幽门螺杆菌外膜36kDa蛋白重组表纯化及初步鉴定

[目的]构建幽门螺杆菌(H. pylori) NCTC11637菌株36kDa (OMP36)外膜蛋白基因原核表达系统,探索研制H. pylori疫苗的新途径.[方法]培养和收集H. pylori NCTC11637菌株,提取基因组DNA, PCR扩增目的基因片断.将其克隆到T载体并测序,再将目的基因克隆入PET32a( ),构建重组表达载体PET32a-OMP36.转化E.coliBL21后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定、镍亲和层析纯化、Western blot检测表达蛋白.(结果)测序分析表明,插入的基因片断为987bp,表达的蛋白的相对分子质量(Mr)约为36kDa,并显示具有良好的抗原性.SDS-PAGE检测表明,表达量占细菌总蛋白的37%,镍亲和层析纯化率约92%.Western blot检测表达蛋白具有良好的抗原活性.[结论]成功克隆了外膜蛋白OMP 36kDa的编码基因,其表达产物OMP 36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H. pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础.     

布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定

[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序，并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序，目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接。构建重组质粒PGEX-4T-1／bp26，在大肠杆菌中表达该蛋白。用western—blot鉴定重组表达的GST—bp26蛋白。[结果]成功构建了PGEX-4T-1／bp26原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因，布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达，它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。     

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据GiUiam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物。用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1320bp的DNA，克隆至原核载体PET28a，构建了表达载体PET-OTG，并获表达。表达产物经镍(Ni2 )柱亲和层析纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western—blot)分析鉴定。并用间接ELISA进行抗原性分析。结果SDS—PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达，在相对分子质量约52kDa处有表达目的条带。经 Ni^2 层析柱纯化得到目的蛋白，包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白，达电泳纯。Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别，用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性，能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性。有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。     

幽门螺杆菌napA基因的克隆及生物信息学分析

[目的]获取幽门螺杆菌NCTC11639中性粒细胞激活蛋白基因（napA），预测其编码蛋白作为幽门螺杆菌疫苗候选抗原的可行性，为耶疫苗研制奠定基础。[方法]提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA，参照GeneBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR扩增napA基因，克隆入pMD18-T载体中，对重组质粒测序后进行生物信息学分析。[结果]克隆的napA基因全长为435bp，在GenBank上登录（No．DQ341279），与Gen-Bank公布的其它Hp菌株的核酸同源性为94％～98％，与国际测序模式株Hp26695、HpJ99同源性达97％。[结论]成功扩增Hp标准株NCTC 11639 napA基因，通过同源性检索分析表明Hp与人及其它哺乳动物的基因组DNA同源序列低，在不同耶菌株中高度保守，符合疫苗候选抗原的基本特征；抗原表位预测显示有4条高抗原性肽段，其中118-140肽段抗原指数最强，可能存在良好的抗原表位，结合Hp-NAP二级结构、亲水性分析认为Hp—NAP是很有前景的幽门螺杆菌疫苗候选抗原。     

幽门螺杆菌ureI和lpp20乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定

目的 以幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI和外膜脂蛋白lpp20为目的 基因.分别构建乳酸乳球菌表达重组载体pNZS112/ureI和pNZ8112/lpp20,为H.pylori乳酸乳球菌活菌口服疫苗的研制奠定实验基础. 方法 根据幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI和脂蛋白Lpp20的全基因序列,利用PRIMER5.0各设计一对引物,进行PCR扩增,获得ureI和lpp20目的 基因片段,将其与分泌表达载体pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体,并进行重组疫苗菌稳定性检测. 结果以H.pylori标准株基因组DNA为模板分别扩增出特异的ureI和lpp20基因片段,大小分别为588 bp和528 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20. 结论 PCR扩增得到了大小约为588 bp和528 bp的H.pylori ureI和lpp20目的 基因片段;并成功构建了幽门螺杆菌ureI及lpp20基因乳酸乳球菌表达重组载体.     

幽门螺杆菌塑性区hp4565基因的克隆表达 及其功能初探

摘要:目的　为克隆表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）临床株的塑性区hp4565基因,并制备抗体,以探讨其生物学功能。方法　以标准株NCTC shfi470的hp4565基因组全长设计引物,以H.pylori临床株为模板,PCR扩增临床株中hp4565基因,经原核表达后,选定最适条件大量诱导表达并经Ni2+-NTA柱纯化的目的蛋白。用MTT法检测重组蛋白对胃上皮细胞GES-1增殖影响,定磷法检测重组蛋白ATP酶活力。用纯化蛋白为抗原免疫家兔后制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果　成功克隆表达了hp4565基因,全长942 bp,编码313个氨基酸,原核表达后SDS-PAGE电泳显示有41 kDa的融合蛋白,Western blot鉴定是预期HP4565蛋白。纯化后获得较高纯度的重组蛋白,MTT法结果显示HP4565蛋白在低浓度（≤40 mg/L）时对细胞增殖无明显影响;蛋白浓度在60 mg/L以上时,细胞增殖随着培养时间的延长和浓度的增加呈现逐渐降低的趋势;重组蛋白具有一定的ATP酶活力,免疫家兔制备的多克隆抗体效价为1∶1.6×105。结论　成功克隆表达了H.pylori临床株塑性区hp4565基因,得到纯度较高的蛋白和滴度较高的抗体,重组蛋白对胃上皮细胞增殖有一定影响,并具有一定的ATP酶活力。     

E9基因的克隆及蛋白的原核表达和纯化

目的通过分子生物学的手段从库蚊幼虫中获得E9酯酶基因，构建表达载体PET-32aE9，实现在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白并将其纯化。方法通过RT—PCR技术从库蚊幼虫中特异性扩增E9酯酶基因，将目的基因通过基因连接反应与PET-32a载体连接，重组质粒进行基因序列测序，构建PET～32a和目的基因的高表达质粒，异丙基-B—D-硫代半乳糖（isopropylthiogalactoside，IPTG）诱导表达，NP柱纯化，Western．blot法检测纯化的目的蛋白。结果成功获得库蚊幼虫E9酯酶基因，基因测序显示基因突变率为0，表达质粒构建双酶切（BamHI和NcoI）可见目的基因的条带，经IPTG诱导表达，获得带HIS标签的融合蛋白E9，相对分子质量为80．6×10^3，经Western—blot分析证实抗原性正确。结论E9酯酶基因可以通过基因工程手段获得体外高效表达，为其功能的研究、抑制剂的筛选以及农药污染的环境治理提供基础。     

羊布鲁菌OMP31蛋白基因表达及抗原性分析

目的 构建布鲁菌OMP31蛋白原核表达载体,获得OMP31蛋白.方法 PCR扩增OMP31基因,连接入pET-30a(+)表达载体中,构建pET-30a(+)/OMP31质粒,双酶切鉴定、测序正确后,转化人大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,以不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并通过二十烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析；蛋白质免疫印迹(western blot)初步分析其免疫原性.结果 成功构建pET-30a(+)/OMP31表达载体,并表达出OMP31蛋白,分子量约为31 kDa,主要以包涵体形式存在；通过复性获得＞95％的高纯度可溶性蛋白；以布鲁菌虎红平板阳性血清检测,显示复性后蛋白具有良好的免疫反应性.结论 成功表达出带组氨酸(HIS)标签的OMP31融合蛋白,且具有较好的蛋白抗原性.     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

雌鼠围产期染铅对仔鼠脑组织Brn-3a基因转录及蛋白表达的影响

[目的]探讨雌鼠围产期染铅对仔鼠中枢神经系统神经细胞内Brn-3a基因转录及蛋白的影响。[方法]雌性大鼠在围产期经饮水染铅，分为低（0．5g/L）、中（1．0g/L）、高（2．0g/L）3个染铅组，对照组饮用蒸馏水。取21日龄仔鼠脑组织进行观察，采用组织原位杂交半定量方法检测Brn-3a基因mRNA转录水平，采用免疫组织化学方法检测Brn-3a蛋白表达水平。[结果]原位杂交检测Brn-3a基因mRNA图像分析结果表明，高铅组与对照组相比，大脑皮质和海马部位平均灰度值升高（P〈0．05），表明mRNA的表达量减弱，海马部位阳性面积比明显下降（P〈0．01）。免疫组织化学图像分析表明，与对照组相比，各染铅组大脑皮质、海马及小脑的Brn-3a蛋白表达的阳性面积比[Aa（％）]、平均灰度的差异均有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01），并呈剂量依赖性关系。染铅组Brn-3a蛋白表达低于对照组。[结论]大鼠脑组织基因转录水平和蛋白表达水平有所下降，提示在本实验染毒剂量下，铅干扰了Brn-3a蛋白的正常表达模式。     

梅毒密螺旋体Tp47重组蛋白的表达及其应用

目的：在大肠埃希菌中表达梅毒密螺旋体（treponema pallidum,Tp）Tp47重组蛋白，用其建立诊断梅毒的酶联免疫法（enzyme immunoassay,EIA）。方法：应用聚合酶链反应法（PCR）从Tp全基因组中扩增目的片段Tp47，并将其克隆到表达载体pET-30a中，构建重组质粒pET-30a-Tp47。在大肠埃希菌中表达重组蛋白Tp47，亲和层析柱纯化，建立EIA法，检测血清中抗－Tp抗体。结果：获得了Tp47基因重组蛋白的高效表达，该重组蛋白存在于细菌上清中，占全菌体蛋白12％左右，分子量约39kDa。蛋白印迹法（western blot,WB）显示，Tp47重组蛋白具有良好的抗原性。用Tp47重组蛋白建立EIA法，检测11份梅毒血凝试验阳性和28份阴性血清，灵敏度为100％（11／11），特异性为96．4％（27／28）。结论：Tp47重组蛋白EIA可用于梅毒的诊断。     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

淋病奈瑟菌标准株外膜蛋白NspA基因重组质粒构建和生物信息分析

[目的]研究淋病奈瑟菌标准株(NG 29403和NG 29400)外膜蛋白NspA基因和NspA融合蛋白结构特点,为淋病奈瑟菌疫苗靶蛋白的选择提供依据。[方法]PCR扩增淋病奈瑟菌标准株NG 29400和NG 29403 NspA基因,与表达质粒pET-30c(g )构建重组子NspA-pET-30c( ),阳性克隆子经双酶切鉴定后进行基因测序。以生物软件对NspA基因进行生物信息分析,并在线预测其蛋白质结构。[结果]成功构建NspA-pET-30c( )重组质粒,双酶切获得0.5kb和5.4kb预期产物。基因序列分析表明淋病奈瑟菌NspA基因有较高同源性,两标准株与GenBank已有序列均有98%同源性,且与脑膜炎奈瑟菌NspA基因高度近似。蛋白预测显示NspA融合蛋白有40%以上为环状结构,可能为主要功能区。三级结构与脑膜炎奈瑟菌NspA相似。[结论]淋病奈瑟菌NspA基因具有高度保守性,与脑膜炎奈瑟菌NspA基因同源性高,蛋白结构相似,有望成为淋病奈瑟菌疫苗的候选抗原。     

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因的克隆及序列分析

目的 获取淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因(porB)并构建其重组表达质粒。方法 根据porB已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出porB基因片段，克隆到原核表达质粒pQE30中，转化大肠埃希菌M15感受态细胞，经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果 porB基因体外扩增产物大小约为911bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论 成功克隆了淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因，为下一步PorB蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌蛋白质疫苗的研制提供了基本的物质基础：     

Env/IFNα-2b融合基因在痘苗病毒中共表达研究

目的：本实验选择的真核表达载体pJ16，是以痘苗病毒复制非必需区血凝素（HA）基因为侧翼，以牛痘病毒包涵体（ATI）启动子和串联的p7.5突变型早期启动子为基本构件的痘苗病毒表达载体。插入编码AIDS病毒（HIV－1）外膜蛋白env与编码干扰素IFNα-2b基因。方法：经与野生型痘苗病毒在细胞内同源重组，排选HA^-斑。获得重组痘苗病毒vJ16env/IFNα-2b。经免疫荧光、Dot blot、SDS-PAGE、Western blot和免疫小鼠后血清抗体IgG OD值检测。结果：vJ16en/IFNα-2b能表达Env-IFNα-2b融合蛋白，分子量约100kDa。免疫小鼠实验，血清抗体IgG OD值组间均数比较（P＜0．001），含IFNα－2b与vJ6env组比较（P＞0．05），但有增高趋势。结论：重组病毒表达的Env-IFN融合蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。     

GFP-MOMP融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的 构建GFP-MOMP融合蛋白真核表达重组质粒pEGFP／MOMP，利用脂质体体外转染Heb细胞，观察MOIMP在真核细胞中的表达。方法 PCR法从D型Ct基因组中扩增MOMP全长基因，克隆至pEGFP真核表达载体的相应位点，进行序列分析和酶切鉴定后，脂质体介导重组体pEGFP／MOMP转染Heb细胞，荧光显微镜、Western blot鉴定MOMP基因的表达。结果 PCR扩增得到约1．2kb的特异性MOMID基因片段；成功的构建真核表达重组体pEGFP／MOMP；重组质粒pEGFP／MOMP在HeLa表达出约71kDa大小的融合蛋白。结论 GFP-MOMP能够在体外真核细胞中表达，为进一步研究该蛋白的生物学功能及核酸疫苗的制备提供实验依据。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因原核表达系统的构建及序列分析

目的：分析比较5株临床分离的淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因核苷酸及氨基酸序列，构建PIA基因的原核表达系统。方法：采用高保真PCR扩增5株淋病奈瑟菌全长PIA基因序列，T—A克隆后测序并与已发表的序列进行比较，用Wonderful分子生物学软件分析基因和蛋白质序列的相似性。再构建PIA原核表达系统，不同浓度IPTG诱导后，10％SDS—PAGE检测蛋白表达情况。结果：5株PIA淋病奈瑟菌均为IA6血清型。与报道的PIA基因序列（No：L19962）比较，核苷酸和氨基酸序列相似性均分别高达99．47％-100％和99．04％-100％。构建的原核表达系统pET42-PIA—Ecoli BL21DE3表达的重组蛋白PIA量占细菌总蛋白量的49．6％。结论：IA6为PIA菌株优势血清型，核苷酸和氨基酸序列相似性高，已成功构建淋病奈瑟菌PIA基因高效原核表达系统，为淋病奈瑟菌基因疫苗和临床检测试剂盒的研制打下基础。