人血小板膜糖蛋白VI胞外区片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 探讨在原核细胞中表达人血小板膜糖蛋白Ⅵ（GPVI）胞外区片段，制备其多克隆抗体。方法 采用PCR技术扩增人血小板GPVI胞外区片段123aa～268aa的基因序列，构建其原核表达载体，在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达。表达产物经亲和层析法纯化及鉴定后，免疫家兔制备多克隆抗体。采用已知单克隆抗体进行ELISA双抗夹心法、Westernblot和流式细胞术鉴定其特异性。结果构建的重组质粒经酶切和测序证实序列正确。经诱导表达在相对分子量为4200处有一条明显融合蛋白条带，Westernblot分析证实与预期值一致。所得的抗血清效价为1：128，ELISA双抗夹心法检测表明，所制抗体识别血小板GPVI分子。Westernblot和流式细胞术检测结果显示所制抗体可与血小板裂解液中及血小板膜表面GPVI分子发生特异性免疫反应。结论利用原核细胞表达的人血小板GPVI分子胞外区片段能有效地诱发动物产生多克隆抗体，所得抗体与人血小板上GPVI分子特异性结合，为深入研究GPVI分子提供了工具。     

大鼠PDGF-C基因全长及结构域编码蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌宿主系统中表达血小板衍生生长因子C（PDGFC）基因全长编码的蛋白以及两个结构域编码的蛋白。方法：用PCR方法从已构建好的质粒中扩增出大鼠PDGF-C cDNA开放阅读框架片段（ORF—PDGF—C，1035bp），以及位于N端的CUB结构域（CUD-PDGF-C，333bp）和位于C端的生长因子结构域（GFD-PDGF—C，348bp），并重组入表达载体pET-24a中，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导PDGF—C融合蛋白的表达，经DS-PAGE，表达蛋白采用Western—blot用抗His和抗-PDGF—C的抗体分别验证融合蛋白表达。结果：PCR扩增的PDGFC基因序列与GenBank数据库中的序列一致；37℃，0．1mmol·L^-1IPTG诱导6h，pET-24a-ORFPDGF-C，pET-24a-CUB-PDGF-C，pET-24a-GFD-PDGF-C融合蛋白获得优化表达；Western-blot证实融合蛋白的特异性表达。结论：成功构建了pET-24a-ORF-PDGF-C，pET-24a-CUB-PDGF-C，pET-24a-GFD PDGF-C重组质粒，并在大肠杆菌中获得有效表达，这为进一步纯化该基因表达蛋白以及研究其结构与功能奠定了基础。     

鼠抗人血小板CD36分子单克隆抗体的制备及活性分析

本研究旨在制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的鼠抗人单克隆抗体。提取人肝细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区（Gly30-Asn439）氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMDl8并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒。经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10His真核瞬时表达载体。采用lipofectamine2000转染法,将重组质粒转染至HEK293细胞,表达产物经Ni^2＋2NTA柱层析纯化。以制备的重组CD36蛋白免疫BALB／c小鼠后,取脾与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出阳性克隆,行Western blot检测抗体结合活性。结果显示：RT-PCR扩增获得了1．4kb的片段。经测序,该序列分析结果与GenBank中的NM_001001547．2完全一致。SDS-PAGE证实转染的HEK293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段。鼠单克隆抗体在Westernblot中可以识别重组CD36蛋白,灵敏度达到8ng。结论：成功制备了抗人血小板CD36单克隆抗体,为临床筛选CD36阴性患者及献血员、深入研究人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效的影响提供了实验基础。     

人血管内皮生长因子DNA克隆和在大肠杆菌中的表达

克隆人血管内皮生长因子165(Vascular endothelail growth factor165，VEGF165)并在大肠杆菌中诱导表达。用RT-PCR法从人白血病细胞株TF1扩增VEGF165 DNA片段，将该片段插入质粒pUCmT中并测序鉴定。将测序正确的pUCmT-VEGF165与PET20b( )均用EcoRI和SalI双酶切，回收纯化目的基因片段与表达载体，构建VEGF165的原核表达载体PET20b( )-VEGF165，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，IPTG诱导表达，表达产物用Ni-NTA Resin纯化，SDS-PAGE及Western Blot鉴定重组蛋白。结果表示：1．测序结果示扩增的VEGF165序列与文献报道相符；2．SDS-PAGE电泳示IPTG诱导后出现分子质量约23kd的重组蛋白条带；3．Western Blot分析表明重组蛋白可与兔抗人VEGF单克隆抗体特异性结合。成功克隆、表达及纯化VEGF165，为研究其功能奠定基础。     

TRAIL分子胞外区基因工程蛋白的制备与鉴定

目的 制备人TRAIL配体胞外区基因工程蛋白。方法 应用RT-PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增TRAIL配体胞外区cDNA，克隆入PCR^21载体，测序验证后用基因重组法构建了TRAIL配体胞外区和组氨酸盒的原核表达质粒pQE-hTRAIL。将重组质粒转人大肠杆菌M15中表达，经1mmol／L IPTG在37℃条件下诱导4h，亲和层析柱纯化。用SDS—PAGE电泳和Western blot鉴定表达产物。结果 所表达融合蛋白为人TRAIL配体胞外区分子，分子量30kD。表达量约为2mg／ml。结论 人TRAIL配体胞外区在大肠杆菌中得到良好表达，为深入研究TRAIL配体分子在肿瘤与自身免疫病中的可能应用提供了材料。     

NK4蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化与活性研究

目的通过构建NK4基因的重组原核表达载体,规模化制备NK4蛋白。方法将NK4基因插入载体pET-26b(+),构建重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并转化E.coli Rosseta(DE3)。IPTG诱导转化菌表达NK4蛋白,然后采用Ni-NTA树脂亲和层析进行纯化。观察复性后NK4蛋白对Hela细胞的生物学性状的影响,评价制备的NK4蛋白的生物活性。结果NK4基因重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4获成功构建。转化pET-26b(+)-NK4的E.coli Rosseta(DE3)以包涵体形式大量表达目的蛋白,占菌体总蛋白的42%。经Ni-NTA树脂亲和层析纯化后NK4蛋白纯度约为95%,并经Western blot证实。NK4蛋白行稀释复性后可抑制Hela细胞的贴壁、迁徙并促进其凋亡。结论成功构建NK4基因的重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并可在E.coli Rosseta(DE3)表达。制备的NK4保留了其生物学活性。     

抗CD133单链抗体/白喉毒素DAB389融合蛋白的基因构建、表达、纯化及鉴定

目的构建抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,在大肠杆菌里表达,并鉴定及纯化。方法采用PCR的方法,扩增融合基因DAB389-Linker-CD133(scFV),并插入到原核表达载体pET28a中,构建了重组表达载体pET28a-DAB389-CD133,融合蛋白在BL21(DE3)中表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,通过Ni柱纯化目的蛋白,获得了纯度达95%的DAB389-Linker--CD133(scFV)融合蛋白。Western blot鉴定蛋白活性。流式细胞仪检测能否与CD133抗原特异性结合。结果扩增的片段与理论值一致,序列分析正确;纯化得到纯度为95%的重组蛋白。Western blot分析能特异性地与抗白喉抗体结合。流式细胞仪检测能与CD133抗原特异性结合。结论成功构建了抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,具有结合抗原和免疫毒素双重活性,为进一步靶向治疗奠定了基础。     

登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备

目的构建登革病毒1型（DENV-1）E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应（PCR）扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta（DE3）感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。     

重组人血小板CD36基因真核表达载体的构建及蛋白表达

目的制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的纯化表达蛋白胞外区30～439氨基酸残基段。方法提取人肝细胞组织总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区(Gly30～Asn439)氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMD18并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒。经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10 his真核瞬时表达载体。采用lipofectamine 2000(invitrogen)转染法,将重组质粒转染HEK-293细胞,表达产物经Ni2+2NTA柱层析纯化。结果 RT-PCR扩增获得了1.4 kb的片段。invitrogen测序,该序列分析结果与Genebank中的NM_001001547.2完全一致。SDS-PAGE证实转染的HEK-293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段。结论利用构建的真核载体pTE2-s-CD36转染人胚肾细胞(HEK293)可高效表达CD36 Gly30～Asn439,得到纯化蛋白,为人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效影响的深入研究奠定基础。     

旋毛虫A200711蛋白的原核表达、纯化及其对H7402细胞增殖的影响

目的原核表达旋毛虫抗肿瘤基因A200711,并纯化该蛋白,CCK-8检测其对H7402人肝癌细胞的生长抑制作用。方法 PCR获得A200711基因片段,构建重组表达载体pET-28a(+)-A200711,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)。SDS-PAGE及Western blot检测IPTG诱导后重组菌,采用Ni-NTA亲合层析柱纯化并柱上复性目的蛋白。细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测A200711蛋白对H7402细胞的生长抑制作用。结果成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-A200711,目的蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE及Western blot分析显示,相对分子量约22KD处出现目的蛋白条带,与理论值相符;经Ni-NTA亲合层析柱获得了高纯度可溶性的A200711蛋白;H7402细胞增殖抑制率与A200711蛋白浓度存在量效关系,同时随作用时间的延长增殖抑制率也明显增加。结论成功克隆、表达并纯化了旋毛虫A200711蛋白。A200711蛋白可抑制H7402细胞的增殖,且呈现时效和量效关系,本研究表明旋毛虫A200711蛋白作为潜在的抗肝癌生物制剂有进一步研究的价值。     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达。结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

编码人B7-2胞外区cDNA的克隆、表达及生物活性鉴定

B7-2分子是共刺激信号系统B7/CD28/CTLA-4中的重要成员之一。为了更深入地探讨B7-2分子在调控T细胞增殖，分化及相关信号传导过程中的作用，本研究通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码人B7-2分子胞外区的cDNA，测序后定向插入多个原核表达载体并诱导目的蛋白表达，用Western印迹和MTT鉴定生物活性。结果表明；通过pGEX-4T-2载体实现了在宿主菌BL-21（DE3）-codenplus-RIL中较高水平的表达，蛋白表达量为20%。经Western印迹和MTT鉴定，所表达及初步纯化的B7-2胞外区重组蛋白能与抗人B7-2单抗发生特异性结合；在抗人CD3单抗的协同下，B7-2胞外区重组蛋白能有效地促进外周血单核细胞的增殖。结论：B7-2胞外区重组蛋白的获得为进一步研究B7-2分子结构与功能的关系奠定了基础。     

重组人干细胞因子-血小板生成素融合蛋白的表达及活性初步研究

目的研究重组人干细胞因子-血小板生成素(SCF-TPO)融合蛋白表达的最佳条件及其生物学活性。方法设计引物，利用RT—PCR从胎肝细胞中扩增到SCF和TPO氨基端功能区片段，采用基因融合新策略将其融合成SCF-TPO融合基因，克隆到pGEM—T载体中，构建pET32a／SCF-TPO融合基因原核表达载体，在宿主菌E.eoliBL21(DE3)plysS中经异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导其高表达SCF-TPO，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot检测。目的蛋白经包涵体变性，金属螯合层析纯化，透析复性，用细胞因子依赖细胞系MO7e进行细胞增殖实验。结果获得SCF-TPO融合基因的高表达，表达量占菌体总蛋白的30％以上。Western blot法鉴定表达正确，MTT法证明该融合蛋白具有细胞增殖活性，浓度为100ng／ml时刺激活性更强。结论表达并复性后的重组人SCF-TPO融合蛋白具有刺激MO7e细胞生长活性。     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Veto细胞中的表达

目的 构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体，并将其置于Vero细胞中表达。方法 设计1对PCR引物，在其下游引入Flag序列。通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出s蛋白编码基因，PCR产物经酶切后，插入表达载体peDNA3．1（＋）中，构建重组表达质粒peDNA3．1（＋）-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞，用抗Flag单克隆抗体通过Westernblot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果 酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确；Western blot证实重组S蛋白片段能够在Veto细胞表达。结论 融合Flag序列的SAPS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

人降钙素原的原核表达、纯化和鉴定

目的构建人降钙素原(procalcitonin,PCT)原核表达载体,获得高纯度PCT重组蛋白。方法根据NCBI上PCT基因序列设计引物,利用PCR技术扩增PCT基因,构建PCT/p ET-22b(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21中诱导表达;采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,用western blot和胶体金法对其进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物约为350 bp。同源性比对分析结果表明,PCT基因片段(348 bp)成功插入p TG19-T载体,未出现碱基突变。用Bam HⅠ和HindⅢ对重组表达载体双酶切,得到约为350 bp和5 500 bp片段。SDS-PAGE电泳显示PCT重组蛋白以可溶性形式存在,Mr约14 000,经镍柱亲和层析法纯化后即可获得。western blot和PCT胶体金法结果呈阳性,显示融合蛋白含组氨酸标签(His-tag),成功表达出PCT重组蛋白。结论应用重组DNA技术成功构建PCT基因融合重组表达载体,通过蛋白质表达纯化技术获得PCT融合蛋白。     

弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆与原核表达

目的 克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）基因，构建原核表达载体，并表达该重组蛋白。方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入BamHI和XhoⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段，插入克隆载体pMD18-T，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，插入原核表达质粒pET28a，重组子双酶切、PCR和测序鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株cD-NA中扩增出693bp的HXGPRT基因片段；含pET28a／HXGPRT的宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物，Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别，获得纯化的重组蛋白。结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因，构建pET28a／HXGPRT重组质粒，并高效表达．为进一步研究提供了条件。     

特发性血小板减少性紫癜患者IgG酶切片段F(ab'')2的免疫活性及其对血小板聚集功能的影响

目的制备特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者血浆IgG及其酶切片段，探讨其与血小板GPⅡb／Ⅲa和（或）GPⅠb／Ⅸ结合的免疫活性及其对正常人血小板聚集功能的影响。方法用改良MAIPA法和比浊法血小板聚集试验筛选出自身抗体阳性并且能抑制血小板聚集的患者，用蛋白A柱纯化其血浆IgG抗体并用胃蛋白酶制备F（ab’）2片段，改良单克隆抗体俘获血小板抗原技术（MAIPA）检测完整抗体及其酶切片段与血小板膜糖蛋白的结合活性；比浊法血小板聚集试验对比观察ITP患者血浆、纯化的IgG抗体及其酶切片段对正常人血小板聚集功能的影响。结果①68例慢性ITP患者中，34例（53．6％）血浆中抗GPⅡb／Ⅲa和（或）GPⅠb／Ⅸ自身抗体阳性，其中5例（14．7％）明显抑制了二磷酸腺苷（ADP）或瑞斯托霉素对血小板聚集的诱导作用；②用蛋白A柱结合蛋白酶酶切成功获得了纯化的IgG及F（ab’）2片段；③患者纯化的IgG及F（ab’）2片段均具有抗GPⅡb／Ⅲg或GPⅠb／Ⅸ活性，但去除IgG的血浆丧失了与GPⅡb／Ⅲa或GPⅠb／Ⅸ的结合活性；④2例患者纯化的IgG及其F（ab＇）2片段抑制ADP诱导的血小板聚集。结论F（ab’）2片段是IgG自身抗体的功能片段，它不但保留了良好的抗原结合活性并可抑制血小板聚集功能，其抑制聚集作用呈剂量依赖性。     

人心肌肌钙蛋白I基因的原核表达及抗体制备

目的进行人心肌肌钙蛋白I（cardiac troponinI，cTnI）基因原核表达载体的构建，获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni—NTA树脂纯化，纯化后的融合蛋白免疫小鼠，制备抗血清。通过ELISA，Western blot鉴定血清效价和特异性。结果成功构建了cTnI的原核表达载体，并在大肠埃希菌中荻得了高效表达。Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体。结论成功表达了cTnI蛋白并制备了其特异性抗体。