腺病毒介导的 NT- 3基因在大鼠坐骨神经的表达

目的观察腺病毒介导的神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因在大鼠坐骨神经雪旺细胞(Schwanncells,SCs)的表达。方法NT-3重组腺病毒在293细胞中培养繁殖并测定滴度后,直接注入大鼠损伤修复的坐骨神经内,不同时间点取材,采用免疫组织化学染色检测NT-3蛋白的表达,并用LEICAM550型图像分析仪对坐骨神经切片NT-3免疫组化染色强弱进行定量评价。结果坐骨神经损伤修复后直接注射Ad-NT-3,2d后出现NT-3免疫组化染色阳性产物,主要位于吻合口附近,阳性产物呈平行条纹状排列,7d时显著增加(与2d组相比,P<0.01),14d和28d时有所下降(与7d组相比,P<0.01),两者差异无显著性意义(P>0.05),但与2d组相比,仍维持在较高的水平(P<0.01)。而正常坐骨神经、损伤修复后注射Ad-LacZ或生理盐水的坐骨神经NT-3免疫组化染色结果为阴性。结论NT-3基因能通过腺病毒介导转入损伤修复后周围神经的SCs并表达NT-3蛋白,为腺病毒介导神经营养因子基因治疗促进周围神经损伤再生提供了初步的理论和实验依据。     

腺病毒介导的NT—3基因在大鼠从骨神经的表达

目的观察腺病毒介导的神经营养素 - 3(neurotrophin- 3,NT- 3)基因在大鼠坐骨神 经雪旺细胞 ( Schwann cells,SCs) 的表达.方法 NT- 3重组腺病毒在 293细胞中培养繁殖并 测定滴度后,直接注入大鼠损伤修复的坐骨神经内,不同时间点取材,采用免疫组织化学染 色检测 NT- 3蛋白的表达,并用 LEICA M550型图像分析仪对坐骨神经切片 NT- 3免疫组化染色 强弱进行定量评价.结果坐骨神经损伤修复后直接注射 Ad- NT- 3,2 d后出现 NT- 3免疫组化 染色阳性产物,主要位于吻合口附近,阳性产物呈平行条纹状排列,7 d时显著增加 ( 与 2 d组相比,P< 0.01),14 d和 28 d时有所下降 ( 与 7 d组相比,P< 0.01),两者差异无显著 性意义 ( P >0.05),但与 2 d组相比,仍维持在较高的水平 ( P< 0.01).而正常坐骨神经、 损伤修复后注射 Ad- LacZ或生理盐水的坐骨神经 NT- 3免疫组化染色结果为阴性.结论 NT- 3基因能通过腺病毒介导转入损伤修复后周围神经的 SCs并表达 NT- 3蛋白,为腺病毒介导神经 营养因子基因治疗促进周围神经损伤再生提供了初步的理论和实验依据.     

大鼠VEGF腺病毒基因转染系统的构建及鉴定

目的:探讨构建携带大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)的重组腺病毒载体方法，为后续的基因转染研究作准备。方法:采用RT-PCR扩增的方法获取鼠源性的VEGF,并克隆入穿梭质粒pDC316。构建的质粒pDC316-VEGF经酶切及测序鉴定正确后，通过lipofectamine2000的介导与腺病毒包装质粒pBHGE3共转染至人胚肾细胞HEK293，经同源重组后获得携带鼠VEGF的重组腺病毒VDC316-VEGF。应用PCR鉴定重组腺病毒，空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒。以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度。结果:PCR鉴定证实重组腺病毒含有鼠VEGF,病毒滴度为3×109pfu/mL。结论:成功构建的携带大鼠VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,可作为后续基因治疗研究工作中可靠的基因转染工具。     

重组Akt腺病毒的构建及其在肝硬化大鼠肝脏中的表达

目的:探讨持续活化Akt且带有HA标签(myr-HA-Akt)基因的重组腺病毒在肝硬化大鼠肝脏中的表达特性。方法:酶切正向插入目的基因的真核表达载体pcDNA3.1-myr-HA-Akt,获得myr-HA-Akt cDNA后，将其定向克隆到穿梭质粒pDC316中,然后将重组质粒与病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293 细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt,并进行扩增、纯化。通过观察腺病毒感染293细胞后是否出现细胞病变效应;PCR和基因测序方法对所构建病毒进行鉴定，并采用TCID50法检测病毒滴度。自尾静脉注射重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt感染肝硬化模型大鼠。免疫印迹法检测大鼠肝组织内Akt 和p-Akt蛋白的表达。结果:感染的293 细胞出现明显的细胞病变效应，PCR产物电泳证实重组腺病毒的存在，基因测序证实myr-HA-Akt的cDNA正确插入穿梭质粒且与pBHGloxΔE1,3Cre正确同源重组;病毒滴度为5.5×1011 vp/mL。从蛋白水平证实感染病毒的肝硬化模型大鼠有外源性Akt基因的表达。结论:构建的重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt能有效地感染肝硬化模型大鼠,并可在模型大鼠中正确转录和翻译，为进一步研究腺病毒介导的Akt基因对肝硬化的治疗奠定了实验基础。     

人β干扰素基因重组腺病毒载体的构建及在骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建人β干扰素(hIFN-β)基因重组腺病毒,观察重组腺病毒介导的hIFN-β转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后,细胞内hIFN-β表达情况以及重组腺病毒对MSCs生长的影响.方法 利用细菌内同源重组技术快速构建Ad-hIFN-β腺病毒重组质粒,经酶切及测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组Ad-hIFN-β腺病毒,并进行滴度测定.转染的MSCs行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内hIFN-β mRNA的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测培养液上清hIFN-β的分泌情况;噻唑蓝(MTF)比色法检测细胞活力并绘制转染后MSCs生长曲线.结果 经限制性内切酶检测、基因测序及和绿色荧光观察证实成功的构建了携带hIFN-β基因的重组腺病毒,且重组腺病毒滴度高达1×109pfu/ml.Ad-hIFN-β转染MSCs后在荧光显微镜下证实有绿色荧光;RT-PCR证明转染的MSCs内有hIFN-β mRNA的表达;ELISA检测转染组1、3、5、7、10、15、20 d上清液中hIFN-β蛋白分泌量分别为192、273.436、957、605、472、279 ng/L,明显高于对照组(P<0.01);Ad-hIFN-β转染的MSCs生长曲线与正常培养MSCs差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功构建了携带hIFN-β基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒转染对MSCs的增殖能力无明显影响,而且Ad-hIFN-β转染大鼠MSCs能够表达并分泌hIFN-β蛋白.     

Stra8基因启动子逆转录病毒包装细胞株的建立

目的:建立小鼠Stra8基因启动子控制绿色荧光蛋白EGFP表达(P(stra8)-EGFP)的逆转录病毒包装细胞株,以方便地将P(stra8)-EGFP转导到目的细胞,为生殖细胞鉴定分选提供基础.方法:PCR扩增小鼠基因组DNA中的Stra8基因启动子片段,构建Stra8基因启动子控制表达的EGFP报告基因逆转录病毒质粒.将质粒脂质体法转染PT67病毒包装细胞,G418抗性筛选后,梯度稀释法将包装细胞单克隆化并扩增成多个细胞株.以包装细胞培养上清液感染NIH3T3细胞的所形成的G418抗性阳性细胞数定义病毒滴度,确定高滴度病毒包装细胞株.通过染毒小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)验证该细胞株的P(stra8)-EGFP转导效果.结果:所建立的病毒包装细胞株培养上清液滴度达到1.3×10(6) cfu/ml.MSC经包装细胞培养上清液感染后,在(retinoic acid,RA)诱导下能表达EGFP蛋白.结论:成功构建了将P(stra8)-EGFP转导到目的细胞的PT67逆转录病毒包装细胞株.     

人TGF-β1基因腺病毒载体的构建及对骨髓基质干细胞的定向诱导分化作用

目的构建人转化生长因子β1(TGF-β1)基因腺病毒真核表达载体,并观察感染骨髓基质干细胞(MSCs)后目的基因的表达和对细胞生物学行为的影响。方法以复制缺陷的腺病毒Adeno-X为基因载体,制备携带TGF-β1基因的高滴度腺病毒液感染人MSCs,通过免疫细胞化学、原位杂交、己糖醛酸水平检测及甲苯胺蓝染色等方法鉴定外源基因的表达,分析TGF-β1基因转染对MSCs定向软骨分化的调控机制。结果腺病毒感染MSCs后免疫细胞化学染色证实外源基因编码蛋白的表达,通过原位杂交检测出Ⅱ型胶原蛋白基因mRNA,细胞培养液中己糖醛酸水平明显升高。结论成功构建人TGF-β1基因腺病毒表达载体,证实其在MSCs中的表达和具有向软骨细胞定向分化的诱导作用,为软骨缺损修复的局部基因治疗奠定实验基础。     

低氧诱导因子-1的病毒载体制备及感染效果

目的 制备低氧诱导因子(HIF)-1腺病毒载体并评价其对表皮角质细胞的感染效果.方法 Ad/HIF-1质粒经酶切鉴定后,以4μg质粒转染1.2×106个HEK293细胞,2 d后荧光显微镜下观察转染效率.1周后收集细胞及上清并感染HEK293细胞进行病毒扩增,待扩增的细胞及上清量达300 ml时进行病毒纯化及滴度测定.最后用制备的病毒载体感染表皮角质细胞,流式测定其感染效果.结果 Ad/HIF-1质粒酶切鉴定正确;转染或感染HEK293细胞后有绿色荧光蛋白(GFP)表达;获得的腺病毒滴度为1.8×1011PFu/ml.病毒以MOI=50感染表皮细胞,2 d后GFP阳性细胞的比例为97.46%.结论 成功制备了HIF-1腺病毒载体,且感染表皮角质细胞后能得到较高的感染效率,从而为腺病毒介导的基因功能研究提供理论基础.     

腺病毒载体介导蛋白激酶B基因转染大鼠胰岛的研究

目的 观察携带外源基因的腺病毒在体外感染胰岛及外源基因在胰岛中的表达.方法 构建表达Akt1的腺病毒载体(Ad5-Akt1).按病毒细胞比(MOI值)500感染新分离的胰岛.通过免疫印迹分析(Western blot)测定胰岛培养上清液中Akt1的表达.结果 (1)成功构建了携带Akt1基因的腺病毒载体Ad5-Akt1,所获得病毒滴度为5.3×109pfu/ml;(2)表达增强型绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad5-EGFP)和Ad5-Akt1在体外可以感染胰岛,其中Ad5-EGFP转染率可达60%～70%.在Ad5-Akt1腺病毒感染的胰岛培养上清液中检测到了Akt1蛋白的表达.结论 腺病毒在体外可以有效感染大鼠胰岛,且携带的外源基因可以在胰岛细胞中稳定表达.     

NICD基因转染对胰腺腺泡细胞凋亡的影响

目的 观察重组腺病毒介导的NICD基因对胰腺腺泡细胞凋亡的影响.方法 在293细胞中培养扩增重组腺病毒Ad-NICD,当细胞汇合度达到60％～70％时,用蚀斑形成实验测定其感染滴度;将该病毒感染胰腺腺泡细胞AR4-2J (48 h)通过实时定量聚合酶链反应(PCR)检测其表达.同时分对照组(未转染组)、Ad-CMV转染组、Ad-NICD转染组分别用Ad-CMV( MOI:100)和Ad-NICD( MOI:100)转染AR4-2J细胞,采用Annexin V/PI双标流式细胞术检测Ad-NICD对细胞凋亡的影响.结果 重组腺病毒Ad-NICD滴度为2.2×1010 pfu/L,病毒颗粒感染腺泡细胞可以有效地提高NICD的表达,在MOI为100时,NICD的表达量最高.Ad-NICD感染胰腺腺泡细胞后,雨蛙素诱导的细胞凋亡率为(7.32±1.67)％,与对照组(18.55±2.61)％及Ad-CMV转染组(19.76±4.28)％比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组腺病毒介导的NICD基因转染可以显著抑制雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞凋亡,这种抑制可能与急性胰腺炎的严重程度有关.     

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及转染骨髓间充质干细胞的研究

目的 构建骨形成蛋白(BMP)7重组腺病毒，使其转染骨髓间充质干细胞并在细胞内得到表达。方法 将BMP7基因克隆到转移载体pAdTrack—CMV中，在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组，得到BMP7重组腺病毒基因组，通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP7重组腺病毒转染分离纯化后的骨髓间充质干细胞，鉴定BMP7在细胞内的表达。结果 经过多聚酶链反应(PCR)及酶切鉴定证明获得了BMP7转移质粒padTrack—BMP7和BMP7重组腺病毒基因组，并包装出重组腺病毒。逆转录PCR和免疫组织化学证明BMP7在重组腺病毒转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。结论 BMP7重组腺病毒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达，为BMP7基因治疗的研究奠定了基础。     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的构建转化生长因子β3（transforming growth factor β3，TGF-β3）的腺病毒载体，并通过腺病毒载体将TGF-β3基因转染骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs），使其在细胞内得到表达。方法将人TGF-β3质粒定向克隆进入穿梭质粒pAdTrack—CMV中，与pAdEasy-1共同转入细菌并重组，获得TGF-β3重组腺病毒质粒，用脂质体法导入包装细胞HEK293中，48～96h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。取1月龄新西兰大白兔5只，取其胫骨骨髓。采用密度梯度离心法分离纯化MSCs，并进行传代。取传至第3代细胞采用TGF-β3腺病毒载体转染，10h后荧光显微镜观察绿色荧光表达，转染TGF-β3重组腺病毒4d后的MSCs用免疫细胞化学方法观察TGF-β3在细胞内的表达。结果pAdEasy—TGF-β3转染HEK293细胞48～96h后，荧光显微镜可见明显的绿色荧光表达。兔骨髓分离培养10d后，培养MSCs融合达70％～80％、贴壁紧密，细胞形态均一，似成纤维细胞；14d完成原代细胞培养。TGF-β3重组腺病毒转染MSCs17h后，荧光显微镜下出现少量绿色荧光，48～72h荧光加强，荧光与MSCs轮廓一致。免疫细胞化学观察，转染TGF-β3重组腺病毒MSCs胞浆内有棕黄色阳性颗粒表达。结论TGF-β3基因重组腺病毒载体的成功构建并在MSCs内的表达，为创伤愈合的基因治疗提供了研究基础。     

人血管内皮细胞生长因子腺病毒表达系统的构建及体外表达

目的　构建人VEGF12 1腺病毒表达载体 ,探讨应用血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因治疗骨科缺血性疾患的可行性。　方法　采用分子克隆技术 ,从pCDI/VEGF12 1质粒获得hVEGF12 1cDNA ,经穿梭质粒pShuttle克隆到腺病毒质粒上 ,构成Adeno VEGF12 1腺病毒重组质粒 ,经酶切及测序鉴定正确后 ,包装成为重组Adeno VEGF12 1腺病毒 ,并进行电镜观察及滴度测定。用病毒感染小鼠骨髓基质细胞 ,用逆转录PCR方法检测VEGF12 1基因在骨髓基质细胞中的转录 ,用免疫印迹及免疫组化方法检测VEGF蛋白的表达。　结果　经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功 ,电镜显示包装细胞中有病毒存在 ,包装的病毒滴度为 8× 10 10 pfu/ml,RT PCR证实有VEGF12 1mRNA的转录 ,免疫印迹及免疫组化检测有VEGF12 1蛋白的表达 ,而对照未见VEGF12 1转录和表达。　结论　构建的VEGF12 1腺病毒表达载体可在体外表达 ,VEGF基因治疗有可能用于骨科缺血性疾患     

人VEGF165基因在狗骨髓基质细胞中的表达

目的 :检测转染 pcDNA3 hVEGF165狗骨髓基质细胞的VEGF165mRNA表达。方法 :用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞 ,用免疫组化及RT PCR检测VEGFmRNA的表达。结果 :重组质粒 pcDNA3 hVEGF165转染骨髓基质细胞后 ,免疫组化及RT PCR检测有VEGFmRNA的表达。结论 :采用脂质体介导的方法可将hVEGF165基因转染至狗骨髓基质细胞并表达外源性基因     

Construction of recombinant adenoviral vector Ad-CMV-hTGFbeta1 for reversion of intervertebral disc degeneration by gene transfer.

OBJECTIVE: To provide a highly efficient adenoviral vector Ad-CMV-hTGFbeta1 for the study of gene therapy for reversion of the intervertebral disc degeneration. METHODS: A newly developed recombinant adenoviral vector construction system was used in the study. The cDNA of hTGFbeta1 was first subcloned into a shuttle plasmid pShuttle-CMV. The resultant plasmid was linearized by digesting with restriction endonuclease PmeI, and subsequently transformed into E.coli. BJ5183 cells with an adenoviral backbone plasmid pAdEasy-1. Recombinants were selected by kanamycin resistance and confirmed by restriction endonuclease analysis. Finally, the recombinant plasmid linearized by PmeI was transfected into 293 cells. Recombinant adenoviruses were generated within 2 weeks. RESULTS: The recombinant adenoviral plasmids were cut by BamHI and PacI respectively, and the diagnostic fragments appeared in 0.8% agarose electrophoresis. The infected 293 cells showed evident cytopathic effect (CPE). The productions of PCR confirmed the presence of recombinant adenovirus. The expression of hTGFbeta1 was verified by immunohistochemical staining. CONCLUSIONS: The successful generation of the adenoviral vector Ad-CMV-hTGFbeta1 and the confirmation of the interest gene expression make it possible for the experimental study of the reversion of the intervertebral disc degeneration by gene therapy.     

靶向大鼠诱导型一氧化氮合酶基因的shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)标志针对大鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的shRNA重组腺病毒载体并在人胚肾-293细胞中扩增制备重组病毒.方法 利用AdMax包装系统,用先期构建的带有EGFP标记基因的穿梭质粒pDC316-iNOS-shRNA-EGFP,与骨架质粒pBHGlox_El,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-inosshRNA-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.结果 经聚合酶链反应(PCR)检测和EGFP表达证明已成功构建了携带iNOS-shRNA-EGFP的重组腺病毒载体;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为3.6×1011 VP/ml,A260/A280值约为1.25,病毒活性为7.94×109IU/ml.结论 已成功构建重组腺病毒载体Ad5-inos-shRNA-EGFP,为利用基因激活技术治疗勃起功能障碍的研究奠定实验基础.

Abstract：

Objective To construct an adenovirus vector expressing short hairpin RNA (shRNA)of rat inducible oxide synthase (iNOS) carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP) and amplify the adenovirus vector in HEK-293 cells. Methods The shuttle plasmid pDC316-inos-shRNA-EGFP that was constructed at an earlier date, was cotransfected with the adenovirus skeleton plasmid pBHGlox_E1,3Cre into 293 cells to obtain the produced replication defective recombinant adenovirus vector Ad5-inosshRNA-EGFP. The recombinant adenovirus was propagated by repeat infection of 293 cells and purified by ion exchange method, then the virus particles were counted and the purity and titer were determined.Results Recombinant adenoviral vector Ad-ACE-shRNA was constructed successfully, which was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and GFP expression. After amplification and purification, the virus particle count, A260/A280 and titer of recombinant adenovirus were 3.6 × 1011 VP/ml, 1.25 and 7.94 ×109 IU/ml,respectively. Conclusion Recombinant adenovirus vector Ad5-inos-shRNA-EGFP is successfully constructed, which laid a foundation for gene activation in erectile dysfunction treatment.     

A genetically retargeted adenoviral vector enhances viral transduction in esophageal carcinoma cell lines and primary cultured esophageal resection specimens

OBJECTIVE: To evaluate if an integrin-retargeted adenoviral vector could establish a more efficient and tumor-specific gene transfer in esophageal carcinoma cells. SUMMARY BACKGROUND DATA: Although preclinical data indicated that adenoviral gene therapy could be a promising novel treatment modality for various malignancies, clinical results are often disappointing. An important problem is the decreased tumoral expression of the Coxsackie and adenovirus receptor (CAR), which mediates adenoviral entry. Retargeting the adenoviral vector to other cellular receptors, by inserting an arginine-glycine-aspartate (RGD) tripeptide in the fiber knob, might overcome this problem. METHODS: Four esophageal carcinoma cell lines and 10 fresh surgical resection specimens were cultured. All were infected with the native adenovirus (Ad) and the retargeted adenovirus (AdRGD), encoding for the reporter genes luciferase or Green Fluorescent Protein to analyze gene transfer efficiency. RESULTS: In all cell lines, an increase in viral expression per cell and an increase in the percentage of transduced cells were seen with the retargeted adenovirus. Also, in the primary cultures of carcinoma cells, a more efficient gene transfer was seen when the retargeted vector was used. This phenomenon was less pronounced in normal cells, indicating that the RGD virus transduces tumor cells more efficiently than normal cells. CONCLUSIONS: This study demonstrates that an RGD retargeted adenovirus infects human esophageal carcinoma cells with enhanced efficiency, while in normal esophageal cells this effect is less pronounced. Therefore, this retargeted vector is expected to have a better performance in vivo, when compared with nonretargeted vectors used for cancer gene therapy so far.