缺氧诱导因子1α对人羊膜间充质干细胞耐受缺氧能力影响的实验研究北大核心CSCD

目的通过瞬时转染缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因,观察缺氧处理后人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)成活及凋亡情况,探讨HIF-1α对hAMSCs耐受缺氧能力的影响。方法取健康剖宫产产妇自愿捐赠的羊膜组织分离、培养hAMSCs,通过倒置相差显微镜观察细胞形态及免疫荧光法检测干细胞标志物OCT-4、NANOG表达,对培养细胞进行鉴定。取第3代hAMSCs进行缺氧处理(200μmol/L CoCl_2)后,按以下分组瞬时转染对应质粒:A组为hAMSCs空白组,B组为pcDNA3.1阴性对照组,C组为shRNA阴性对照组,D组为shRNA-HIF-1α干扰组,E组为pcDNA3.1-HIF-1α过表达组。缺氧处理后12、24、48 h采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测各组细胞成活率;24 h采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,并采用Western blot检测HIF-1α、VEGF、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma2,Bcl-2)、Bax、活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3,C-Caspase-3)蛋白表达。结果 CCK-8法检测示,缺氧处理后各时间点与A、C组比较,D组细胞成活率明显降低(P<0.05);与A、B组比较,E组细胞成活率明显升高,其中24 h组间比较差异有统计学意义(P<0.05);E组内24 h时细胞成活率明显高于12、48 h时(P<0.05)。流式细胞仪检测示,与A、C组比较,D组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与A、B组比较,E组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。Western blot检测示,与A、C组比较,D组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax、CCaspase-3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而E组结果相反,与A、B组比较,E组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax、C-Caspase-3蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HIF-1α基因过表达能够明显改善hAMSCs耐受缺氧能力,其机制可能与上调VEGF和Bcl-2表达及下调Bax和C-Caspase-3表达作用相关。     

不同冻存方法对大鼠脂肪来源干细胞生物学特性的影响

目的：研究不同冻存方法对脂肪来源干细胞（Adipose-derivedstemcells,ADSCs）生物学特性的影响。方法：体外分离培养SD大鼠腹股沟及附睾周围的脂肪组织，取第三代ADSCs冻存于液氮。实验分为三组：对照组A组为非冻存细胞，B组使用无血清非程序冻存液冻存细胞，C组使用传统冻存液（DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1）冻存细胞。12个月后复苏ADSCs，通过对比ADSCs的表面抗原、细胞凋亡、增殖及成骨分化情况，分析各组ADSCs生物学性能的差异。结果：各组细胞高表达CD29、CD90;A、B两组细胞的凋亡率显著低于C组（P<0.05）;B、C两组的增殖情况和A组相比，差异无统计学意义（P>0.05）,B组细胞的成骨分化能力要优于C组（P<0.05）。结论：无血清非程序冻存液冻存ADSCs的效果要优于传统冻存液。     

软骨终板通透性对体外培养大鼠髓核细胞生物学特性的影响

目的:观察软骨终板营养通路通透性对外培养大鼠髓核细胞生物学特性的影响。方法:4周龄雄性SD大鼠20只,处死后立即手术切取腰段椎间盘(包括邻近的软骨终板),每只6个,随机分为A、B、C 3组,其中A组为正常对照组,B组用骨蜡封闭上软骨终板,C组用骨蜡封闭上、下软骨终板,3组椎间盘在体外进行整体器官培养。于培养前和培养7d、14d时,分别用Mitotracker Green荧光探针和RT-PCR方法评估椎间盘髓核细胞的活力和髓核Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA的表达;于培养前和培养14d时用免疫组化方法观察髓核蛋白多糖、Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶3(MMP-3)的表达。结果:取材后培养前髓核细胞的荧光强度最高;在体外培养7d,3组髓核细胞的荧光强度较培养前变化均不明显,3组之间无显著性差异(P>0.05);培养14d时A、B、C组荧光强度较培养前分别降低约19%、22%和30%,与培养前比较差异均有显著性(P<0.05),其中C组与A、B两组比较有显著性差异(P<0.05),A、B两组比较差异无显著性(P>0.05)。免疫组织化学观察显示在培养14d时3组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的染色强度与培养前比较均有所降低,MMP-3阳性染色增加,蛋白多糖、Ⅱ型胶原和MMP-3染色强度的变化以C组最为明显。3组髓核细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达在培养7d和14d时均较培养前显著降低(P<0.05),其中7d时3组之间无显著性差异(P>0.05),14d时A、B两组间无显著性差异(P>0.05),C组与A、B组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:降低体外培养大鼠椎间盘上下软骨终板的通透性,可在短期内影响髓核细胞的生物学特性,加速椎间盘的退变。     

硫酸软骨素酶ABC及Nogo-66受体拮抗剂联合鼠胚神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤的影响

目的:研究硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)、Nogo-66受体拮抗剂[Nogo-66(1-40)antagonist peptide,NEP1-40]及鼠胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合移植对大鼠损伤脊髓功能恢复的影响。方法:体外应用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)(浓度1.0μmol/L)诱导NSCs(前期实验分离、培养并冻存的鼠胚NSCs),诱导后鉴定NSCs特异性标志物,移植前通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Brdu)标记NSCs。将60只SD大鼠随机分为假手术组(A组,n=10)、损伤对照组(B组,n=10)、NSCs治疗组(C组,n=10)、NSCs联合Ch ABC治疗组(D组,n=10)、NSCs联合NEP1-40治疗组(E组,n=10)、NSCs联合Ch ABC和NEP1-40治疗组(F组,n=10)。移植前分别对B、C、D、E及F组的大鼠制作胸段脊髓全横断损伤模型。术后3d,E和F组经留置的导管注入NEP1-40 20μl/d,连续28d;术后8d,C、D、E及F组经留置导管注入经ATRA干预和Brd U标记的NSCs 10μl;术后8d,D组和F组经留置导管注入Ch ABC 10μl/d,连续7d;各时间点通过留置导管注入生理盐水保持各组移植液等量。术前及术后不同时间点,用BBB评分和体感诱发电位(somatosensory evoked potentials,SEP)潜伏期对大鼠后肢神经功能进行评价。移植后8周通过HE染色观察损伤脊髓组织情况,免疫荧光染色观察移植NSCs存活、神经元分化及轴突生长情况。结果:体外应用1.0μmol/L的ATRA诱导NSCs培养,可提高NSCs向神经元分化的比例。移植后2周开始各组大鼠BBB评分、SEP潜伏期开始观察到改善,移植治疗各组均优于损伤对照组,组间BBB评分和SEP潜伏期有差异(P0.05);移植后2周、5周、8周各时间点,B组与C、D、E及F组比较,BBB评分和SEP潜伏期较差(P0.05);在移植治疗各组中,F组神经功能的恢复最明显,F组与C、D及E组比较具有较高的BBB评分和较短SEP潜伏期(P0.05)。移植后8周,HE染色显示:A组细胞结构完整、排列规则;B组组织结构严重破坏,细胞排列紊乱,见大量较大的囊腔及胶质瘢痕形成;C、D、E及F组细胞增生明显,囊腔较少。免疫荧光染色显示:C、D、E及F组内可见橘红色Brdu标记阳性细胞,F组阳性细胞数多于C、D和E组,差异具有统计学意义(P0.05)。C、D、E、F组微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)标记阳性细胞数多于B组,F组多于C、D、E组,差异有统计学意义(P0.05);C、D、E、F组MAP-2标记阳性细胞面积大于B组,F组大于C、D、E组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:ATRA诱导后NSCs移植可促进大鼠脊髓损伤功能的恢复,且联合Ch ABC和NEP1-40移植对损伤脊髓功能的恢复具有协同促进作用。     

超短波治疗大鼠断尾再植后血管危象的实验研究

目的探讨超短波(ultrashort wave,USW)对鼠断尾再植后血管危象的影响及作用机制。方法取3月龄雌性SD大鼠80只,体重232.8～289.6 g,随机分为5组。各组保留尾侧静脉、尾骨后断离鼠尾,A组结扎尾动脉;B、C、D、E组均吻合尾动脉,建立断尾再植模型。术后B组正常管理;C组立即按3.125 mL/kg剂量腹腔注射稀释的盐酸罂粟碱注射液(1 mg/mL)。D、E组立即给予局部吻合口处USW治疗(1次/d),至术后5 d,D组剂量:3档,50 mA,20 min;E组剂量:2档,28 mA,20 min。术后观察鼠尾成活情况至10 d;手术前后测鼠尾吻合口近远侧皮温差并计算术后与术前的变化值;术前从内眦及术后8 h从尾尖各采血1次检测血浆一氧化氮(nitric oxide,NO)浓度并进行比较。结果术后7 d A、B、C、D、E组鼠尾成活率分别为0(0/14)、36.4%(8/22)、57.1%(8/14)、22.2%(4/18)、75.0%(9/12),组间比较差异有统计学意义(χ2=19.935,P=0.001);E组成活率显著高于B组(P<0.05),其余各组两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术前各组间鼠尾皮温差比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术后8 h、5 d、6 d及7 d各组间比较鼠尾皮温差变化值差异均有统计学意义(P<0.05),其中术后8 h B组皮温差变化值大于D组(P<0.05);术后5 d C组大于D组(P<0.05);术后6 d A、B、C组均大于D组(P<0.05);术后7 d A、E组低于B、C组(P<0.05),D组低于B组(P<0.05);其余各组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术前各组血浆NO含量差异无统计学意义(P>0.05)。术后8 h A、B、C组血浆NO含量显著低于D组(P<0.05),手术前后变化值A、B组显著低于D组(P<0.05);其余各组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论实验中大鼠断尾再植模型可行。USW治疗能提高鼠断尾再植成活率,在术后7 d内能减小皮温差,提高术后早期NO浓度,防治血管危象。     

力学刺激联合诱导因子对组织工程软骨的影响

目的力学刺激与诱导因子是软骨组织工程中的重要诱导因素,研究力学刺激联合诱导因子对组织工程软骨的影响。方法 7日龄长枫杂交仔猪,体重3～6 kg,用于分离培养BMSCs,取第2代细胞以5×107个/mL密度接种于聚羟基乙酸-聚乳酸[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]支架上制备细胞-支架复合物。实验随机分为5组,A、B、C组分别对细胞-支架复合物采用软骨诱导培养液诱导、单纯力学加载、力学加载联合软骨诱导液培养处理,其中力学加载参数为1 Hz、0.5 MPa、4 h/d;D、E组分别为单纯细胞-支架复合物阴性对照和猪自体软骨阳性对照。4周后各组分别取材行大体观察、组织学检测及实时荧光定量PCR检测。结果 C组细胞-支架复合物厚度、弹性模量及最大值负荷均显著高于A、B组(P<0.05)。A、B、C组组织切片HE染色均可见有软骨陷窝形成,番红O染色提示支架复合物的细胞外基质中有大量蛋白聚糖(glycosaminoglycan,GAG)形成,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均显示阳性结果,其中A组染色深度强于B组,C组强于A、B组,且最接近E组;C组GAG含量显著高于A、B组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测示,C组Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA表达量均显著高于A、B组,且A组各基因表达量均高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论力学刺激联合软骨诱导因子能更好地促进细胞-支架复合物上的BMSCs产生更多胶原和GAG等细胞外基质,增强其力学特性,更有助于其向软骨细胞分化。     

嗅鞘细胞联合VEGF对大鼠损伤脊髓的保护作用

目的探讨嗅球源性嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植联合鞘内重复注射VEGF对损伤脊髓功能恢复的促进作用,以及二者对神经元和神经纤维的协同保护作用。方法取新生2～3 d大鼠嗅球分离纯化培养OECs,于培养9 d用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞。将75只成年雌性Wistar大鼠(体重200～250 g)随机分为5组,A组为假手术组,仅行椎板切除术。B、C、D、E组采用重力打击法制作脊髓损伤模型后,B组术后1 d于脊髓损伤部位分4点共注射DMEM-F12无血清培养基10μL,并每天2次鞘内注射生理盐水10μL,持续1周;C组同上法分别注射DMEM-F12培养基10μL及重组大鼠VEGF165(recombined rat VEGF165,rrVEGF165)25 ng;D组注射含1×105个OECs的DMEM-F12培养基10μL及生理盐水10μL;E组注射含1×105个OECs的DMEM-F12培养基10μL及rrVEGF165 25 ng。术后1 d及术后1～8周每周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分标准评定大鼠后肢功能恢复情况;术后8周处死实验动物,取材行透射电镜、HE染色观察,并行p75NGF受体(p75 NGF receptor,p75NGFR)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspases-3)、血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)免疫组织化学染色,评价损伤脊髓修复情况。结果术后E组大鼠后肢功能恢复较快,8周时BBB评分显著高于其余各组(P<0.05)。透射电镜和HE染色显示:B组有髓神经纤维和神经元受损严重;C、D组损伤轻于B组;E组受损最轻,断端间残存组织较多,有髓神经纤维髓鞘较完整,神经元呈多角形,有少量空泡化的线粒体。免疫组织化学染色示,B、C、D、E组Caspase-3阳性细胞数显著多于A组(P<0.05),B、D组明显多于C、E组(P<0.05),C、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。C、E组vWF阳性血管数多于A、B、D组(P<0.05),但C、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。D、E组均可见p75NGFR阳性OECs。结论 OECs移植联合鞘内重复注射VEGF可显著促进大鼠脊髓损伤修复,部分恢复损伤神经功能,对受损神经纤维和神经元的变性有保护作用,且二者有协同作用。     

重组人红细胞生成素治疗大鼠急性脊髓损伤的用药时间窗探讨

目的:探讨腹腔注射重组人红细胞生成素(rHuEPO)治疗大鼠急性脊髓损伤(ASCI)的用药时间窗.方法:采用显微血管夹夹伤雌性SD大鼠T10脊髓建立脊髓急性损伤模型,将造模成功后的40只大鼠随机分为A、B、C、D、E组,每组8只.A、B、C、D组分别于损伤后即刻、1h、3h和6h腹腔注射rHuEPO 50001U/kg,E组损伤后立即腹腔注射等量生理盐水,作为对照组.各组大鼠于术后1d、3d、5d、7d进行BBB运动学评分,并于术后3d、7d用TUNEL染色和caspase-3免疫组化染色法检测各组大鼠脊髓神经细胞凋亡情况.结果:术后1d、3d各组大鼠BBB评分无统计学差异(P>0.05);5d时A、B、C三组BBB评分均高于D、E两组(P<0.01),A、B、C 三组间与D、E组间无统计学差异(P>0.05);7d时D组BBB评分高于E组(P<0.01),但低于A、B、C三组(P<0.01),而A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05).损伤后3d、7d,A～D组的TUNEL、caspase-3染色阳性细胞均高于E组,且损伤后7d时D组TUNEL染色阳性细胞数高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异;损伤后3d.D组caspase-3染色细胞阳性率高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05),损伤后7d,A～D组间无统计学差异(P>0.05).结论:大鼠ASCI后3h内给予rHuEPO可以显著改善运动功能恢复情况,并抑制伤后脊髓神经细胞凋亡现象的发生;伤后6h给药效果较差.     

hBMP7基因修饰的髓核细胞与同种异体椎间盘复合后体内原位移植的实验研究

目的 探讨用人骨形态发生蛋白7（human bone morphogenetic protein 7, hBMP7）基因修饰的犬髓核细胞与同种异体椎间盘复合后体内原位移植的方法阻止或延缓同种异体椎间盘移植后退变的能力。方法 将18个比格犬椎间盘（L4-5）置于-196 ℃冻存液中保存2个月,随机分为A、B、C三组,A组以rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞,将能够表达hBMP7蛋白的髓核细胞悬液（5×10⁶ 个/ml,20 μl）注射入复温后的椎间盘中体外培养,B组以相同数量未转染的hBMP7的髓核细胞注入椎间盘后体外培养,C组以20 μl DMEM/F12细胞培养液生理盐水注射后体外培养。将培养7 d的3组椎间盘分别移植至15只比格犬的L4-5,在术前、术后即刻及术后1、3、6个月通过X线检测移植椎间盘的愈合情况及其高度变化;通过MRI T2像分析椎间盘的退变情况;术后6个月时处死动物取材,分析腰椎屈伸、侧弯及扭转的生物力学变化;组织学染色检测椎间盘的结构及退变情况;PCR法检测3组髓核组织中hBMP7 mRNA的表达。结果 X线检测显示3组移植椎间盘高度变化指数（DHVI）差异无统计学意义（P＞0.05）;MRI检测结果显示：在术后12、24周时,B、C两组移植椎间盘的MRI T2像信号灰度比明显低于A组（P＜0.05）;生物力学检测结果显示：C组的左右扭转度明显大于A、B组（P＜0.05）,而A、B两组间的差异无统计学意义（P＞0.05）,而对屈伸及侧弯活动度检测发现3组间差异无统计学意义;PCR检测结果显示：6个月时A组仍可检测到hBMP mRNA的高表达;组织学检测结果显示：移植后6个月时仍有外源性髓核细胞存活,A组相对于B、C两组髓核结构更加完整,所含细胞外基质更多。结论 表达hBMP7的髓核细胞能阻止同种异体椎间盘移植后的退变性。     

不同配比冻存液对兔脂肪干细胞液氮冻存效果的研究

目的:探究不同浓度配比冻存液对脂肪干细胞(Adipose-derived Stem Cells,ADSCs)冻存复苏后存活率及增殖活性的影响。方法:无菌条件下取新西兰大白兔的脂肪组织,体外分离、培养ADSCs并传代至第3代,行免疫细胞化学染色对其表面标志物进行鉴定,同时对其行成软骨及成表皮细胞诱导以证实其多项分化能力。将第3代ADSCs置于液氮(-196℃)中冻存,根据冻存液中培养基(DMEM)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)及二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)的配比不同分为8组:1含不同浓度FBS配比分组:A组(70%DMEM+20%FBS+10%DMSO)、B组(60%DMEM+30%FBS+10%DMSO)、C组(50%DMEM+40%FBS+10%DMSO)、D组(含有40%DMEM+50%FBS+10%DMSO);2含不同浓度DMSO配比分组:E组(55%DMEM+40%FBS+5%DMSO)、F组(50%DMEM+40%FBS+10%DMSO)、G组(45%DMEM+40%FBS+15%DMSO)、H组(40%DMEM+40%FBS+20%DMSO)。细胞冻存三个月后,对其进行复苏并观察细胞形态学变化;通过细胞计数计算细胞存活率;采用MTT法绘制复苏后细胞生长曲线,以测定其生长增殖情况。结果:细胞复苏后,通过细胞计数计算结果显示C、D组存活率明显高于A、B组(P0.05),E、F、G、H四组之间有统计学意义(P0.01);MTT法结果显示C、D、F组的增殖曲线与未冻存组无明显差异(P0.05)。结论:从兔脂肪组织中成功分离出了ADSCs,并且能在体外培养过程中稳定生长,快速增殖;ADSCs冻存液比例选择以DMEM:FBS:DMSO=5:4∶1的冻存效果最好。     

Depressed cytotoxic activity of hepatic nonparenchymal cells in rats with obstructive jaundice

BACKGROUND: The nonparenchymal cells (NPC) of the liver have strong cytotoxic activity. Our hypothesis is that their activity may be imparted by obstructive jaundice and show recovery after biliary drainage. METHODS: In Donryu rats, we performed either a sham operation (group C; n = 5), production of irreversible obstructive jaundice (group J; n = 5), or production of reversible obstructive jaundice for 7 days, with biliary drainage then provided for 3 days (group Ds; n = 5) or for 14 days (group Dl; n = 5). Natural killer (NK)-cell activities shown against YAC-1 lymphoma cells of hepatic NPC and peripheral blood mononuclear cells were assessed. We then measured the growth of experimental liver metastases 13 days after inoculation of a tumor cell line (AH130) into the portal vein of rats that had undergone similar biliary manipulations (group mC, group mJ, group mDs, and group mDl; n = 5 in each group). RESULTS: The highest number of NK activities by NPC in group J (11.5%) and group Ds (37.7%) were significantly lower than those in group C (68.8%) and group Dl (90.5%; effector/target ratios, 40:1; P < .01). NK activity of peripheral blood mononuclear cells was similar among groups. Metastatic liver tumors in group mJ (10.2% +/- 2.6%) and group mDs (5.4% +/- 1.5%) were significantly larger than in group mC (0.4% +/- 0.1%) and group mDl (0.5% +/- 0.3%; P < .02). CONCLUSIONS: Obstructive jaundice depressed the NK activity of hepatic NPC and enhanced the growth of liver metastases. To counter this depression, adequate biliary drainage was required. These results suggest that preoperative biliary drainage to relieve obstructive jaundice might help to prevent liver metastases after surgery for biliary tract or pancreatic tumors.     

同种异基因肝脏非实质细胞对小鼠移植皮片存活的影响

目的探讨输注同种异基因肝脏非实质细胞(NPC)对小鼠移植皮片存活的影响及其机制。方法选用123只近交系小鼠,其中C3H小鼠65只、C57BL/6小鼠58只。20只C3H小鼠作移植供体;40只C3H小鼠肝脏为NPC来源;余下5只C3H小鼠作混合淋巴细胞培养(MLC)的刺激物,由每分钟放射性荧光闪烁计数(cpm)值表示。58只C57BL/6小鼠分为实验组50只、对照组8只。对照组小鼠仅作皮肤移植,未行NPC输注。实验组50只小鼠尾静脉输入由40只C3H小鼠肝脏制备的2×107个NPC,48h后腹腔注射环磷酰胺200mg/kg,并接受C3H小鼠皮片移植。于NPC输注前及输注后各时相点处死实验组小鼠,每时相点5只。检测血清白细胞介素(IL)4水平、脾淋巴细胞嵌合体水平及cpm值,并观察2组小鼠的存活时间。结果实验组小鼠皮片存活时间为(70.0±17.2)d明显长于对照组;NPC输注后IL4、嵌合体水平逐渐上升,而cpm值逐渐降低。NPC输注后60d实验组小鼠IL4为(251.5±11.0)ng/L,脾脏嵌合体水平达到(26.30±1.04)%。结论IL4、嵌合体水平的升高对诱导和保持免疫耐受起着重要的作用。     

胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生研究

目的：分离培养胎鼠的表皮干细胞及毛囊乳头层细胞，通过动物模型观察两者复合移植后，上皮形成及毛囊的再生情况。方法：采用IV型胶原分离培养胎鼠表皮干细胞，检测β1整合素及角蛋白15的表达水平，测定其细胞周期及克隆形成率（以角质细胞为对照）；分离培养毛囊乳头层细胞，并接种在纤维蛋白胶中，与表皮干细胞膜片复合形成全层皮肤等同物，移植在裸鼠全层皮肤缺损创面作为实验组，同时将胎鼠成纤维细胞替代乳头层细胞作为对照组，8－10周后观察创面及囊的组织学变化。结果：胎鼠表皮干细胞表达高水平的β1整合素及角蛋白15；细胞周期分析显示，G1期细胞百分率为94．9％，S期为3．5％，提示为慢循环细胞周期；角质细胞的G1期细胞有百分率为74．1％，S期为17．5％；表皮干细胞的克隆形成率为15．3％，明显高于对照组的6．7％；裸鼠创面愈合后8－10周，实验组可见新生毛囊形成，对照组未见到此现象。结论：能初步实现对胎鼠表皮干细胞的体外分离培养；在毛囊乳头层细胞的诱导下，胎鼠表皮干细胞可参与形成新的毛囊结构。     

半相合基因骨髓细胞移植小鼠的嵌合体程度对移植物抗肿瘤效应的影响

目的 探讨半相合基因骨髓细胞移植后受体形成的嵌合体程度对抗肿瘤效果的影响.方法 25只BALB/C青春期小鼠随机分为3组:混合型嵌合体组(A组,10只)、完全型嵌合体组(B组,10只)、对照组(C组,5只).首先,A、B组小鼠行直线加速器全身照射,剂量分别为4、8Gy,照射后4～6 h内经尾静脉注射入CB6F1代小鼠的骨髓细胞(5×106/只),C组无处理.A、B、C三组均给予Renca肾癌细胞腋窝下注射,每只2.6×106.观察所有组别小鼠的肿瘤生长速率,通过流式细胞仪测定A、B组小鼠移植后不同时间的嵌合体水平.荷瘤32 d时断颈处死小鼠,取肿瘤组织称重.结果 (1)流式细胞术鉴定血液白细胞中供者源细胞比例:A组移植后2周后形成混合嵌合体(47.51%～72.64%)并达高峰,以后逐渐下降,3～4周时下降至10%以下.B组小鼠移植后14 d形成完全供者型嵌合体(供体细胞＞90%),28 d后仍达90%以上.(2)与对照组和混合型嵌合体组比较,完全型嵌合体组的肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤重量显著减小(P＜0.01),抑瘤率高达52%.结论 半相合基因骨髓细胞移植后形成的稳定的完全型嵌合体状态是抗肿瘤效应的基础.     

Presence of Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 gene in the nasopharyngeal swabs from patients with nasopharyngeal carcinoma.

BACKGROUND: Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is the most common head and neck malignancy in southeastern China and Taiwan. Early detection of the local disease followed immediately by proper treatment is essential to increase the cure and survival rates. Because every NPC tumor cell carries Epstein-Barr Virus (EBV) genomes, detection of EBV genomic DNA such as latent membrane protein 1 gene (LMP1) might indicate the presence of NPC. We developed a simple and noninvasive technique of nasopharyngeal swabbing to acquire nasopharyngeal cells for detecting the presence of EBV genome. The aim of this study was to investigate the feasibility and reliability of this technique. METHODS: We collected nasopharyngeal cells by means of a nasopharyngeal swabbing technique and detected the presence of EBV LMP1 with polymerase chain reaction (PCR). Thirty-eight swab specimens were obtained from patients with NPC who were newly diagnosed or were just beginning radiotherapy. Two groups of control subjects were recruited, including 20 patients with other head and neck cancers and eight family members of the NPC patients. An additional group of 65 NPC patients were enrolled in the course of regular follow-up after definitive radiotherapy. RESULTS: All of the samples yielded sufficient DNA for PCR amplification. Thirty-six of 38 NPC swab samples were positive for EBV LMP1, and all the control subjects had swab sample results negative for EBV. All five patients with suspected local recurrence exhibited positive EBV test results. CONCLUSIONS: Demonstration of EBV LMP1 in the nasopharyngeal swab specimens detected NPC with a sensitivity of 94.7% and specificity of 100%. This study confirms the reliability and feasibility of nasopharyngeal swab in the predicting and screening of NPC.     

Influence of humoral immunoreaction on hepatic nonparenchymal cells in ex situ xenoperfused rat livers

BACKGROUND: The influence of xenogeneic humoral immunoreaction on hepatic nonparenchymal cells (NPCs) was evaluated ex situ in xenoperfused rat livers. METHODS: Isolated rat livers were perfused via the portal vein (PV) for 240 min. The perfusates consisted of fresh rat blood (group 1), fresh human blood (group 2), and fresh human blood containing 5 microg/mL soluble complement receptor type 1 (Group 3). RESULTS: Deposition of human IgM and C(5b-9) complement was observed in group 2, although only human IgM deposition was detected in group 3. Portal vein pressure in group 2 rose drastically during the first 10 min. Creatine kinase BB component gradually increased in all groups, followed by an elevation in alanine aminotransferase and both parameters were significantly higher in group 2 than in groups 1 and 3. In group 2, platelet thrombi in the peripheral PVs and periportal hemorrhage were observed after 10 min, and massive necrosis around the central veins after 240 min; these changes were not observed in group 1 or 3. Production of tumor necrosis factor alpha and alpha interferon and expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) were lower in group 2 than in groups 1 and 3. In group 2, there were negative areas for ICAM-1 and tumor necrosis factor alpha staining around the central veins after 240 min, which were consistent with necrotic areas. CONCLUSIONS: In xenoperfused rat livers, humoral mediators initially caused the disturbance of microcirculation, which would induce long ischemia in the pericentral areas, resulting in massive necrosis. NPC necrosis may be responsible for less production of cytokines and adhesion molecules in the xenoperfused livers.     

降钙素基因相关肽对人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响及机制研究

目的组织工程骨的神经化能有效促进支架材料内血管生成,修复骨缺损。研究降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖与迁移的作用,进一步揭示组织工程骨的神经化促血管生成机制。方法体外分离获取HUVECs,并通过血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)与CD31抗原鉴定,取第1代细胞用于实验。实验分为6组,分别以0(A组)、1×10—12(B组)、1×10—11(C组)、1×10—10(D组)、1×10—9(E组)、1×10—8mol/L(F组)浓度CGRP干预HUVECs。采用细胞免疫荧光观察HUVECs的CGRP1受体(CGRP1 receptor,CGRP1R)表达情况,AlarmarBlue法动态检测各组HUVECs增殖率,Transwell小室检测各组HUVECs的迁移能力,ELISA法检测HUVECs分泌VEGF的水平,Westernblot法检测其局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的表达。结果分离的细胞通过形态学及vWF、CD31免疫荧光鉴定为HUVECs,并可见CGRP1R在细胞质和细胞膜表达。CGRP呈时间-浓度依赖性刺激HUVECs增殖;B～F组各时间点细胞增殖能力均高于A组(P<0.05),F组各时间点细胞增殖能力最高。B～F组迁移细胞数均显著高于A组(P<0.05),最大增幅达3倍以上。B～F组VEGF分泌量均显著高于A组(P<0.05);C、D组促进细胞分泌VEGF的能力最强。Western blot检测示,与A组相比,B～F组CGRP刺激HUVECs 3、7、10 d后,FAK表达明显增加(P<0.05)。结论 CGRP对HUVECs的增殖和迁移有直接促进作用,可能作用机制为CGRP能促进VEGF分泌和增加FAK的表达。     

淫羊藿苷对高重力环境下成骨细胞黏附和细胞骨架的影响

目的通过高加速度离心加载装置建立高重力加载模型,探讨不同高重力加载环境对成骨细胞黏附及细胞骨架的影响,并且分析淫羊藿苷对高重力加载后细胞黏附和细胞骨架的影响。方法将MC3T3-E1细胞按2×105个/cm2的密度接种于细胞培养皿中。实验共分为6组:对照组、单纯给药组、10 G加载组、10 G给药组、40 G加载组、40 G给药组。加载组应用高加速度离心加载机对细胞施行加载,连续加载3 d,每天30 min。对照组和单纯给药组暴露于正常重力情况下,其余条件与实验组无差别。给药组淫羊藿苷均采用10-7 mol/L浓度,且按预防给药的方法实验。通过茜素红染色、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、CCK-8细胞增殖实验、细胞骨架鬼笔环肽染色、qPCR和Western Blot等相关分子生物学技术检测淫羊藿苷对高重力环境下成骨细胞integrinα5、integrinβ1和F-actin的影响。结果所有模型均成功制备。茜素红染色:淫羊藿苷可促进成骨细胞钙化结节形成,10 G加载可促进成骨细胞矿化,而40 G加载则抑制成骨细胞的矿化。ALP活性检测:单纯给药组、10 G加载组、40 G加载组的检测OD值分别为0.246、0.331、0.163,与对照组的0.207相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10 G给药组和40 G给药组分别为0.373和0.180,与各自加载组的差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8增殖实验:单纯给药组OD值为0.650,与对照组0.551的差异有统计学意义(P=0.031);10 G加载组和40 G加载组OD值分别为1.193和0.245,与对照组的差异均有统计学意义(P<0.05);且10 G给药组和40 G给药组1.300和0.310,与各自加载组的差异有统计学意义(P<0.05)。鬼笔环肽染色:10 G加载细胞促进的数量增加,但细胞形态及骨架未见明显变化,40 G加载则抑制,淫羊藿苷对细胞形态无影响,但对加载损伤后的细胞有一定修复作用。QPCR和Western Blot实验结果一致证实,淫羊藿苷作用后,integrinα5、integrinβ1和F-actin的mRNA和蛋白表达上调,10 G加载可促进integrinα5、integrinβ1和F-actin mRNA和蛋白的表达,40 G加载则明显抑制其mRNA和蛋白的表达。结论10 G条件和淫羊藿苷干预均可促进成骨细胞的生长发育、细胞黏附及细胞骨架的稳定,而40 G则具有明显抑制作用。     

浸泡时间与关节软骨冷冻保存的关系

目的　寻求更佳的关节软骨冷冻保存方法。方法　设计两步冷冻法中的不同浸泡时间,对新西兰兔的关节软骨进行冷冻保存。软骨取材后,随机分成五组,Ⅰ组为新鲜对照组,Ⅱ～Ⅴ组为冷冻组,冷冻前先在4℃10%DMSO中浸泡30分钟（Ⅱ组）、1时（Ⅲ组）、2小时（Ⅳ组）及4小时（Ⅴ组）,然后均置超低温冰箱中以-1℃/min的速度降温至-60℃,维持1小时后,投入液氮中保存1周。复温后行透射电镜检查、台盼蓝染色、软骨细胞培养3HTdR掺入率测定。结果　①软骨组织冷冻后,软骨细胞均受到不同程度的损伤。Ⅰ组活细胞率96%,3HTdR掺入率为(4953.13±583.27)%,Ⅱ～Ⅴ组与之比较,有非常显著性差异(P＜0.01)。Ⅰ组超微结构完全正常,而Ⅱ～Ⅴ组均显示细胞器损伤。②Ⅳ组的细胞结构和功能最佳,电镜检查仅见轻度细胞器损伤,活细胞率为56%,3HTdR掺入率(1139.88±146.39)%;Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ组与之比较,有非常显著性差异(P＜0.01)。结论　关节软骨在冷冻之前,先浸泡4℃10%DMSO中2小时,可提高软骨细胞的存活率。     

舒芬太尼对高糖孵育下 H9c2细胞缺氧复氧损伤的影响

目的 评价舒芬太尼对高糖孵育下H9c2细胞缺氧复氧损伤的影响.方法 取H9c2细胞在含10%胎牛血清低糖DMEM/F12完全培养基中培养、传代,细胞接种于96孔(100μl/孔)和6孔(2ml/孔)细胞培养板,接种密度105/ml.采用随机数字表法,将细胞随机分为5组,每组12孔,正常糖对照组(NC组)用低糖培养基孵育细胞48 h;高糖对照组(HC组)用高糖(25 mmol/L)培养基孵育细胞48h;高糖+缺氧复氧组(HAR组)用高糖培养基孵育细胞48 h后,行缺氧3 h复氧3 h;高糖+舒芬太尼+缺氧复氧组(HSAR组)用高糖培养基孵育细胞48 h后加入舒芬太尼(终浓度为10-9mol/L),15min后行缺氧复氧处理;高糖+纳洛酮+缺氧复氧组(HNAR组)用高糖培养基孵育细胞48 h后加入纳洛酮(终浓度为10-6mol/L),10 min后加入舒芬太尼(终浓度为10-9mol/L),15 min后行缺氧复氧处理.各组处理后收集细胞,用MTT法测定细胞活力;收集细胞培养液测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;超声破碎法采集细胞匀浆液,采用黄嘌呤氧化酶法测定细胞SOD活性.结果 与NC组比较,其余各组细胞活力和SOD活性降低,LDH漏出量增多(P＜0.01).与HC组比较,HAR组和HNAR组细胞活力和SOD活性降低,LDH漏出量增多(P＜0.01).与HAR组比较,HSAR组细胞活力和SOD活性升高,LDH漏出量减少(P＜O.01),HNAR组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).与HSAR组比较,HNAR组细胞活力和SOD活性降低,LDH漏出量增多(P＜0.01).结论 舒芬太尼可减轻高糖孵育下H9c2细胞缺氧复氧损伤,其机制可能与激活阿片受体有关.

Abstract：

Objective To investigate the effect of sufentanil on anoxia/rexogenation (A/R)-induced injury to H9c2 cells incubated in high-glucose culture medium. Methods The H9c2 cells were cultured in low-glucose DMEM/F12 culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. The cells were seeded in 96-well or 6-well plates and randomly divided into 5 groups ( n = 12 wells each): normal glucose control group (group NC),high-glucose control group (group HC), high-glucose + A/R group (group HA/R), high-glucose + sufentanil +A/R group (group HSA/R), high glucose + naloxone + A/R group (group HNA/R). The cells were exposed to 95 % N2-5 % CO2 in an incubator at 37 ℃ for 3 h followed by 3 h reoxygenation. In group NC, the cells were incubated in low-glucose culture medium for 48 h. In group HC, the cells were incubated in high-glucose culture medium for 48 h. In group HA/R, the cells were incubated in high-glucose culture medium for 48 h before anoxia.In group HSA/R, after the cells were incubated in high-glucose culture medium for48 h, sufentanil was added to the culture medium with the final concentration of 10-9 mol/L at 15 min before anoxia. In group HNA/R, after the cells were incubated inhigh-glucose culture medium for 48 h, naloxone was added to the culture medium with the final concentration of 10-6 mol/L, 10 min later sufentanil was added with the final concentration of 10-9 mol/L at 15 min before anoxia. The cell viability was measured by MTT assay. The amount of lactic dehydrogenase (LDH) released in the supernatant and superoxide dismutase (SOD) activity were measured. Results The cell viability and SOD activity were significantly lower, while the amount of LDH released was significantly higher in the other groups than in group NC, in groups HA/R and HNA/R than in group HC, and in group HNA/R than in group HSA/R (P ＜ 0.01 ). The cell viability and SOD activity were significantly higher, while the amount of LDH released was significantly lower in group HSA/R than in group HA/R ( P ＜ 0.01 ). There was no significant difference in the parameters mentioned above between group HNA/R and group HA/R ( P ＞ 0.05). Conclusion Sufentanil can attenuate A/R-induced injury to H9c2 cells with high-glucose incubation, and the mechanism may be related to the activation of opioid receptors.