羟基红花黄色素A抑制异常增殖血管内皮细胞的机制研究

目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)抑制异常增殖血管内皮细胞的作用机理。方法建立人结肠腺癌细胞LS180上清液和人脐静脉内皮细胞ECV304体外共培养模型,通过实时荧光定量PCR检测ECV304细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(KDR)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)及其受体(b FGFR)、HSPG2、p53、c-myc mRNA水平的表达;ELISA法检测细胞培养上清VEGF、VEGFR(KDR)、b FGF、b FGFR蛋白的表达。结果在共培养细胞模型中,0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR和癌基因c-myc及与细胞增殖相关蛋白多糖HSPG2的mRNA表达具有抑制作用;对抑癌基因p53 mRNA的表达具有促进作用。0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR的蛋白表达具有抑制作用。结论 HSYA抑制新生血管的生成、抑制共培养模型中血管内皮细胞的异常增殖,其可能的作用机理是通过调控VEGF及其受体、b FGF及其受体、HSPG2、c-myc和野生型p53的表达发挥抗肿瘤作用,揭示HSYA可能是潜在的肿瘤血管生成抑制剂。     

去甲二氢愈创木酸对内皮细胞影响的形态学观察

目的：探讨去甲二氢愈创木酸（NDGA）对内皮细胞形态的影响及特点。方法：采用倒置显微镜、光镜、电镜和流式细胞仪观察分析不同浓度NDGA作用下人脐静脉内皮细胞系ECV－304细胞形态和细胞调亡峰的变化。结果：①不同浓度（50－200μmol/L）的NDGA处理ECV－304细胞24－72h后或一定浓度（100μmol/L）的NDGA处理ECV－304细胞不同时间（1－7d）后,内皮细胞由多角形变长,呈梭形,细胞稀疏,核分裂明显减少,显示细胞增殖的抑制,上述变化与NDGA的浓度和作用时间有关;②NDGA处理后,部分细胞呈现出调亡样形态学改变,以48h为明显。流式细胞仪检测也出现明显高于对照的调亡峰即亚G0峰,12h时相点最高（20.42％）。此外,处理后的细胞也有变性、坏死等病理变化,与NDGA的浓度呈正比。结论：NDGA对内皮细胞的生长和增殖有抑制,形态学初步证明也有诱导调亡等作用,这在影响血管生成中可能具有一定意义。     

CDK4在去甲二氢愈创木酸抑制恶性胶质瘤细胞增殖中的作用

目的：探讨细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4（CDK4）在去甲二氢愈创木酸（NDGA）抑制人恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞增殖中的作用。方法：采用细胞培养、细胞计数、流式细胞仪检测、免疫沉淀、免疫组化及图像分析等技术方法。结果：①在10－200μmol/L浓度范围内,NDGA可使SHG－44细胞增殖受阻,且NDGA液浓度越高,这种作用越明显,即呈明显的剂量依赖性;②NDGA对细胞周期抑制作用主要表现于G1→期;③NDGA处理后,SHG－44细胞CDK4蛋白激酶的活性降低,且这种作用与NDGA的处理浓度呈正相关,与NDGA对SHG－44细胞的增殖抑制作用相一致;④NDGA处理后,SHG－44细胞CDK4基因的蛋白表达明显减弱。结论：CDK4蛋白激酶活性降低在NDGA抑制SHG－44细胞增殖中起着十分重要的作用。     

胰岛素对牛胸主动脉内皮细胞血管内皮生长因子及其受体表达的影响

目的评价胰岛素对培养的牛胸主动脉内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)及其受体表达的影响.方法取新生的小牛胸主动脉,做血管内皮细胞原代及传代培养,取4～6代培养细胞分组应用不同浓度的胰岛素(30mU/L、300mU/L、3000mU/L)干预培养过程,48h后应用免疫组化法测定内皮细胞VEGF及其受体(flt-1、flk-1/KDR)的表达水平.结果低浓度胰岛素组(30mU/L、300mU/L)内皮细胞VEGF表达明显高于不用胰岛素组(P<0.01);高浓度组(3000mU/L)内皮细胞VEGF表达明显低于不用胰岛素组(P＜0.05);各组内皮细胞VEGF受体(flt-1及flk-1/KDR)的表达无明显差异(P＞0.05).结论低浓度胰岛素促进小牛主动脉血管内皮细胞VEGF表达;高浓度胰岛素可抑制血管内皮细胞VEGF表达;胰岛素对小牛主动脉血管内皮细胞VEGF受体(flt-1、flk-1/KDR)的表达无直接影响.     

去甲二氢愈创木酸对SHG-44胶质瘤细胞GFAP基因表达的影响

目的：探讨去甲二氢愈创木酸（NDGA）诱导恶性胶质瘤细胞分化过程中中对GFAP基因表达的影响及其意义。方法：用免疫组织化学和原位杂交方法定性、定量检测人恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞GFAP基因的表达水平。结果：NDGA处理后,瘤细胞GFAP蛋白及mRNA表达水平明显增高（P＜0.01）。结论：NDGA具有诱导恶性胶质瘤细胞GFAP基因表达的作用,推测GFAP基因表达上调可能是NDGA诱导胶质瘤细胞分化的作用机制之一。     

Genistein对人卵巢癌细胞系SKOV3诱导内皮细胞迁移的作用及机制探讨

目的:研究Genistein对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3诱导人内皮细胞系ECV-304迁移的作用,以探讨Genistein抑制血管生成作用的机理.方法:采用微孔滤膜培养小室及双室联合细胞培养方法,观察在0.5%BS培养条件下,SKOV3细胞或其条件培养基诱导的ECV-304细胞迁移以及Genistein对SKOV3细胞或其条件培养基诱导的ECV-304细胞迁移的影响;用免疫组化方法检测血管生长因子VEGF、bFGF及TGFβ-l蛋白的表达水平.结果:SKOV3细胞或其条件培养基对内皮细胞均有较强的趋化作用,Genistein对SKOV3细胞或其条件培养基诱导的ECV-304细胞迁移有呈剂量依赖性的抑制作用.20μmol/L Genistein处理ECV-304细胞48h后,VEGF、bFGF蛋白的表达水平降低,而TGFβ-1蛋白的表达水平升高.结论:GenIStein可明显抑制人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3及其条件培养基对人内皮细胞系ECV-304细胞的诱导迁移作用Genistein可能通过抑制促血管生成调节因子VEGF和bFGF的蛋白表达,增强血管生成的负性调节因子TGFβ-1的蛋白表达来抑制这种迁移诱导作用.     

原位杂交方法检测人脑胶质瘤VEGF mRNA的表达

目的 :检测血管内皮细胞生长因子 ( VEGF)在胶质瘤及瘤周组织的基因表达 ,探讨其促进肿瘤血管生成及瘤周组织水肿的作用机制。方法 :采用原位杂交方法检测 2 3例人脑胶质瘤及瘤周组织和 7例正常脑组织中 VEGF的基因表达。结果 :VEGF在胶质瘤组织主要表达于毛细血管、血管内皮细胞及肿瘤细胞 ,瘤周组织表达于变异的星形胶质细胞 ,而正常脑组织几乎无表达。胶质瘤及瘤周组织的阳性细胞表达率显著高于正常脑组织 ( P<0 .0 0 1 ) ;胶质瘤组织中血管内皮细胞VEGF的阳性表达率高于瘤周组织 ( P<0 .0 1 ) ,而瘤周组织星形胶质细胞的阳性表达率高于肿瘤组织 ( P<0 .0 1 )。结论 :VEGF在脑胶质瘤及瘤周组织中的高表达与肿瘤血管生成及瘤周组织水肿的发生密切相关。     

苏拉明对肺癌血管生成的抑制作用

目的　研究苏拉明对肺癌血管生成的抑制作用及其机制。方法　采用细胞培养和免疫组织化学的方法离体研究肺癌A5 49细胞、人血管内皮ECV 30 4细胞VEGF及其受体 (Flt、KDR)的表达及苏拉明的影响。结果　苏拉明对肺癌细胞产生和分泌VEGF无影响 ;ECV 30 4细胞KDR、Flt的蛋白表达在苏拉明浓度为 0 .2 5ng/ml和 2 .5ng/ml时 ,受到显著抑制 ;而苏拉明浓度为 0 .2 5ng/ml和 2 5ng/ml时Flt的表达 ,以及苏拉明浓度为 2 .5ng/ml和 2 5ng/ml时KDR的表达则无明显变化 (与对照组比较 ,P >0 .0 5 ) ;苏拉明对A5 49、ECV 30 4细胞增生无影响。结论　苏拉明抑制肺癌血管生成的作用机制可能是通过抑制血管内皮细胞上的VEGF受体表达 ,减少VEGF与其受体结合所致。     

同型半胱氨酸对血管内皮细胞表达血栓调节蛋白的影响

目的：观察不同浓度的同型半胱氨酸对血管内皮细胞表达血栓调节蛋白的影响。方法：传代培养ECV304细胞，随机给予7种不同浓度的Hey(0μmol／L、25μmol／L、50μmol／L、100μmol／L、1μmol／L、5μmol／L、10mmol／L)，处理24h后，检测细胞活力和上层培养液中的LDH含量；用ELISA方法检测细胞上层培养液中的可溶性血栓调节蛋白(sTM)的浓度和细胞总的TM含量。结果：1mmol／L以下的Hey对细胞的活力，培养液中的LDH含量和sTM浓度无影响。5mmol／L的Hey使细胞的活力开始下降，10mmol／L的Hey还可以导致细胞LDH漏出量的增加，sTM也相应升高。不同处理组均可见TM的表达。超过1mmol／L的Hey作用24h可以使细胞总的TM含量显著增加。结论：生理浓度的Hey不直接对内皮细胞造成影响，但超生理浓度的Hey可以使TM的合成增加。     

VEGF及其受体KDR在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义

目的 研究食管鳞状细胞癌组织中血管内皮生长因(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体KDR(kirme imert domain cotaining receptor／fetal liver kinase-1)的表达及与食管癌生物学行为的相关性。方法 采用免疫组织化学技术，检测50例手术切除、病理证实的食管鳞状细胞癌组织VEGF、KDR的蛋白表达。结果 VEGF主要在肿瘤细胞表达，KDR在间质细胞、肿瘤细胞、腺体及血管内皮细胞均有表达，并与VEGF有相似性，癌巢边缘阳性表达降低。结论 VEGF、KDR与食管鳞状细胞癌的一些生物学行为有一定的相关性。     

Study of apoptosis induced by nordihydroguaiaretic acid in human ma-lignant glioma cell line SHG-44

Objective: To investigate the effect and mechanism of nordihydroguaiaretic acid (NDGA) on apop-tosis in human malignant glioma cell line SHG-44. Methods: Cell growth inhibition was measured with MTT assay. Cell apoptosis was observed with light and electron microscopy and TUNEL. Expression of bcl-2 gene was measured with immunohistochemistry, in situ hybridization and image analyses. Results: NDGA at the concentration of 100 μmol/L inhibited the proliferation of SHG-44 cells and induced apoptosis in a time-de-pendent manner. The expression of Bcl-2 protein in SHG-44 cells was decreased in the present of 100 μmol/L NDGA along with the duration of treatment in a negative correlation with the degree of cell apoptosis. The bcl-2 mRNA expressed in SHG-44 cells was reduced after treatment with 100 μmol/L NDGA, apparently consistent with the immunohistochemical results. Conclusion.- NDGA can induce apoptosis of human malig-nant glioma cells probably by down-regulating expression of bcl-2 gene, though the exact mechanism needs further study.     

bcl-2、c-myc基因表达在去甲二氢愈创木酸诱导人恶性胶质瘤细胞凋亡中的意义

目的：观察bcl-2、c-myc在去甲二氢愈创木酸（NDGA）诱导恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞凋亡中的变化及意义。方法：利用光镜和电镜观察及TUNEL法检测培养细胞凋亡的情况,用免疫组织化学、原位杂交和图像分析等方法检测bcl-2、c-myc基因mRNA和蛋白的表达水平。结果:①一定浓度的NDGA处理SHG－44细胞12－96h,均可诱导SHG－44细胞发生凋亡,且随着作用时间的延长,凋亡细胞数增加越明显;②经NDGA处理细胞后,出现SHG－44细胞bcl-2、c-myc蛋白表达水平降低,且随着作用时间的延长,这种趋势更加明显,与细胞调亡的发生密切相关;③原位杂交结果显示,NDGA处理细胞不同时间后,出现SHG－44细胞bcl-2、c-myc基因mRNA的表达水平降低,结果与免疫组化检测一致。结论：NDGA诱导SHG－44细胞的凋亡可能与其下调bcl-2、c-myc基因的表达有关,但其确切机制有待进一步深入研究。     

五味子乙素对脑胶质瘤SHG-44细胞VEGF表达水平的影响及其细胞生长抑制作用

目的：探讨五味子乙素（Sch B）作用于脑胶质瘤SHG-44细胞后对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及细胞生长抑制作用,阐明其可能机制。方法：培养脑胶质瘤SHG-44细胞,将其分为对照组和Sch B　50、100、200 mg•L^-1组,MTT法检测不同剂量Sch B作用SHG-44细胞后其生长情况;酶联免疫吸附实验和细胞免疫组织化学方法观察Sch B作用后SHG-44细胞VEGF蛋白表达情况。结果：与对照组比较,200 mg•L^-1Sch B作用SHG-44细胞24 h,细胞增殖活性轻度增加（P<0.05）;Sch B （50、100 和200 mg•L^-1）作用48或72 h,细胞增殖活性明显降低（P<0.05或P<0.01）;200 mg•L^-1Sch B作用SHG-44细胞72 h,培养上清中VEGF蛋白表达水平明显降低(P<0.01）。与对照组比较,Sch B作用SHG-44细胞72 h后,Sch B 50、100和200 mg•L^-1组VEGF蛋白阳性表达率均明显降低（P<0.01）。结论：Sch B能明显抑制SHG-44细胞VEGF蛋白表达及细胞生长,提示Sch B可能通过抑制脑胶质瘤血管生成而发挥抗肿瘤作用。     

NPPB对人脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡的诱导作用及其机制

目的：探讨氯通道阻断剂5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（NPPB）对人脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡的诱导作用,并阐明其可能的机制。方法：体外培养脑胶质瘤SHG-44细胞,分为对照组及50、100和200 μmol·L^-1 NPPB组。采用MTT法检测细胞活力,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用免疫组织化学法和蛋白免疫印记法分别检测SHG-44细胞中凋亡蛋白的表达水平。结果：MTT检测,与对照组比较,作用24和48 h,100和200 μmol·L^-1 NPPB组SHG-44细胞活力明显降低（P < 0.01）。流式细胞术检测,100和200 μmol·L^-1 NPPB组细胞凋亡率分别为24.64%和41.85%,高于对照组（4.17%）（P < 0.01）。免疫组织化学和蛋白免疫印记法检测,100 μmol·L^-1 NPPB组SHG-44细胞中caspase-3和Bax蛋白表达水平升高（P < 0.05或P < 0.01）,Bcl-2蛋白表达水平降低（P < 0.05）。结论：NPPB可以通过下调Bcl-2的表达、上调Bax的表达,使caspase-3活化,进而引起SHG-44细胞凋亡。     

三苯氧胺对人脑胶质瘤细胞SHG-44增殖的影响

目的研究三苯氧胺（TAM）对人脑胶质瘤细胞SHG-44增殖的影响并探究其可能机制。方法将不同浓度TAM和脑胶质瘤细胞作用,分别用细胞划痕法、3H-TdR掺入法、流式细胞仪和免疫组化法检测细胞转移能力、细胞DNA合成情况、细胞周期改变和细胞凋亡率及雌激素受体的表达情况。结果TAM在体外能明显抑制SHG-44细胞转移,抑制细胞DNA合成,且抑制作用呈浓度依赖性。流式细胞仪显示细胞经TAM处理后,表现为G0/G1期和G2/M期细胞所占比例增加,而S期细胞所占比例减少。用0、2、10μmol/LTAM处理时细胞凋亡率分别为（2.05±0.28）%、（7.66±0.52）%和（19.00±0.77）%,SHG-44细胞不表达雌激素受体。结论TAM可能通过改变细胞周期和诱导细胞凋亡来抑制脑胶质瘤细胞SHG-44的生长。     

亚硒酸钠对脑胶质瘤细胞生长及线粒体膜电位的影响

目的:研究亚硒酸钠对人脑胶质瘤细胞生长抑制效应及线粒体膜电位的影响。方法:使用不同浓度的亚硒酸钠(0.004、0.020、0.100及0.500μmol/L)对人脑胶质瘤细胞SHG-44进行侵染,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测亚硒酸钠对SHG-44增殖的影响,提取细胞线粒体后通过激光扫描共聚焦显微镜下观察SHG-44的荧光强度,分析SHG-44的线粒体膜电位。结果:亚硒酸钠对人脑胶质瘤细胞生长具有明显的抑制作用,且随亚硒酸钠浓度的增加抑制作用逐渐加强,0.100及0.500μmol/L染硒组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),0.004及0.020μmol/L染硒组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);0.100、0.500μmol/L染硒组线粒体膜电位显著降低(P<0.05),0.004及0.020μmol/L组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:亚硒酸钠能抑制人脑胶质瘤细胞SHG-44生长,并且降低其线粒体膜电位。     

Celecoxib对SHG-44细胞株的放射增敏作用

目的评价Celecoxib联合放射作用对SHG-44细胞周期时相分布的影响,探讨Celecoxib调控细胞周期可能的信号通路机制。方法体外培养胶质瘤SHG-44细胞,以不同浓度Celecoxib（0μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）设立药物组（D组）,不同剂量（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy）6MV-X线照射设立放射组（R组）,二者交互设立药物＋放射组（D＋R组）,流式细胞术（FCM）检测细胞周期时相分布,逆转录PCR及实时PCR检测Cy-clinB1mRNA表达及水平。结果 FCM周期分析显示,细胞周期各时相分布在D组、R组及D＋R组中均有差异。其中D＋R组50μmol/LCelecoxib时,各照射剂量下与R组比较,G2/M期阻滞均进一步增强（P〈0.05）,但30μmol/L时各照射剂量下的G2/M期阻滞较R组均无明显增加（P〉0.05）。逆转录PCR显示各实验组Cyclin B1均表达;实时定量PCR进一步检测发现,D组30、50、100μmol/L时Cyclin B1表达均较空白对照（0μmol/L）明显降低（P〈0.05）,其中50μmol/L较0和30μmol/L下降明显（P〈0.05）,但50μmol/L和100μmol/L之间差异无统计学意义（P〉0.05）;D＋R组仅在100μmol/L时Cyclin B1表达较D组明显下降,其余浓度（0、30、50μmol/L）D＋R组较D组无明显下降（P〉0.05）。结论 Celecoxib在一定浓度下使SHG-44细胞发生G2/M期阻滞,并可进一步增强放射作用后的G2/M期阻滞,其放射增敏效应可能与下调细胞周期信号传导通路中的下游靶基因Cyclin B1有关。     

碘-125对胶质瘤SHG-44细胞的细胞程序性死亡作用及相关基因表达的影响

目的：观察碘-125（125I）粒子对体外培养的人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44的生长抑制及诱导细胞程序性死亡作用,阐明此过程中相关基因的作用机制。方法：人脑恶性胶质瘤细胞株SHG-44,根据应用125I粒子剂量不同分为对照组与处理组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测125I粒子对SHG-44细胞增殖率的影响;用电镜和原位凋亡检测法(TUNEL)及流式细胞仪、吖啶噔／溴乙啶双荧光染色检测细胞程序性死亡改变,应用基因芯片技术筛选出处理前后与细胞程序性死亡有关的表达差异有统计学意义的基因。结果：125I粒子作用于体外培养的SHG-44胶质瘤细胞,产生了剂量、时间依赖性的增殖抑制作用。MTT比色法检测,经125I粒子处理的SHG-44人胶质瘤细胞,随放射剂量的增加和作用时间的延长,A值明显降低。经2粒125I粒子作用3 d（累积剂量86.8 MBq）抑制率约为50%,与对照组比较差异有显著性（P<0.05）。透射电镜下观察到处理后SHG44胶质瘤细胞中频繁细胞自噬现象。流式细胞仪检测,S期细胞数在作用后逐渐减少,而G1期和 G2/M期细胞比例显著增加。虽然细胞中凋亡细胞的比例随时间的延长有所增加,但比例未超过2％。筛选出SHG-44胶质瘤细胞在125I粒子作用前后差异表达且与程序性死亡相关的基因共56条(上调 36条,下调20条)。结论：125I粒子以剂量、时间依赖性方式通过细胞程序性死亡来抑制胶质瘤细胞的增殖,促进细胞向凋亡方向转化;125I粒子诱导下的细胞系中还存在非凋亡调控的细胞程序性死亡(自噬);胶质瘤细胞凋亡过程中相关基因p53/ATM通路的基因、c-myc家族、p16、Bcl-2家族等参与诱导胶质瘤细胞程序性死亡的发生机制。