肺癌靶向血栓蛋白hu3D3V_H-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF,并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因,克隆至表达载体pET22 b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性,凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性,并能活化FⅩ、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,hu3D3VH/tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性,为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

肺癌靶向血栓蛋白hu3D3VH-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF，并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因，克隆至表达载体pET22b（＋），在E．coli B121（DE3）中表达，镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性，凝血实验和FX活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH／tTF／pET22b（＋）重组子，融合蛋白在E．coli B121（DE，）中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性，并能活化FX、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH／tTF／pET22b（＋）重组子，hu3D3VH／tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性，为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒UL12基因在大肠杆菌BL21和Rosetta菌中的差异表达

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a-UL12,比较重组表达质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性。方法使用PCR的方法扩增出HSV-1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a-UL12,分别转化E.coli BL21和E.coli Rosetta菌。经SDS-PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性。结果重组质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coliRosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高。结论成功构建了表达出了具有较高活性的HSV-1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV-1药物奠定了基础。     

The differential expression of HSV -1 UL12 gene in E.coil BL21 and E.coli Rosetta

目的 构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV -1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a - ULI2,比较重组表达质粒pET32a -UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性.方法 使用PCR的方法扩增出HSV -1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a - UL12,分别转化E.coli BL21和E coli Rosetta菌.经SDS - PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性.结果 重组质粒pET32a - UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高.结论 成功构建了表达出了具有较高活性的HSV -1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV -1药物奠定了基础.     

重组人白细胞介素-21的原核表达及其复性与纯化

目的构建工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21表达体系,表达并纯化出具有生物学活性的目的蛋白质。方法用基因工程方法构建表达质粒pET30a(+)-IL-21;在BL21大肠杆菌中诱导表达基因重组人白细胞介素-21(rhIL-21);提取包涵体并建立复性条件;用Ni-NTA凝胶纯化出rhIL-21;以NK92为效应细胞,观察rhIL-21对NK92的生物学作用,以此检测其活性。结果构建了重组质粒pET30a(+)-IL-21,工程菌BL21/pET30a(+)-IL-21能大量表达目的蛋白质;经复性和纯化得到具有生物学活性的rhIL-21。结论成功建立了人IL-21的原核表达体系,得到了有生物学活性的rhIL-21蛋白质。     

胞苷磷酸激酶基因的克隆与原核表达

目的:克隆胞苷磷酸激酶(CMPK)基因,构建携带CMPK基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组CMPK融合蛋白,获得转基因工程菌.方法:利用PCR法扩增大肠杆菌基因组DNA,纯化的PCR产物链接至pMD18-T载体上,得到重组质粒pMD18-T-CMPK,转化E-coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;分别用BamH I和XhoI限制性内切酶双酶切重组质粒pMD18-TCMPK和pET28a(+)表达载体.连接后,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定.用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导一定时间(3、6h)后,取E.coli上清液做电泳分析.结果:所获CMPK基因全长为786 bp,编码含有262个氨基酸的蛋白,当A值为0.6～0.8时重组质粒经IPTG诱导3h后,相对分子质量约30000处出现目的蛋白条带,随着时间的延长,蛋白表达量增加不明显.结论:成功地克隆CMPK基因,表达了大肠杆菌BL21(DE3)重组CMPK融合蛋白,为胞苷磷酸激酶进一步开发和应用奠定基础.     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

儿茶酚胺氧位甲基转移酶的克隆表达及纯化

目的将儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因(COMT)克隆到原核表达载体进行可溶性表达,制备纯化COMT蛋白,为深入研究COMT的功能提供材料。方法运用分子生物学方法构建融合表达质粒Pet22b+-COMT。将Pet22b+-COMT转入E.coli BL21(DE3)表达菌株,利用IPTG诱导表达,并用亲和色谱纯化COMT。结果经测序分析成功构建了融合表达质粒Pet22b+-COMT。COMT基因在E.coli BL21(DE3)中表达相对分子质量约为28000的蛋白质,纯化后,COMT蛋白的纯度大于90%。结论COMT基因在原核中得到良好的表达,得到了纯度较高的蛋白质,为酶学活性研究奠定了基础。     

AcAP5蛋白N端片段的表达、纯化与活性评价(英文)

犬钩虫抗凝肽5(Ancylostoma anticoagulant peptide 5,AcAP5)N端40个氨基酸片段(N40)含有与FXa结合的结构域。为研究N40的FXa抑制作用,我们克隆、表达和纯化了N40,并检测其生物活性。用PCR扩增N40基因;将PCR产物克隆至原核表达载体pET-30a中,构建质粒pET30a-N40;将其转化入大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定,经过镍柱亲和层析纯化,用BCA法进行蛋白定量,测定该蛋白抑制FXa的活性。限制性酶切鉴定和基因测序结果显示重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果显示目的蛋白在E.coli.BL21(DE3)中为可溶性表达,亲和层析纯化后获得了纯度约90%的蛋白,经活性鉴定该蛋白确有抑制FXa的活性。     

抗菌肽Cecropin B-肿瘤血管生长抑制因子 Kringle5融合蛋白表达载体的构建及其表达

通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(DE3)细胞后,提取质粒进行PCR鉴定和序列分析,证明重组质粒pET32a/CB-K5阅读框架和融合基因序列均与预期相符。实验结果显示,成功地构建了抗菌肽CecropinB(CB)和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)融合蛋白的表达载体pET32a/CB-K5。转化E.coliBL21(DE3),SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,融合蛋白以包涵体的形式在重组转化菌株中获得高效表达,表达量达到菌体总蛋白的50%。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

HPV6bL1-TpN15嵌合基因原核表达系统的构建

目的 分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和尖锐湿疣(cA)组织中扩增人乳头瘤病毒(HPV)6b型L1和TpN15基因,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因及其原核表达系统.方法 采用PCR分别从CA组织及Tp临床菌株中扩增HPV6b L1和TpN15基因片段,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)构建重组质粒pET32a(+)/HPV6b L1-TpN15,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21 (DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后表达的融合蛋白用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、蛋白质印迹法分析鉴定.结果 HPV6b L1-TpN15融合蛋白在原核表达系统中得到了较高表达.结论 原核表达的HPV6bL1-TpN15融合蛋白具较强的抗原性.     

重组人白细胞介素24蛋白对胰腺癌细胞生长的影响

目的构建人白细胞介素24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化后的IL-24融合蛋白导致人胰腺癌细胞(Panc-1)生长抑制的作用。方法用限制性内切酶从质粒pET30b-IL-24中酶切获取人IL-24cDNA片段。并将该片段与pET42a原核表达载体基因重组,在大肠杆菌中实现重组基因的表达,提取并纯化rhIL-24蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Westernblot对表达产物进行鉴定。以不同浓度的重组蛋白IL-24与胰腺癌细胞Panc-1、正常肝胚细胞CCC-HEL-1共培养48h,同时设立相应浓度梯度的HIS-GST融合蛋白组对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长抑制情况。结果酶切结果证实,成功构建了pET42a-IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达。rhIL-24蛋白以浓度依赖性的关系抑制Panc-1细胞的生长,抑制率明显高于HIS-GST蛋白。结论rhIL-24蛋白对胰腺癌细胞Panc-1生长有抑制作用。     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。     

pET15b-pep-1-p27mt的构建、表达及意义

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性的表达。PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。     

霍乱毒素B亚单位与p277融合基因在大肠杆菌中表达及免疫分析

为了增强多肽表位的免疫原性,构建了霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)和p277的融合基因CTB-p277,将该融合基因克隆到pET28a( )中,获得原核表达载体pET28a-CTB-p277;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经2%的乳糖诱导5 h后的表达产物用12%的SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,融合蛋白占全菌蛋白约40%,且主要以包含体的形式存在。包含体经洗涤、裂解,用DEAE纤维素离子交换纯化,可以获得99.1%的重组蛋白。重组蛋白的包含体经复性后,在体外可以自组装成五聚体。重组蛋白免疫KK-Ay小鼠后,ELISA的分析表明可以产生抗p277的抗体。血糖和体重的测定结果显示,给药组小鼠的血糖有明显的降低,体重也有相应的减轻。同时GM1-ELISA的检测表明,CTB-p277在体外可以和神经节苷脂GM1(Monosialoganglioside)特异结合,具有生物活性。     

Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a／DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5．0软件设计Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特异性引物,引入BamHl和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T／DM626-740;然后,将BamHI和Sail酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a／DM626-740。将其转化E．coliBL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a／DM626-740,该质粒在E．coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a／DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。