhIFNω), 离子交换 色谱和凝胶过滤色谱组合分离纯化单链PEG修饰产物 (PEG-rhIFNω), 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 测定单链PEG-rhIFNω的相对分子量, 并利用RP-HPLC和SDS-PAGE对修饰产物进行分析。在优化的工艺条件下, 分离纯化收集液的单链PEG-rhIFNω, 平均含量达182 μg·mL⁻¹, 分离纯化收率超过22%, 纯度大于98%, SDS-PAGE法测得表观分子质量为60 810, MALDI-TOF MS法测得相对分子质量为43 790; 单链PEG-rhIFNω具有典型PEG修饰蛋白的特性, 抗病毒活性保留率为15.0%, 抗原性降低了64倍, 酸稳定性、抗 胰酶水解能力、血清稳定性和热稳定性均显著提高。单链PEG-rhIFNω的药学性质获得显著改善, 有望开发为 安全、长效的新型干扰素。     

胸腺肽β4分离与纯化工艺的研究

目的:以小牛胸腺为原料,研究其中的活性多肽胸腺肽β4的分离和纯化工艺.方法:采用硫酸铵沉淀法制得胸腺素5粗提品,然后利用阴阳离子交换色谱纯化得到胸腺肽β4产品,并采用SDS-PAGE和HPLC法进行分析鉴定.结果:分离纯化得到了纯度为90.1%的产品.结论:本实验采用低压离子交换色谱分离得到了纯度为90.1%的产品,可用于进一步的工业化研究.     

浙江眼镜蛇(Naja naja atra)蛇毒镇痛多肽的分离纯化及其性质的研究

研究浙江眼镜蛇(Naja naja natra)蛇毒的镇痛活性组分，为寻找镇痛效果好，而无成瘾性的新型镇痛药奠定基础。采用CM-Sephadex离子交换色谱和Sephadex G-50凝胶过滤色谱对浙江产眼镜蛇蛇毒中的镇痛活性组分进行分离纯化。采用PAGE IEF及HPLC上等实验方法对产物纯度进行鉴定。采用SDS-PAGE法和HPLC法测定产物的分子质量，用IEF法测定产物的等电点，用小鼠热板法与醋酸扭体法考察产物的镇痛活性。结果表明眼镜蛇毒经3次柱色谱后，产物AAP经鉴定为单一组分。AAP经SDS-PAGE法和HPLC法测定的分子质量分别是7．28Mr和7．25Mr，等电点是9．58。AAP的痛阈提高百分率和扭体抑制率分别为91．3％，77．2％。眼镜蛇毒经3次柱色谱后得到具有镇痛活性的单一组分。     

一株产脂肽类抗生素bacillopeptin A深海芽孢杆菌的筛选与鉴定

目的 筛选从中国南海深海3601m的海泥样品中分离得到的细菌,获得一株芽孢杆菌SH-B74,分离其产生抗植物病原真菌脂肽类化合物,并进行菌种鉴定.方法 使用酸沉淀、快速柱色谱、SPE和半制备反高效液相色谱技术分离发酵液中的脂肽类纯化合物,采用形态、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析相结合方法鉴定菌株.结果 分离纯化得到一种拮抗植物病原真菌的脂肽类纯化合物bacillopeptin A,分子量为1020.6Da;菌株经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).结论 该菌株对玉米纹枯病等多种植物病原真菌具有拮抗作用,代谢产物bacillopeptin A对苹果干腐病菌具有良好的拮抗效果.显示了该菌及其代谢产物在植物病原真菌的生物防治和土壤生物修复方面具有潜在研发价值.     

甲状旁腺素1-34肽的固相合成

目的以Wang树脂为载体 ,应用芴甲氧羧基 /tBu方法合成人甲状旁腺素。方法芴甲氧羧基保护氨基酸用 1 氧 3 双二甲胺羧基苯骈三氮唑四氟化硼盐 / 1 羧基苯并三氮唑活化后 ,进行缩合反应。合成的多肽用三氟乙酸处理 ,从Wang树脂上切除。所得粗肽用SP Sepharose FF色谱柱和半制备型高效液相色谱分离纯化。结果用反相高效液相色谱法和毛细管电泳法鉴定纯度在 92 %以上。通过电喷雾质谱法测定其分子量为 4 1 1 6D ,与计算值相符。总收率为 8%。结论此工艺简单 ,易于扩大 ,适合于规模化生产     

眼镜蛇神经毒素的规模化制备及其镇痛作用的研究

目的 建立一种快速、规模化制备眼镜蛇毒神经毒素的方法.方法 采用CM-sephadex C-25和CM-sepharose fast flow离子交换柱层析纯化经初步处理的眼镜蛇毒;SDS-PAGE和HPLC检测产物的纯度;离体蛙心和红细胞溶血试验检查产物的心脏毒性和溶血性;小白鼠热板模型、醋酸扭体模型和大白鼠电刺激嘶叫模型评价产物的镇痛作用.结果 制备的产物可达到电泳纯和HPLC单一峰,无心脏毒性和溶血活性,镇痛作用强,但起效慢.结论 所用工艺适合眼镜蛇毒神经毒素工业化制备的需要.     

双脱甲氧基姜黄素的提取、纯化及鉴定

目的 由中药姜黄中提取双脱甲氧基姜黄素。方法 采用柱层析法由姜黄醇提物中分离双脱甲氧基姜黄素，然后采用重结晶法对其进行纯化；分别采用薄层层析法和高效液相色谱法(HPIC)对分离产物进行纯度鉴定，最后采用质谱法测定其分子量。结果 (1)薄层层析法检测结果表明，经柱层析法获取的双脱甲氧基姜黄素中无其他色素成分；但HPLC法的检测结果则表明，分离产物中的杂质峰总面积约占8．2％。采用结晶法纯化后，其中的杂质峰总面积降至3．4％。(2)质谱法鉴定结果表明，分离产物的分子量为308，与双脱甲氧基姜黄素的分子量完全一致，证明所获取的产物即双脱甲氧基姜黄素。结论 柱层析法与结晶纯化法相结合是分离、纯化双脱甲氧基姜黄素的有效方法。     

瑞香狼毒药材毒性成分研究初探

目的 建立瑞香狼毒药材蛋白质部位提取分离的方法以及分子量鉴定的方法,确定瑞香狼毒的毒性来源.方法 饱和硫酸铵盐析法沉淀总蛋白;SephadexG-150、SephadexG-100、SephadexG-50凝胶梯度分离不同分子量的蛋白;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴别蛋白质的分子量.结果 提取分离得到5个不同分子量的蛋白质,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定它们的分子量依次为:14.4、35.0、28.0、23.0、94.0 kDa.结论 此方法可作为瑞香狼毒药材中蛋白质提取分离方法和分子量鉴定方法,为瑞香狼毒蛋白质部位的研究提供了方法依据,并确定了瑞香狼毒的毒性来源,通过确定分离出的蛋白质的分子量来确定蛋白质毒性位点.     

蚯蚓新型脱氧核糖核酸酶的相对分子质量测定

目的测定蚯蚓组织中一种新型脱氧核糖核酸酶(EWD3)的相对分子质量。方法采用凝胶过滤层析法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳法(SDS-PAGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)3种方法测定一种新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶(EWD3)的相对分子质量。结果凝胶过滤层析法、SDS-PAGE法和质谱法测定其相对分子质量分别为55080、58270和63460。结论凝胶过滤层析法和SDS-PAGE法可以常规粗略测定蛋白的相对分子质量,质谱法可以比较准确测定蛋白的相对分子质量,EWD3为单亚基蛋白,其相对分子质量约在55000￣65000之间。     

一种新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶相对分子质量的测定

目的测定从蚯蚓组织中提取纯化的一种新型脱氧核糖核酸酶的相对分子质量。方法采用凝胶过滤层析法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法三种方法测定一种新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶(EWD1)的相对分子质量。结果凝胶过滤层析法、SDS-PAGE法和质谱法测定其相对分子质量分别为126440、136320和157190。结论EWD1由两个亚基组成,其相对分子质量最终确定为157190。     

CK纤溶酶的分离纯化及其体外溶栓研究

目的:探索CK纤溶酶的分离纯化方法及观察其体外溶栓作用.方法:先用硫酸铵沉淀,然后通过羧甲基琼脂糖快速胶柱层析后进行分离纯化,并用SDS-PAGE测定纯度、相对分子质量,及其对人血凝块的水解活性.结果:得到了电泳纯的酶,其分子质量为27 000,且具有显著的体外溶栓作用.结论:CK纤溶酶有望开发成为一种新型口服溶栓药物.     

生脉注射液不同制备工艺中间体含残留蛋白质的检测研究

目的检测生脉注射液不同制备工艺中间体含残留蛋白质含量。方法以残留蛋白质为检测目标,采用透析法获取生脉注射液不同制备工艺中间体中大分子杂质,Bradford法测定各大分子杂质中残留蛋白质含量,结合SDS-PAGE电泳分析各残留蛋白质分子质量。结果在0～8μg线性范围内,牛血清白蛋白标准品回归方程为:Y=0.0474X-0.003(r=0.9974);不同工艺对提取液中残留蛋白的影响较大,红参不同工艺提取液含残留蛋白浓度较高,分别为399、353μg/mL;麦冬、五味子提取液残留蛋白含量相对较低;经对SDS-PAGE电泳结果分析,各不同工艺提取液中间体含蛋白质分子质量主要集中于6～11万。结论生脉注射液中间体提取工艺工程中可能有蛋白质残留,应加强残留蛋白质检测及生脉注射液的工艺改进;Bradford法结合SDS-PAGE电泳分析生脉注射液中的残留蛋白质,快速、准确、敏感性及检测结果均较好,可为工业生产提供科学数据参考。     

蕲蛇酶与降纤酶的生物活性比较

目的比较蕲蛇酶和降纤酶在试管内的酶活力及在兔体血液凝固系统的生物活性。方法分别体外测定蕲蛇酶和降纤酶的相对分子质量(Mr)、蛋白质含量、精氨酸酯酶活力和凝血酶活力等。分别给家兔静脉注射蕲蛇酶0.75U/kg和降纤酶5U/kg,连续3d,比较给药前后纤维蛋白原含量、凝血酶时间、凝血酶原时间、部分凝血酶活酶时间、血小板数目、血小板聚集率、血栓长度及血栓重量的变化。结果蕲蛇酶Mr比较小(27000),且由2个Mr为15500的亚基构成,降纤酶Mr较大(40900),为单链蛋白质。0.75U蕲蛇酶和0.21U凝血酶相当;5U降纤酶约相当于1.4U凝血酶.蕲蛇酶的精氨酸酯酶活力为(973±14)μmolTAME/(mg.min),降纤酶的精氨酸酯酶活力为(1140±18)μmolTAME/(mg.min)。家兔实验,两者均能减少血栓形成及降低纤维蛋白原含量,但蕲蛇酶的药效比降纤酶强,其余指标无明显差异。结论蕲蛇酶与降纤酶不同,蕲蛇酶在生物体内(家兔)表现的药效比降纤酶强。     

广西菲牛蛭消化液中抗凝物质的分离纯化

目的从广西菲牛蛭中分离纯化抗凝物质,并对其生化性质进行测定。方法用三氯醋酸沉析、离子交换、凝胶过滤和高效液相色谱法分离纯化广西菲牛蛭消化液中的抗凝物质,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其蛋白质的相对分子质量(Mr),用等电聚焦法测定蛋白质的等电点。结果从广西菲牛蛭中分离出2种抗凝物质———菲牛蛭素A(BDA)和菲牛蛭素B(BDB),BDAMr约为15 200,等电点为3.97;BDBMr为14 600,等电点为4.61。每1 000 mL菲牛蛭消化液(含抗凝活性10 ATU/mg)可分离出BDA 630μg,收率约为0.303%,比活为2 777.8 ATU/mg,活性收率约为27.8%;BDB 615μg,收率约为0.300%,比活为2 845.5 ATU/mg,活性收率约为28.4%。结论从广西菲牛蛭消化液中分离出的BDA,BDB对凝血酶具有极强的抑制作用,具有广阔的运用前景。     

人精子甘露糖受体的部分特性研究

目的分离纯化人精子甘露糖受体并测定其分子量和等电点。方法用亲和层析法分离纯化人精子甘露糖受体,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其分子量,等电聚焦电泳法测定其等电点。结果人精子甘露糖受体的分子量为66.3 ku,等电点为pH=5.1。结论用亲和层析法分离得到人精子甘露糖受体,并测得其分子量和等电点,可为后续开展人精子甘露糖受体有关理化特性和医用价值的研究积累有价值的资料。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离和纯化

目的研究1种高效分离纯化绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的方法。方法采用硫酸抽提,硫酸铵分级沉淀,缓冲液溶解沉淀,用相对分子质量(Mr)为30 000的超滤膜去除大分子蛋白质,Mr为5 000的超滤膜除盐及小分子蛋白质,亲和色谱纯化,得MBTI,高效液相色谱法(HPLC)和SDS-PAGE电泳法分别测定其纯度和Mr,以酪蛋白为底物测其活性。结果纯化的MBTI经HPLC和SDS-PAGE鉴定为2条蛋白质带,其Mr分别为12 000和8 000,其活性约为大豆蛋白酶抑制剂的3倍。结论超滤法与亲和色谱结合能快速高效地分离纯化MBTI。     

Isolation of the major lethal toxin in the venom of Bungarus flaviceps.

The major lethal toxin in the venom of Bungarus flaviceps has been isolated by ion-exchange chromatography, absorption chromatography and RP-HPLC with a 14-fold purification and an overall yield of 16.5% of the lethal toxicity contained in crude venom. Its sublethal dose (LD(50)) determined in mice weighing 18-20 g was 0.25 (0.19-0.32) microg per mouse. The lethal toxin was pure according to disc- and SDS-PAGE as well as gel HPLC. Its apparent molecular weight determined by SDS-PAGE was 29 kDa. It is a basic protein consisting of two polypeptide chains having apparent molecular weights of 17 and 8 kDa, respectively. The toxin has PLA activity but is free of ACE activity.