胰腺干细胞和胰岛细胞在糖尿病 大鼠治疗中的疗效观察

目的 探讨大鼠胰腺干细胞与胰岛细胞移植在大鼠糖尿病治疗中的疗效。方法 通过链脲菌 素复制1 型糖尿病大鼠模型并随机分为胰岛细胞组和胰腺干细胞组。用胶原酶V 分别消化新生和成年大鼠 胰腺,Percoll 梯度离心分离胰岛细胞和胰腺干细胞。采用Bonner-Weir 法诱导胰腺干细胞分化,DTZ 染色 检测移植物纯度,AO/PI 检测移植物活性。分别记录手术前后大鼠血糖水平、胰岛素水平及移植物存活时 间;高糖刺激实验和腹腔糖耐量评价移植物功能;取各组大鼠移植部位标本行HE 染色和免疫组织化学染 色,观察组织形态学变化。结果 胰岛细胞组和胰腺干细胞组血糖分别在术后3 和5 d 恢复正常（P <0.05）, 两组大鼠术后不同时间点的血糖有差异（P <0.05）,胰腺干细胞组的降糖能力强于胰岛细胞组（P <0.05）。 两组大鼠移植后7 d 血清胰岛素水平均较术前升高（P <0.05）。高糖刺激实验表明,各组移植后15 和65 d 高糖刺激后的C 肽水平较刺激前升高（P <0.05）,胰岛细胞组移植后65 d 高糖刺激后C 肽水平低于胰腺 干细胞组（P <0.05）,胰岛素和C 肽水平监测结果表明胰腺干细胞组移植物胰岛素分泌维持时间长于胰岛 细胞组。移植后腹腔糖耐量实验结果表明移植物均功能良好。胰岛细胞组和胰腺干细胞组移植物的中位 存活时间分别为73 和88 d,Kaplan-Meier 曲线分析提示胰腺干细胞组移植物生存时间较胰岛细胞组延长 （P <0.05）。HE 染色提示肝脏门静脉移植区域可见新生血管包绕的胰岛细胞团,免疫组织化学染色证实细 胞团胰岛素阳性。结论 胰腺干细胞分化后经门静脉移植能安全有效地发挥降糖作用,疗效优于胰岛细胞 移植。     

NOD小鼠胰岛分离与纯化的方法研究

目的 :研究非肥胖性糖尿病 (NOD)小鼠胰岛分离与纯化的方法。方法 :采用改良的胰导管逆行灌注胶原酶静止消化胰腺 ,分离成年NOD小鼠胰岛 ,不连续密度梯度Ficoll液 (2 5 % ,2 3% ,2 0 5 % ,11% )离心、纯化胰岛。用双硫棕 (Dithizone ,DTZ)对胰岛进行特异性染色 ,以葡萄糖刺激胰岛素释放检测胰岛功能。结果 :不同浓度 (0 5mg·ml-1,1mg·ml-1,2mg·ml-1)的胶原酶在不同时间 (2 0min ,4 0min ,6 0min)内静止消化胰腺后收获的胰岛数量和胰岛活性不同 ,采用 1mg·ml-1浓度的Ⅺ型胶原酶消化 4 0min后效果最好 ,平均能得到 (195± 8)个胰岛 /胰腺 ,活性 >90 % ,纯度 >90 %。DTZ染色后胰岛呈红色 ,形态完整。高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激后的 2倍。结论 :改良的胰导管逆行灌注胶原酶静止消化NOD鼠胰腺 ,及不连续密度梯度Ficoll液纯化胰岛的方法 ,可获得数量较多 ,纯度较高和功能较好的胰岛。     

急性高血糖影响小鼠第一时相胰岛素分泌的机制

目的 观察急性高血糖影响小鼠第一时相胰岛素分泌的功能及形态学变化特点。方法 给C57/BL 6J小鼠完成颈静脉插管后输注20%高糖溶液4 h,建立急性糖毒性小鼠模型,行腹腔葡萄糖耐量实验（intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）及口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test,OGTT）评价葡萄糖耐量及胰岛素分泌功能。HE染色及电镜观察胰岛形态变化及细胞内胰岛素分泌颗粒亚细胞结构变化。结果 IPGTT实验中急性糖毒性组15 min血糖值较对照组显著增加[（10.3±0.33） mmol/L vs （19.3±1.66） mmol/L],上升87%（P<0.05）,OGTT实验中30 min血糖值较对照组显著增加[（9.8±0.31） mmol/L vs （18.16±1.01） mmol/L],升高85%（P<0.05）,且早期胰岛素分泌高峰受损且分泌延迟。GSIS实验中急性糖毒性组在基础状态时（葡萄糖浓度2.8 mmol/L）和高糖（16.7 mmol/L）刺激后,胰岛素分泌较对照组显著降低[（0.481±0.003） ng/mL vs （0.702±0.121） ng/mL,（2.43±0.03） ng/mL vs （4.07±0.34） ng/mL],分别下降46%和67%（P<0.05）;胰岛素含量测定结果显示,急性糖毒性组比对照组降低[（97.01±2.05） ng/mL vs （65.12±0.42） ng/mL,（121.40±0.58） ng/mL vs （62.7±0.48） ng/mL],下降49%和94%（P<0.05）。HE染色显示急性糖毒性胰岛边界不规则、内部细胞排列不整;透射电镜可见细胞内胰岛素分泌颗粒空泡,线粒体嵴断裂。结论 急性葡萄糖毒性使胰岛β细胞内胰岛素储备减少,导致第一时相分泌胰岛素峰值降低及延迟。     

小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.     

人胰岛的分离纯化和功能评价

目的 应用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化人的胰岛,并进行功能和安全性的评价.方法 获得6例成人尸体胰腺组织供体,采用胶原酶消化法及密度梯度离心法分离和纯化胰岛,并分析胰岛的数量、纯度和活力.采用免疫荧光法分析胰岛内分泌细胞的组成和分布;检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胰岛移植后的动物血糖水平.并对分离胰岛的安全性指标进行评价.结果 分离纯化后的胰岛数量为(22.9±3.1)万IEQ,纯度为(59.0 ±8.9)%,活力为(89.0±3.0)%.免疫荧光显示,胰岛由4种内分泌细胞组成并呈正常分布.葡萄糖刺激胰岛素释放的刺激指数为8.1 ±4.0.胰岛移植于糖尿病裸鼠后,血糖在3 d后降至正常水平并维持超过30 d.分离胰岛样本的各项安全性指标在规定范围之内.结论 采用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化的胰岛在形态、结构、数量、纯度、活力、体内外功能以及安全性方面都达到临床胰岛移植的标准,为开展临床胰岛移植奠定了基础.     

齐墩果酸对糖尿病小鼠胰岛损伤的保护作用

目的 观察齐墩果酸对糖尿病小鼠胰岛损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法 建立链脲佐菌素 (STZ) 诱导的糖尿病小鼠模型,ig 给予齐墩果酸3周。实验期间监测小鼠体质量、血糖的变化,实验结束后检测小鼠血清胰岛素浓度以及血清和胰腺中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 的活性以及丙二醛 (MDA) 的量。通过胰腺 HE 染色和胰岛素免疫组化分析胰岛的病理变化,应用 Western blotting 法检测胰腺组织中 NF-κB p65 和 IκBα 蛋白表达量的变化。结果 齐墩果酸能增加糖尿病小鼠的体质量,降低糖尿病小鼠的空腹血糖,升高血清中的胰岛素浓度,显著提高血清和胰腺中 SOD 和 CAT 的活性,MDA 水平显著降低。HE 染色等形态学检测显示齐墩果酸能减轻小鼠胰岛萎缩,增加胰岛β细胞的数目。Western blotting 结果显示齐墩果酸增加胰腺组织内 IκBα 的表达,降低 NF-κB p65 蛋白表达。结论 齐墩果酸能减轻 STZ 诱导的胰岛损伤,可能是通过减轻氧化应激水平,减弱胰岛内 NF-κB 信号通路的过度激活而发挥保护作用。     

人GLP-1(7-36)酰胺对非肥胖型糖尿病小鼠胰岛炎的影响

目的通过观察人胰高糖素样肽1（GLP-1）刺激后非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠胰岛组织形态学的变化,研究GLP-1对NOD 1型糖尿病小鼠胰岛炎的影响。方法 GLP-1治疗组小鼠用微型渗透泵皮下持续泵入人GLP-1,对照组小鼠泵入生理盐水,4周后将其胰腺组织做HE染色、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Br-dU）/胰岛素双重免疫染色及导管细胞角蛋白（DCK）/胰岛素双重免疫荧光染色,观察小鼠胰岛炎的变化及胰岛β细胞的复制和胰腺导管上皮β细胞的新生。结果与对照组相比,GLP-1治疗组NOD小鼠胰岛单核细胞浸润明显减轻,胰岛炎评分明显下降（P〈0.001）。GLP-1治疗组胰岛可见较多BrdU阳性的β细胞和胰岛素阳性的导管上皮细胞,而在对照组几乎看不到。结论人GLP-1持续刺激NOD小鼠后,可使1型糖尿病小鼠胰岛炎减轻并促进β细胞再生。     

一种简易高效的建立小鼠胰岛移植模型的方法

目的 探索一种简便高效的建立小鼠胰岛移植模型的方法。方法 摘取四只BALB/c小鼠的胰腺,0.25mmPenfine针对胰腺反复多点注射胶原酶P后静止消化20min;采用自制的推进式离心管,以单一密度梯度Ficoll液(1.088g/ml)纯化胰腺消化物,双硫腙对胰岛进行特异性染色,利用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能;纯化后的胰岛移植到实验性糖尿病C57小鼠的肾包囊下,术后观察其血糖变化。结果 纯化后共得到（789.6±26.4）个胰岛细胞当量（IEQ）,平均纯度为（77.12±3.23）％;胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的2.35倍（P<0.01）。移植后可逆转糖尿病小鼠的高血糖平均达（16.3±2.9d）。结论 提供了快速获取小鼠胰岛细胞的方法,为胰岛移植的实验研究建立了一种简易高效的制作动物模型的方法。     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的寻找简便、高效的大鼠胰岛分离纯化方法,并对纯化胰岛细胞的基本生物学状况进行鉴定。方法采用胰管内注射胶原酶水浴消化以及Ficoll400不连续密度梯度离心法纯化,用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;用AO/PI染色计算胰岛细胞存活率;通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验和糖尿病大鼠移植判定胰岛细胞功能。结果纯化后获得(738±193)个胰岛细胞/每只胰腺,纯度为(77±13)%,纯化后细胞形态完好,活度大于95%,体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,低糖情况下胰岛素分泌量为(24.31±5.47)mIU/L,高糖情况下为(37.62±4.29)mIU/L,两者有显著性差异(P<0.05),胰岛移植后,实验组48h后血糖值降至正常,维持(3.9±1.7)d。结论采用胰管内胶原酶灌注进行大鼠胰岛分离及Ficoll400不连续密度梯度法纯化可获得较高纯度和活度的胰岛细胞。     

一种简易高效建立小鼠胰岛移植模型的方法

目的探索一种简便高效建立小鼠胰岛移植模型的方法。方法摘取4只C57BL/6小鼠的胰腺,0.25 mm penfine针对胰腺反复多点注射胶原酶P后静止消化20 min;采用自制的推进式离心管,以单一密度梯度Ficoll液(1.088 g/ml)纯化胰腺消化物,双硫腙对胰岛进行特异性染色,利用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能;纯化后的胰岛移植到实验性糖尿病BALB/c小鼠的肾包囊下,术后观察其血糖变化。结果纯化后共得到(789.6±26.4)个胰岛细胞当量(IEQ),平均纯度为(77.12±3.23)%;胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的2.35倍(P<0.01)。移植后可逆转糖尿病小鼠的高血糖平均达(16.3±2.9)d。结论提供了快速获取小鼠胰岛细胞的方法,为胰岛移植的实验研究建立了一种简易高效的制作动物模型的方法。     

犬胰岛的分离与纯化

目的探讨影响胰岛分离与纯化结果的相关因素,寻找获得足够数量、高纯度、具有活性的胰岛细胞的方法,为临床胰岛移植应用提供实验基础。方法寻找自动分离技术连续分离22只犬的胰岛,连续性密度梯度离心法纯化胰岛,观察分离纯化出来的胰岛细胞大体形态、超微结构,用葡萄糖刺激释放实验检验其活性。结果纯化前胰岛计数平均为（155040±310）IEQ／胰腺,纯化后的胰岛平均计数为（74200±185）IEQ／胰腺,纯度约为（89．4±2．6）％,回收率约为（47．8±1．3）％,活率达到（93．0±1．7）％。胰岛分离纯化的结果无论在数量上还是在质量上都随着分离技术的不断更新,操作技术的娴熟而有很大提高。葡萄糖刺激释放实验显示低糖组与高糖组比较P〈0．001,提示分离纯化后获得的胰岛功能状态良好。结论从犬中分离和纯化出足够数量的胰岛细胞,可用于临床研究。     

NOD小鼠胰岛分离与纯化的方法研究

OBJECTIVE: To investigate the method of isolating and purifying islets in non-obese diabetic (NOD) mice. METHODS: The isolation of adult NOD mice pancreatic islets was carried out by stationary digestion after pancreatic ductal injection of collagenase solution. A discontinuous Ficoll solution (25%, 23%, 20.5%, 11%) was applied to the purification of the islets. The specificity of the islets was determined by dithizone(DTZ) staining, and the function was evaluated by the glucose stimulating insulin releasing test. RESULTS: The yield and activity of the islets varied with different concentration collagenase and digesting times. After incubation of the pancreas with 1.0 mg.ml-1 Type XI collagenase for 40 min, each pancreas could yield (195 +/- 8) islets, with viability > 90% and purity > 90%. The islets were red and intact after DTZ staining. The insulin from the islets fed with high concentration glucose was 2 times that with low concentration. CONCLUSION: The modified method of pancreatic ductal collagenase injection, followed by stationary digestion and purification of islets with a discontinuous Ficoll solution, can reproducibly yield various and pure islets.     

糖尿病小鼠左肾被膜下胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立

目的：建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型及探讨胰腺外分泌细胞对胰岛移植物的损伤作用.方法：（1）体内实验：采用胆总管内逆行灌注胶原酶联合淋巴细胞分离液的方法来分离纯化胰岛,人工挑取胰岛细胞并收集胰腺外分泌细胞.链脲佐菌素腹腔注射诱导BALB/C小鼠成为糖尿病小鼠.单纯移植组（n=10）每只小鼠于左肾被膜上极移植胰岛细胞250个,共同移植组（n =10）每只小鼠于左肾被膜上下极同时移植胰岛细胞250个和等体积的胰腺外分泌细胞,持续观测血糖及生命体征变化,1个月后切除左肾并继续检测血糖.（2）体外实验：利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,利用台盼蓝染色鉴定胰岛细胞的活性,以及用葡萄糖刺激胰岛素释放实验来检测胰岛功能.结果：（1）胰岛移植后,单纯移植组及共同移植组血糖均逐步降至正常,共同移植组较单纯移植组血糖恢复正常时间延迟,移植术后第2,3,4,5天,单纯移植组受鼠血糖低于共同移植组,差异有统计学意义（P＜0.05）.切除两组受鼠左肾3d后,两组受鼠血糖均＞21 mmol/L.（2）每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=2.90）.结论：（1）成功建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型.（2）胰腺外分泌细胞与胰岛细胞同时移植会延迟植入胰岛功能恢复正常的时间.     

Activated pancreatic stellate cells can impair pancreatic islet function in mice

Background

Pancreatic or islet fibrosis is often associated with activated pancreatic stellate cells (PSCs). PSCs are considered not only to promote fibrosis, but also to be associated with glucose intolerance in some diseases. We therefore evaluated morphological and functional relationships between islets and PSCs in the normal mouse pancreas and transplanted islets.

Methods

Immunohistochemistry was used to map the presence of PSCs in the normal mouse pancreas and islets implanted under the renal capsule. We isolated and cultured mouse PSCs and characterized them morphologically by immunofluorescence staining. Furthermore, we measured their cytokine production and determined their effects on insulin release from simultaneously cultured islets.

Results

PSCs were scattered throughout the pancreas, with occasional cells within the islets, particularly in the islet capsule. In islet transplants they were found mainly in the graft periphery. Cultured PSCs became functionally activated and produced several cytokines. Throughout the culture period they linearly increased their production of interleukin-6 and mammalian keratinocyte-derived chemokine. PSC cytokine production was not affected by acute hyperglycemia. Syngeneic islets co-cultured with PSCs for 24–48 h increased their insulin release and lowered their insulin content. However, short-term insulin release in batch-type incubations was unaffected after 48 h of co-culture. Increased islet cell caspase-3 activation and a decreased islet cell replication were consistently observed after co-culture for 2 or 7 days.

Conclusion

Activated PSCs may contribute to impaired islet endocrine function seen in exocrine pancreatitis and in islet fibrosis associated with some cases of type 2 diabetes.     

三种消化酶分离胰岛对移植胰岛存活的影响

目的 比较三种消化酶分离胰岛的效率和质量及对移植胰岛存活的影响,为临床胰岛移植消化酶的选取提供参考.方法 相同条件下采用Liberase TL(A1组)、Collagenase P(B1组)和Collagenase V(C1组)(n=35)消化酶消化小鼠胰腺,Ficoll-400密度梯度纯化获得胰岛;DTZ染色观察胰岛细胞形态,并计算IEQ(直径＞150 μm的胰岛细胞团定义为1个IEQ)和纯度;锥虫蓝染色检测胰岛细胞成活率.C57BL/6糖尿病(DM)小鼠作为受体分为A2、B2和C2三组(n=7),采用同基因胰岛肾被膜下移植,监测术后血糖浓度变化;于移植成功后15 d切取移植物,HE染色观察组织学变化.结果 3种消化酶分离C57BL/6小鼠胰腺可获得的IEQ、胰岛纯度和胰岛细胞成活率均为A1组＞B1组＞C1组,三组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).每只受体小鼠移植(900±30)个IEQ胰岛;移植前各组小鼠血糖浓度比较差异均无统计学意义(P＞0.05);植术后第2天血糖浓度达最低值,第3天有一个短暂的回升,随后达到一个相对较平稳的状态,至第13天血糖浓度依次为A2组＜B2组＜C2组,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).HE染色显示A2组胰岛形态完整,胞质、胞核区分明显,存活状态良好,炎症浸润不明显;B2组呈圆形或椭圆形,胞质淡染,多核,炎症细胞浸润较A2组多;C2组炎症细胞浸润明显,伴胰岛破坏,形态欠规则.结论 与Collagenase P和Collagenase V比较,Liberase TL消化小鼠胰腺可提高胰岛细胞团的收获量、活性和功能.     

一种简单快速分离纯化小型猪胰岛的方法

目的 探索一种简单快速分离纯化小型猪胰岛的方法。 方法 摘取小型猪胰腺,经胰管插管后注入胶原酶V,用自制的半自动消化分离装置消化,胰腺消化物经自制的推进式离心管及单一密度（1.096g/ mL）的ficoll400纯化后行双硫腙（DTZ）染色,倒置显微镜下观察计数胰岛的数量及纯度,胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。结果 纯化后平均每克小型猪的胰腺可以获得（2 645 ±234）个胰岛细胞当量（IEQ）,平均纯度为（74.2 ±5.1）%。纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时的胰岛素释放量为低糖时的3.14倍(P<0.01)。 结论 为小型猪胰岛细胞的研究建立了一种简单快速分离纯化胰岛的方法,纯化后的胰岛细胞功能良好。