基于ITS序列位点特异性PCR的酸枣仁及其混伪品的鉴别

目的:基于ITS序列建立酸枣仁及其市场混伪品的分子鉴定方法。方法:收集酸枣仁及其常见混伪品理枣仁、枳椇子、紫荆子、兵豆,提取总DNA,基于ITS序列设计引物并进行PCR扩增,对扩增产物进行测序,用Bio Edit分析软件进行序列比对,针对变异位点用Primer Premier 5.0设计特异性鉴别引物,进行PCR反应并考察反应条件。结果:ITS序列可以用于酸枣仁及其易混淆品种的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,DNA模板用量范围应为0.7~2.1 ng·μL-1,退火温度在59℃时特异性最佳,实验建立的方法对不同Taq酶和PCR仪具有普遍适应性。结论:研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,酸枣仁能扩增出66 bp的条带,而其他混伪品不能扩增出条带,从而实现了酸枣仁与其混伪品的快速、准确鉴别。     

位点特异性PCR鉴别桃仁中掺入苦杏仁的方法分析

目的 由于中药材传统真伪鉴别方法的局限性,本研究拟通过位点特异性聚合酶链式反应（PCR）建立一种能够快速鉴别桃仁中掺有苦杏仁的方法。方法 通过比对苦杏仁与桃仁的核糖体DNA内转录间隔区（ITS）基因序列,寻找单核苷酸多态性（SNP）位点并设计特异性鉴别引物。利用不同的苦杏仁和桃仁样品进行PCR扩增,对影响PCR反应体系的退火温度、引物浓度、循环数等条件进行优化,并对该方法的专属性和检出限进行了考察。另外,利用建立的PCR鉴别方法对不同来源和不同产地桃仁中掺有不同比例苦杏仁的样品进行检测,以验证该方法的稳定性和准确性。结果 建立了桃仁中掺混苦杏仁的特异性PCR鉴别方法,在退火温度63 ℃和引物循环数30个时仅有苦杏仁能扩增得到432 bp的特异性条带,桃仁样品则无此条带。该方法对苦杏仁的最低检出限为0.2 ng,其对桃仁中掺入苦杏仁的检出限为1%,可用于日常桃仁中掺混苦杏仁的检测。结论 建立的位点特异性PCR方法能够准确地检测桃仁中是否掺有苦杏仁,可为桃仁的质量控制提供实验依据,以保障其临床用药安全。     

基于ITS序列位点特异性PCR鉴别北柴胡掺伪藏柴胡

目的 基于ITS序列建立北柴胡掺伪藏柴胡的分子鉴别方法.方法 收集北柴胡、藏柴胡样品,提取基因组DNA,用ITS通用引物进行测序,通过DNAMAN软件进行序列比对,根据藏柴胡特异性位点用Primer Premier 5.0软件设计特异性鉴别引物,并优化特异性PCR反应条件.结果 在位点特异性PCR反应条件考查中,退火温...     

蒙古黄芪与膜荚黄芪特异性分子标记鉴别研究

目的:通过分析不同基原中药黄芪样本DNA序列,研究特异性鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的方法。方法:通过筛选5条常用DNA条形码序列(ITS,ITS2,psbA-trnH,rbcL,matK),运用MEGA软件进行序列比对,分析可特异性鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的序列及SNP位点,并设计特异性引物。结果:ITS及ITS2序列可准确区分蒙古黄芪与膜荚黄芪,发现稳定的SNP位点,蒙古黄芪在ITS序列第476位点(位于ITS2序列上游)为碱基C,而膜荚黄芪为碱基T,并设计三对特异性鉴别蒙古黄芪的引物对。结论:ITS/ITS2序列以及特异性引物可准确鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪,为黄芪药材的基原鉴定提供科学依据。     

桃仁及苦杏仁DNA检测试剂盒的研制与评价

目的 本研究旨在研制一种快速检测试剂盒,鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,并对其进行性能评价。方法 建立DNA提取方法,确保有效提取桃仁及苦杏仁基因组DNA,紫外分光光度法测其浓度及纯度。美国国立生物技术信息中心(NCBI)查询并比对桃仁及苦杏仁的ITS序列,针对特异性位点,NCBI Primer-Blast设计种属特异性引物。建立并优化聚合酶链式反应(PCR)检测体系,DH5α感受态细胞克隆特异性片段,测序验证体系准确性,制备阳性对照。组装DNA检测试剂盒,对其特异性、稳定性及重复性进行评价,并对市售桃仁和苦杏仁样品进行检测。结果 所建立DNA提取方法,提取效率高,DNA质量浓度高于100 ng·μL^-1,A_260/280处于1.80～2.10之间。该试剂盒可准确鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,检测灵敏度高,特异性强,最低检测限为1 ng·μL^-1。反复冻融20次后仍可有效检测,可于-20 ℃保存1年。20个市售样品中检出1个桃仁伪品及2个苦杏仁伪品,其余均为正品。结论 桃仁及苦杏仁DNA检测试剂盒特异性强、灵敏性高、稳定性好,具有良好重复性,可快速鉴定桃仁及苦杏仁,为桃仁中药材市场质量安全管理提供有力支持。     

白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法研究

目的: 筛选白术、苍术鉴别SNP位点,并设计特异性引物,实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法: 通过测序及GenBank中下载获得白术、苍术的psbA-trnH序列,通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点,设计位点特异性PCR引物,将ITS通用引物加入到特异性引物构建多重PCR体系,并优化PCR条件,对白术、苍术种子进行分子鉴定。结果: 构建了多重PCR鉴别体系,通过一个PCR反应,能扩增出苍术、白术约643 bp 的ITS DNA质控条带,扩增出白术172 bp的特异性鉴别条带,实现白术、苍术鉴别。结论: 使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别白术、苍术种子。     

药材天葵子的分子生物学鉴别

目的该研究基于ITS序列对天葵及其混伪品进行准确鉴别。方法通过PCR扩增ITS序列,联合Genebank下载的天葵混伪品及近缘种序列、构建系统发育树(Neghbor-Joining,NJ);并基于ITS序列上的变异位点设计特异性PCR引物和HRM引物、对天葵及其混伪品进行鉴别。结果在构建的NJ树中、天葵及其混伪品和近缘种各自形成单系分支。且都获得较高的支持;在特异性PCR鉴别中,天葵有条带扩增成功,而混伪品则没有扩出条带;而利用HRM技术鉴别,结果显示,天葵及其混伪品和Tm值均有明显差异。结论 ITS序列能够作为天葵及其混伪品和近缘种的DNA鉴别条形码、此外,基于ITS序列所设计的特异性PCR引物和HRM引物,都能够对天葵及其混伪品进行准确的鉴别。     

中药穿山甲的DNA分子鉴定研究

对中药穿山甲及其混伪品进行分子鉴定研究,建立一个稳定、准确的位点特异性PCR鉴别体系。收集整理穿山甲属动物组织样本及NCBI序列,提取基因组总DNA,PCR扩增Cytb和COⅠ序列并测序,通过Bio Edit软件进行序列比对,应用MEGA 6.0构建序列系统聚类树,并根据序列特异位点设计和筛选中华穿山甲特异性鉴别引物,并对PCR反应条件进行退火温度、DNA模板上样量和PCR循环数等条件的适应性考查。结果表明:Cytb和COⅠ序列均能有效对穿山甲正、伪品进行聚类分析;在位点特异性PCR反应体系中,当退火温度为55~60℃,DNA模板量3~100 ng,PCR扩增35个循环时,基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能使中华穿山甲扩增出约400 bp的特异性条带,而其他穿山甲品种扩增结果为阴性。该文基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能实现中华穿山甲与伪品印度穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲等的准确、稳定鉴别。     

基于ITS序列位点特异性PCR的肉苁蓉与其混伪品的鉴别研究

研究荒漠肉苁蓉、锁阳和黄花列当之间的DNA分子鉴别方法,采集不同产地的30份荒漠肉苁蓉,13份锁阳以及8份黄花列当,所有样品进行总DNA提取,通过对其ITS片段进行扩增,测序。再进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,并对位点特异性PCR的反应条件进行了优化;另外,对位点特异性PCR法与DNA序列分析法的鉴别进行了比较。结果显示,该研究设计的位点特异引物在同一PCR反应中,荒漠肉苁蓉能扩增出331 bp的条带,而混伪品锁阳和黄花列当不能扩增出条带,从而实现了正伪品的鉴别。该文通过位点特异PCR的方法可以实现荒漠肉苁蓉与混伪品锁阳、黄花列当的快速、准确鉴别。     

基于DNA条形码的翠云草快速鉴定方法研究

目的：基于卷柏属植物DNA条形码鉴定序列,运行TaqMan探针技术探讨翠云草快速鉴定新方法。方法：本文利用DNA条形码鉴定技术对采集的11种32份卷柏属样本提取总DNA扩增ITS2序列,结合Genbank数据库的34种103条序列综合分析,针对翠云草设计特异引物及探针,运用实时荧光PCR检测技术比较序列扩增荧光信号差异实现翠云草的快速鉴定。结果：在所分析的物种中ITS2序列可将翠云草与其它卷柏属近源物种有效区分,TaqMan探针及引物特异性较好,本研究建立的方法在翠云草的鉴别中具有良好的特异性、重复性及灵敏性,甚至可从低至1 mg的样品中提取DNA得到有效检出。结论：基于DNA条形码鉴定序列变异位点信息,运用高特异TaqMan探针实时荧光PCR检测技术,可实现翠云草真伪快速鉴别,具有中药材市场监管应用前景,将为中药材快速鉴定应用研究提供参考。     

南北葶苈子的最新研究进展

葶苈子为十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia或独行菜Lepidium apetalum的干燥成熟种子, 前者习称南葶苈子, 后者习称北葶苈子。中医理论认为其能泻肺平喘, 利水消肿, 用于痰涎壅滞、咳喘痰多、喘息不得卧及水肿、悬饮、小便不利等, 临床应用较广泛, 该文从本草考证、品种鉴别、炮制研究、化学成分、药理作用、含量分析、毒性等方面就南葶苈子与北葶苈子近年来的研究进展进行综述, 为其深入研究与开发提供参考。     

HPLC指纹图谱鉴别葶苈子与车前子

目的: 鉴别葶苈子与车前子. 方法: 采用高效液相色谱法建立南葶苈子指纹图谱,并使用相似度评价软件,系统聚类分析和偏最小二乘法判别分析对两者的HPLC图谱进行识别研究. 结果: 葶苈子与车前子的HPLC色谱峰和相对峰面积存在较大的差异,经统计分析,所有样品被分为葶苈子、车前子和混淆品三类. 结论: HPLC指纹图谱结合系统聚类分析和偏最小二乘法判别分析等化学计量学方法可用来鉴别葶苈子和车前子,该方法快速、简便、准确、有效,可为葶苈子和车前子的质量评价提供依据.     

葶苈子化学成分及药理作用研究进展

葶苈子为十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia （L.）Webb.ex Prantl.或独行菜Lepidium apetalum Willd.的干燥成熟种子,用药历史悠久,在我国南、北方及北温带其他地区均有分布。现代研究表明,葶苈子中含有强心苷类、硫苷类和异硫氰酸类、黄酮类、苯丙素类、有机酸类、脂肪油类等多种化学成分,具有改善心血管功能、抗肿瘤、止咳、祛痰、平喘、利尿、改善急性肺损伤和代谢紊乱、雌激素样作用等药理活性。从化学成分及药理作用方面对葶苈子近年来的研究进展进行综述,为其进一步研究及应用提供参考。     

南葶苈子及炒南葶苈子标准饮片的均匀化方法研究

[目的] 对南葶苈子及炒南葶苈子制备标准饮片的最佳均匀化工艺进行筛选。[方法] 以出粉率、黄酮类化合物的总含量（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖）、指纹图谱总峰面积作为指标设计L₉（3⁴）正交实验,对投料量、单次粉碎时间、粉碎次数3个因素进行考察,优化南葶苈子和炒南葶苈子制备标准饮片的均匀化方法。[结果] 南葶苈子最佳均匀化工艺：投料量150 g,单次粉碎时间10 s,粉碎4次;炒南葶苈子饮片最佳均匀化工艺：投料量100 g,单次粉碎时间10 s,粉碎3次。[结论] 通过正交实验得到的均匀化工艺方法得当,合理可行,为南葶苈子及炒南葶苈子制备标准饮片进行质量控制研究提供参考,为标准饮片均匀化技术规范制定提供了科学依据。     

炒苦杏仁饮片指纹图谱研究

目的:建立炒苦杏仁饮片的高效液相指纹图谱,提高药材质量控制水平.方法:采用高效液相色谱法,C18色谱柱,流动相乙腈-0.1％磷酸,流速1 mL· min -1,检测波长225 nm.采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”计算处理,确定了炒苦杏仁饮片指纹图谱研究方法.结果:各批次药材共获得10个共有峰,超过总面积95％,所得指纹图谱方法学考察结果良好,采用色谱指纹图谱相似度评价软件,对炒苦杏仁饮片指纹图谱进行相似度计算,其10批样品相似度在0.5 ～0.9.结论:指纹图谱的运用实现了炒苦杏仁饮片的全面和整体评价,能体现炒苦杏仁饮片的多个成分的指纹信息,为有效提高炒苦杏仁饮片质量控制提供参考.     

菟丝子、莱菔子与其易混淆品的快速PCR法鉴别研究

完善快速PCR鉴定检测体系,并建立菟丝子或莱菔子的分子鉴别方法。收集不同地区的菟丝子、莱菔子及其易混淆品材料,所有样品进行总DNA的提取,通过对菟丝子、莱菔子及其易混淆样品ITS片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,采用2步法进行PCR扩增,从而对菟丝子或莱菔子进行鉴别。通过对影响PCR退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪进行考察,分别获得菟丝子、莱菔子快速PCR反应程序。在稀释后的PCR产物中加入SYBR GreenⅠ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光,且可有效的避免因引物二聚体而存在的假阳性问题。快速PCR方法可以简单快速鉴别菟丝子、莱菔子,为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。     

基于UPLC特征图谱的南、北葶苈子及其混伪品的鉴别研究

目的：研究并建立南葶苈子药材超高效液相色谱法(UPLC)特征图谱,并对北葶苈子及混伪品进行对比研究。方法：采用ACQUITY UPLC BEH Shield RP₁₈色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);以乙腈-0.3%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,检测波长为254 nm;流速为0.30 mL·min^–1;柱温为35℃。结果：建立了南葶苈子药材UPLC特征图谱共有模式,标定了12个共有峰,指认了其中7个,槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷(峰3)可区分南葶苈子和北葶苈子;芥子碱(峰2)可区分南葶苈子和菥蓂子;异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷(峰6)可区分南葶苈子和荠菜子。结论：建立的UPLC特征图谱能有效区分南葶苈子、北葶苈子及其混伪品荠菜子、菥蓂子,为控制葶苈子药材质量提供了参考。     

葶苈子抗心衰有效组分筛选及其作用机制分析

目的:筛选葶苈子抗心衰的有效组分,并对其机制进行初步探讨。方法:雄性SD大鼠随机分为正常组,模型组,阳性药物组(地高辛组)和葶苈子不同剂量组,除正常组外采用腹腔注射阿霉素6周复制心衰大鼠模型,药物灌胃干预4周,大鼠代谢笼法收集6 h尿液,超声心动图检测心功能变化。处死后称取每组大鼠的体重和心脏质量,计算心脏系数。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清脑钠肽(BNP),肌钙蛋白I(cTnI),血浆血管紧张素II(AngⅡ),醛固酮(ALD)水平,心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。采用二硫代二硝基苯甲酸法测定心肌谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,并运用光镜观察心肌组织病理形态学改变。结果:与正常组比较,模型组大鼠BNP,cTnI,AngⅡ,ALD水平明显升高,心衰大鼠的左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)显著降低,心肌组织MDA含量显著升高和SOD,GSH-Px活性显著降低,尿量明显降低(P0.05,P0.01),心肌病理损伤较为明显;与模型组比较,葶苈子发挥抗心衰作用的有效组分为水部位,可以显著降低BNP,cTnI,AngⅡ,ALD水平(P0.05,P0.01),升高心衰大鼠的LVEF和LVFS(P0.05,P0.01),并能减轻心肌病理损伤;且葶苈子中、高剂量组可以极显著降低心肌组织MDA含量和升高SOD活性(P0.01),具有较好的利尿作用(P0.05),同时中剂量组使GSH-Px活力显著增高(P0.05)。结论:葶苈子有效组分水部位能够显著改善心衰症状,其作用机制可能与改善心衰大鼠体内氧化应激失衡状态,抑制神经内分泌系统过度激活密切相关。     

GC-MS分析王不留行、决明子、酸枣仁炒制前后脂肪油成分的变化

目的:分析和鉴定王不留行、决明子、酸枣仁3种药材炒制前后脂肪油类成分的变化,为探索种子类药材"逢子必炒"的炮制机制奠定基础。方法:以石油醚为溶剂,采取索氏提取器提取脂肪油,甲酯化后用气相色谱-质谱联用技术(GCMS)分离、鉴定其组成和相对质量分数。HP-5毛细管柱(0.25 mm×30 m,0.25μm),载气99.999%高纯氮,流速1 mL·min~(-1),采用程序升温方式(初始温度50℃,以5℃·min~(-1)升至170℃,停留4 min,5℃·min~(-1)升至190℃,0.5℃·min~(-1)升至200℃,10℃·min~(-1)升至240℃,保持4 min),进样量1μL,电子轰击离子源(EI),离子源温度220℃,电子能量70 eV。结果:王不留行、决明子、酸枣仁3种药材生品脂肪油提取率分别为3.34%,6.16%,20.66%,炒制品脂肪油提取率分别为4.67%,7.40%,26.35%。王不留行生品鉴定出7个化合物,炒制品鉴定出10个化合物;决明子生品鉴定出8个化合物,炒制品鉴定出9个化合物;酸枣仁生品鉴定出10个化合物,炒制品鉴定出14个化合物。结论:炒制能提高脂肪油的提取效率,炒制后3种药材脂肪油的组成出现了一些共性变化。     

中药肉豆蔻历史沿革研究

目的：研究肉豆蔻的炮制方法的历史沿革变化轨迹及前人的炮制意图，总结前人的炮制经验和临床体会。为开展肉豆蔻的炮制规范化研究提供有益的借鉴。方法：查阅历代的本草典籍，并将处方注脚下的炮制方法也进行了整理、归纳。结果：查阅了约70部本草典籍，初步理清了肉豆蔻炮制的历史沿革、炮制意图和临床体会。结论：肉豆蔻的炮制方法因临床的不同需要而不同，约有16种，其主流方法是面裹煨。炮制的目的是增强止泄的作用。