基于DNA条形码的三种沉香属物种鉴定研究

目的:利用5个DNA条形码(ITS、matK、rbcL、psbA-trnH和trnL-trnF)对3个沉香属物种白木香、马来沉香和Aquilaria crassna Pierre进行分子鉴定,为沉香属药材的种类鉴定和种间分类地位提供分子生物学依据。方法:使用改良CTAB法提取沉香属植物的总DNA,分别对5个条形码序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增与测序。序列经DNAStar软件拼接,MEGA 7.0软件比对分析及计算相关数据,基于K2P模型构建系统发育树。结果:各条形码序列均被成功扩增与测序,其中trnL-trnF由于含有寡核苷酸重复序列而导致测序序列质量低。ITS及matK均能提供较多遗传信息,但在系统发育树中无法准确区分白木香、马来沉香和Aquilaria crassna Pierre这3个物种,而ITS+matK的组合能准确分辨上述物种。结论:ITS+matK组合序列可以用来鉴别沉香属物种,为沉香属药材的种类鉴定和种间分类地位提供分子生物学依据。     

市售白花蛇舌草药材的DNA条形码鉴定研究

目的:基于ITS2序列检测市场药材白花蛇舌草,为白花蛇舌草药材鉴定提供一种新的分子手段。方法:实验获取白花蛇舌草及其常见混伪品基原植物ITS2序列,结合Gen Bank下载序列共7个物种53条序列。经Codon Code Aligner V3.7.1拼接,利用MEGA 6.0软件进行变异位点分析,遗传距离计算和构建邻接(NJ)系统发育聚类树。同时随机检测37份市场药材白花蛇舌草,经中药材DNA条形码鉴定系统进行序列比对并构建邻接(NJ)系统聚类树确定物种,鉴别真伪。结果:白花蛇舌草基原植物ITS2序列种内K2P平均遗传距离远小于其与混伪品种间K2P平均遗传距离,NJ树结果表明白花蛇舌草基原植物可与其混伪品明显区分;市场药材中正品29份,伪品8份,其中半枝莲和远志为新发现的伪品。结论:基于ITS2序列DNA条形码技术可有效准确鉴定白花蛇舌草及其混伪品,为其用药安全提供了有力保障。     

黄芩ITS2条形码数据库构建及其种子的DNA条形码鉴定方法建立

目的:通过构建黄芩核糖体DNA内转录间隔区2(ITS2)条形码数据库,建立黄芩种子DNA条形码鉴定新方法,保障黄芩种子基原准确。方法:收集黄芩对照药材、基原植物、生药材、公共数据库及其常见代用品的ITS2序列,构建黄芩DNA条形码数据库;收集62份市售黄芩种子样品,每份种子获取3~4条ITS2序列,基于BLAST方法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:共获得101条黄芩及其代用品的ITS2序列。黄芩的种内序列变异小于种间序列变异,黄芩、甘肃黄芩和粘毛黄芩在NJ系统发育树上分别聚为独立的支,可相互区分。共获得195条黄芩种子的ITS2序列,DNA条形码鉴定结果表明193条为黄芩序列,2条为真菌序列。结论:黄芩ITS2条形码数据库稳定可靠,可满足黄芩种子DNA条形码鉴定的需求。DNA条形码技术可用于黄芩种子的物种鉴定。     

基于ITS2序列鉴别中药材钩藤及其同属近缘混伪品

目的应用ITS2序列鉴定多基原药材钩藤及其同属近缘混伪品,确保临床用药准确、安全。方法收集钩藤药材基原物种实验材料16份,采用改良后的CTAB法提取总DNA,通过PCR扩增、测序、序列拼接和注释后获得各自的ITS2序列并进行相似性比对验证,结合NCBI下载的同属相关物种ITS2序列64条,基于MEGA 6.0进行序列分析,比较钩藤药材各基原物种的序列差异,计算种内及种间Kimura 2-Parameter(K2P)距离,以邻接(NJ)法构建系统发育树。综合应用相似性搜索法、最近距离法以及NJ树对钩藤药材及同属混伪品进行鉴定分析。结果钩藤药材各基原物种ITS2序列长度为220-221 bp,各基原物种种内最大K2P距离均小于与同属其他物种的种间最小K2P距离,系统NJ树不仅能准确将钩藤药材基原物种区分开,更能将该属在我国分布的绝大多数物种区分开。结论该研究建立了基于ITS2序列的多基原药材钩藤DNA条形码鉴定技术方法,能够成功用于钩藤药材真伪鉴定,为临床准确用药提供依据。     

凉茶药材鸡蛋花及其混伪品的DNA条形码鉴定

该研究应用ITS2序列作为DNA条形码鉴定凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,共收集48份药材和基原植物样本,提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,经CodonCode Aligner拼接注释获得序列,然后应用MEGA5.0比对ITS2序列,计算种内和种间遗传距离,构建系统进化NJ树进行鉴定。结果表明,鸡蛋花ITS2序列长度为244 bp,种内遗传距离为0~0.016 6,远小于其与混伪物种间的遗传距离0.320 8~0.650 4,NJ树结果显示鸡蛋花与其混伪品均可准确区分。因此,应用ITS2条形码能够准确、有效地鉴别凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,为鸡蛋花药材的鉴定提供了一种新的分子手段,为其使用安全提供了有力保障。     

基于ITS2条形码鉴定水红花子及其混伪品

目的:利用ITS2条形码对中药材水红花子及其混伪品进行鉴定研究。方法:为对该中药材进行准确鉴定,共收集71份样本,包含药材正品及其混伪品。通过对样品进行DNA提取、PCR扩增、双向测序,利用Codon Code Aligner软件进行序列质量评价与拼接,获得ITS2序列。用MEGA软件进行序列比对、变异位点及遗传距离分析,采用最近距离法和构建NJ(邻接)树法来评价ITS2条形码的鉴定能力。结果:水红花子药材基原物种红蓼ITS2序列种内遗传距离为0~0.0124,与其混伪品水蓼、酸模叶蓼以及春蓼的种间遗传距离分别为0.0334~0.0508、0.0688~0.0875、0.0379~0.0467。红蓼种内最大遗传距离小于其与混伪品的种间最小遗传距离,表明ITS2条形码可以准确鉴定水红花子与其混伪品。此外,基于ITS2序列构建的NJ树也可将水红花子及其混伪品明显区分开。结论:ITS2条形码是鉴别水红花子药材的有效工具,可为保障该药材生产投料安全提供新的技术手段。     

九里香药材及其近缘物种ITS2分子鉴定研究

目的：应用中药材DNA条形码鉴定体系核心序列ITS2对九里香药材及其混伪品进行鉴定研究。方法：按照中药材DNA条形码分子鉴定法标准流程获取九里香药材及其混伪品ITS2序列，进行种内和种间变异分析，采用最近距离法、SNPs位点分析以及建树法，综合评估该序列的鉴定能力。结果：九里香药材及其近缘物种ITS2序列长度220～234 bp，基于K2P遗传距离不能有效区分九里香、千里香和翼叶九里香，序列分析发现九里香Murraya exotica与其他物种有3个稳定的单核苷酸多态性（SNP）位点，在UPGMA树中，不同物种的样品聚在一起，表明ITS2序列可以区分九里香药材及其近缘物种。利用中药材DNA条形码鉴定系统对44份千里香待检样品进行BLAST鉴定，结果均为正品千里香。结论：ITS2序列可用于九里香及其同属近缘物种的鉴定，为九里香药材的市场监控提供了有效手段，为其本草基因组学研究提供了依据。     

基于ITS2条形码的两面针药材及其混伪品的鉴别

目的 利用ITS2条形码鉴别两面针药材及其混伪品,为两面针药材鉴定提供新方法.方法 采用PCR法扩增ITS2(转录第二间隔区)序列,双向测序后运用CodonCode Aligner、MEGA软件进行数据处理,构建系统聚类树(NJ树).结果 两面针药材及其混伪品基因组DNA降解明显,但不影响ITS2条形码的PCR扩增和测序,ITS2条形码序列分析表明种内与种间遗传距离具有较大差异,基于ITS2条形码构建NJ树可鉴别两面针药材及其混伪品.结论 ITS2条形码适用于两面针药材及其混伪品的鉴别,为两面针药材快速、准确鉴定提供新方法;为两面针基原研究提供重要的分子鉴定证据;同时为DNA条形码技术应用于其他根、茎类中药材的鉴定提供了示范作用.     

基于中药系统鉴定法进行青葙子药材的鉴别研究

目的:利用中药系统鉴定法鉴别青葙子及其混伪品,为青葙子药材的准确鉴定及质量控制提供参考。方法:通过性状、微性状、显微鉴别和DNA条形码分析等方法,对青葙子药材及其混伪品进行比对分析,利用MEGA 7.0软件计算物种DNA条形码序列的种内、种间Kimura 2-Parameter遗传距离、评估序列的条形码间距,采用邻接法构建系统聚类树。结果:仅凭性状鉴别难以区分青葙子与混伪品;青葙子及其混伪品的微性状、显微特征差异明显,可作为其鉴定的重要依据之一;经筛选,推荐ITS序列作为青葙子及其混伪品的DNA条形码候选序列,trnL序列作为补充序列。结论:中药系统鉴定法能够完成对青葙子药材的精准鉴别。     

DNA条形码技术鉴定贝母属植物

目的 采用DNA条形码技术,比较了条形码序列ITS1和ITS2在贝母属植物中的鉴定效果。方法 从8个贝母属21个样品中提取了基因组DNA,进行ITS1、ITS2序列的PCR扩增和测序,并比较了各样品DNA提取率、PCR扩增率及测序成功率。测序数据采用BLAST搜索法评价2种序列的鉴定能力,采用SPSS软件进行遗传距离分析,采用MEGA软件进行系统发育树的构建。结果 对比不同物种ITS1、ITS2序列的一级结构差异,发现其ITS1序列长度为205～229 bp,有信息位点27个（所占比例11.8%）,鉴定成功率为72.2%;ITS2序列长度为236～244 bp,有信息位点20个（所占比例8.2%）,鉴定成功率为100%。ITS1序列的种内及种间遗传距离分别为0.001 8和0.066 1,而ITS2序列的种内及种间遗传距离分别为0.000 5和0.046 8,且种内高度保守;系统发育树构建结果显示,2种ITS序列能准确区分出浙贝母类群、川贝母类群和北方贝母类群,而ITS2序列所构建的系统发育树准确度更高。结论 ITS2 序列能够更准确鉴定不同物种贝母,适合作为贝母属植物的通用条形码序列。     

基于ITS2条形码的乌头属藏药植物鉴别

目的乌头属藏药植物变异极为复杂,品种繁多,商品来源复杂,极易造成药材混乱,且大多乌头属藏药具有较大的毒性,使安全用药面临巨大挑战。采用ITS2序列为DNA条形码,建立一种快速、准确鉴定乌头属藏药药材的方法。方法从青藏高原地区采集展花乌头、凉山乌头、工布乌头、露蕊乌头、铁棒锤、甘青乌头、木里乌头、弯喙乌头、多裂乌头、缩梗乌头等乌头属藏药样品50份,分别提取样品DNA,对ITS2目标序列进行PCR扩增、测序,获得其ITS2序列信息;运用MEGA 6.0对50条ITS2序列进行对比,计算种间、种内遗传距离,构建neighbor joining(NJ)系统进化树,并比较样本ITS2序列间的二级结构差异。结果乌头属藏药植物样本种间最小距离大于种内最大距离,NJ树显示各种乌头属植物种内之间各单独形成一个分支,ITS2序列二级结构也有明显差异,能够将乌头属各种植物区分开。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以将乌头属藏药植物进行准确、快速的识别和鉴定,为乌头属藏药的安全使用提供可靠的技术手段。     

17种毛茛科藏药材的分子鉴别＊

目的 毛茛科的多种植物是民族药的基原，本研究以ITS2序列作为DNA条形码对17种毛茛科藏药材进行鉴定，为药材的安全使用提供可靠的检测方法。方法 从四个省份采集或购买17种毛茛科藏药材样本，分布于8个属。采用试剂盒法提取基因组DNA，PCR扩增ITS2序列后，将扩增产物进行双向测序。利用CodonCode Aligner（v.9.0.1）软件进行序列拼接，将拼接后的序列在NCBI网站进行在线比对。在GenBank数据库中下载相关物种的rDNA序列（包含完整的ITS2区域）。上述序列经过CodonCode Aligner（v.9.0.1）软件剪切后，采用BLAST方法进行比对，然后再采用两种评估ITS2序列的鉴定能力。第一种是系统聚类树法（Tree-based method），用MEGA（v.5.0）软件构建NJ系统聚类树（Neighbour-Joining tree）；第二种是遗传距离法（Distance-based method），用TaxonGap（v.2.4.1）软件分析物种的种内与种间变异关系。结果 29份试验样本的ITS2序列测序成功率为100%，与93条数据库中下载的ITS2序列合并后，长度为213-230 bp，比对长度为244 bp，变异位点数72.1%。BLAST结果表明，29条ITS2序列可以将全部物种鉴定到属。系统聚类分析结果表明，ITS2序列能够成功鉴别8个物种；遗传距离分析结果表明，ITS2序列能够成功鉴别7种毛茛科药材。两种方法总共可以鉴别9种药材，它们是露蕊乌头（Aconitum gymnandrum）、草玉梅（Anemone rivularis）、多小叶升麻（Cimicifuga foetida var. foliolosa）、短尾铁线莲（Clematis brevicaudata）、长花铁线莲（Clematis rehderiana）、甘青铁线莲（Clematis tangutica）、腺毛黑种草（Nigella glandulifera）、拟耧斗菜（Paraquilegia microphylla）和芸香叶唐松草（Thalictrum rutifolium），鉴定效率为52.9%。结论 ITS2序列可以快速、准确地识别和鉴定部分毛茛科藏药材，为原植物和药材的分子鉴定提供依据。     

基于ITS2序列的清风藤属药用植物分类鉴定研究＊

目的 探讨核基因内部转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列在清风藤属（Sabia）药用植物中的分类鉴定可行性与系统关系。方法 对9种38个产地的清风藤属药用植物ITS2序列进行PCR扩增和测序。基于（Kimura 2-parameter）K2P计算遗传距离，分析种内和种间变异与鉴定效率，应用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树。结果 清风藤属药用植物ITS2序列长度均为241 bp，GC含量为51.9-64.7%。38个产地清风藤属药用植物ITS2序列，共具有保守位点168个，变异位点数目为73个，简约信息位点数目为65个。ITS2在清风藤属药用植物中的种内变异为0-0.074，种间变异为0.007-0.205，种间变异较小，种间遗传距离与种内遗传距离存在交叉，没有形成明显的间隔。ML系统树表明，属内种间具有较高的自展支持率，基本能单独聚成一支，可对清风藤属药用植物种间进行有效分类鉴定。结论 ITS2序列在清风藤属植物中具有较好的通用性与鉴定效率，可用于清风藤属DNA条形码与分类鉴定研究。本研究为清风藤属植物的分类鉴定与系统演化研究提供了一定参考。     

基于ITS和ITS2序列的药用石斛DNA条形码鉴定研究

目的 探讨内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）和内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)片段作为DNA条形码鉴别我国41种药用石斛种类的可行性。方法 通过PCR扩增测序结合GenBank公共序列筛选分别获得我国41种药用石斛的核基因ITS和ITS2序列433条和410条,以Kimura-2-parameter(K2P)模型计算种间和种内遗传距离,以邻接法（neighbor-joining,NJ）构建系统发育树,并对ITS2二级结构进行预测分析。结果 基于遗传距离和NJ树分析结果均显示,ITS和ITS2作为DNA条形码可分别有效区分待测的30和31种药用石斛,物种鉴定效率分别为73.2%和75.6%。联合系统发育树和ITS2序列二级结构分析,药用石斛种类的鉴定效率可提升至87.8%。结论 ITS2作为DNA条形码对药用石斛的物种分辨率优于ITS,物种取样数量可显著影响DNA条形码对药用石斛的物种鉴定效率。结果丰富了我国石斛属植物的DNA条形码数据库,为保障药用石斛种质资源和药用安全提供了科学基础和技术...     

峨眉山区唇形科药用植物ITS2和mat K条形码序列鉴定

目的 评价以ITS2和matK序列作为DNA条形码对峨眉山区唇形科药用植物的鉴定效果。方法 从峨眉山区采集23种唇形科药用植物样本,提取DNA,PCR扩增ITS2序列,并从Genbank上分别下载54与51条唇形科植物的ITS2及matK序列;使用MEGA 5.0软件计算全部序列的种间、种内遗传距离及序列变异位点,构建Neighbor Joining(NJ)系统进化树,最后开展barcoding gap分析。结果 峨眉山唇形科药用植物的ITS2序列长度为190～237 bp,GC含量为53%～73%,具有较为明显的barcoding gap,对唇形科植物的识别率为94%,而matK序列的barcoding gap不显著,有明显重叠现象,对唇形科植物的识别率为96%。结论 ITS2从种水平上对唇形科植物有更好的鉴定能力,但matK序列对唇形科植物的识别率更高,因此,以ITS2为主,matK序列为辅的鉴定方法能够对唇形科药用植物进行快速、准确的鉴定和识别,准确阐明物种之间的亲缘关系,对峨眉山区唇形科药用植物资源的有效保护和合理开发提供了理论依据。     

基于ITS条形码标记对当归属药用植物的鉴别

目的利用ITS条形码标记技术对当归属药用植物进行鉴别。方法选取该属32个物种158条核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行分子鉴别分析。所得序列运用MEGA 6.0软件计算种内和种间遗传距离,同时分别构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ)、最大似然树(maximum-likelihood tree,ML)和最大简约树(maximum-parsimony tree,MP),分析ITS序列的鉴别能力和当归属药用植物种间的系统发育关系。结果当归属物种间ITS序列最小遗传距离大于种内最大遗传距离,而且系统发育结果显示,每个物种的ITS基因型序列能较好地聚类为对应于该物种本身的分支,且具有中到高度的支持率,说明ITS序列能够将当归属物种区分开。结论 ITS序列可以作为当归属药用植物的DNA分子条形码标记,将在该属物种的分子鉴定方面发挥重要潜力。     

基于ITS2序列的市售木通药材及其混伪品的分子鉴定

目的 建立基于核糖体内部转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列的木通药材DNA条形码鉴定方法,对市售木通药材进行物种分析。方法 收集河北、安徽、贵州等地的样品总计45份,其中木通药材及其混伪品的原植物样品18份,市售木通药材样品27份。通过提取DNA、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增、双向测序获得ITS2序列,基于邻接（neighbor joining,NJ）系统发育树和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）位点进行物种鉴定分析。结果 基于木通药材及其混伪品原植物ITS2序列构建的NJ树分析结果表明,木通药材正品及其混伪品在NJ树上聚为独立的分支,木通药材正品及其混伪品在NJ树上可明确区分;基于NJ树对27份市售木通药材的物种分析表明,市售样品中仅有4份为正品木通,2份为小木通,21份为粗齿铁线莲,正品率为14.8%。结论 基于ITS2序列的DNA条形码技术可以准确区分中药材木通及其混伪品,市售木通药材物种较混乱。     

藏药臭蒿及其近缘种药材的ITS2 DNA条形码鉴别

臭蒿Artemisia hedinii有清热凉血,退黄,消炎的功能,在藏药中占有重要地位。蒿属植物种类繁多,在青藏高原分布广泛,且其外形较为相似,传统鉴定方法难以准确快速鉴定。文章以ITS2序列为DNA条形码,建立了一种快速准确鉴定臭蒿及其易混蒿属藏药植物的方法。从青藏高原采集蒿属藏药21个样品,分别提取样品DNA,对ITS2目标序列进行PCR扩增、测序,获得其ITS2序列信息;并从Gen Bank上下载同属序列11条;运用MEGA 6.0对所有32条ITS2序列进行对比,计算种间种内遗传距离,构建Neighbor Joining(NJ)系统进化树,并比较样本ITS2序列间的二级结构差异。结果显示:臭蒿、牛尾蒿、黄花蒿、艾蒿的遗传距离较近,但四者种间最小距离均远大于种内最大距离,NJ树显示4种蒿属植物种内之间各单独形成一个分支,ITS2序列二级结构也显示出差异。以ITS2序列作为DNA条形码,可达到对臭蒿及其近缘蒿属藏药植物进行准确、快速的识别和鉴定的目的,准确地弄清物种之间的系统进化关系的目的,为该属药用植物的质量控制、安全用药及合理开发利用提供理论依据。     

基于DNA条形码技术的俄罗斯特色药用植物资源调查

目的:调查俄罗斯高加索、阿尔泰野外地区药用植物的分布现状,明确该地区药用植物的种类、功效信息,深入挖掘一带一路沿线国家地区的药用植物新资源、新功效。方法:在野外搜寻并采集药用植物制成蜡叶标本运回国,提取腊叶标本的植物总DNA,使用内转录间隔区(ITS)序列通用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,PCR产物送双向测序,测序结果经软件进行拼接,根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库BLAST所获相似度最高物种的同属ITS序列,经DNAman软件对待鉴定物种的ITS序列和同属ITS序列进行相似度分析,利用MEGA 7软件作进化树,采用Kimura-2参数遗传距离,采用邻接法构建邻接法(NJ)系统树,发育树各分支的置信度用自举检验法检验,共进行2 000次循环,根据聚类结果进行鉴定。在此基础上对俄罗斯高加索、阿勒泰野外地区的重点药用植物进行归纳与分析。结果:经过NCBI数据库BLAST比对,各标本ITS序列与NCBI数据库上登录序列聚为一支,与外类群明显分开,结合植物标本性状特征,确定了待鉴定标本的种属分类。该次野外收集的标本中共鉴定出51种植物,覆盖17科44属,有明确功效记载的植物共有29种。查阅俄罗斯联邦国家药品目录和《中国药典》,分析国内常用药用植物,总结出20种中俄常见药材其在当地具有不同药用功效。该研究对扩大中药用药范围和临床经验具有重要的借鉴意义,也为当地加强物种保护和开发利用野生药用植物资源提供了依据。     

基于ITS2条形码及其二级结构的菊科药用植物的系统发育分析＊

目的 采用ITS2（Internal transcribed spacer2，内转录间隔区2）序列作为条形码技术对菊科药用植物进行鉴别。方法 选取来自西藏及四川康定、乐山和峨眉地区的菊科样品44种，提取DNA并对其进行PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增，后测序，测序结果提交至GenBank；同时从GenBank上下载17条样本序列。对提交和下载的61条序列用MEGA7.0软件计算种内与种间的遗传距离，采用邻接法（neighbor-joinging，NJ）构建系统聚类树直观反应鉴定结果。从ITS2数据库中预测并比较样本ITS2序列的二级结构差异。结果 菊科植物种间最小遗传距离0.031大于种内最大遗传距离0.009，有较明显的barcoding gap；NJ树显示种各属样本分别聚为一大枝，种内之间各自聚成小支，表现出良好的单系性；各属及各种样品ITS2二级结构存在明显差异。结论 以ITS2序列作为DNA条形码，能够对菊科药用植物进行准确、迅速的识别与鉴定，是物种间进化关系准确的分子鉴定依据，可为该科植物的分布、种群及种群数量的研究提供指导，为控制药品质量、合理开发利用及保护提供了新手段。