腺病毒介导的HBsAg基因修饰树突状细胞瘤苗的制备

目的:构建含人HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法:将HBsAg基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-S。用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成pAdeno-S重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno-S体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后Westernblot法检测其表达,流式细胞仪检测其能否诱导树突状细胞凋亡。结果:酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HBsAg基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HBsAg基因感染树突状细胞,经Westernblot法鉴定证实能够表达转染基因,并且不会诱导树突状细胞凋亡。结论:构建成功的含HBsAg腺病毒载体可以在树突状细胞中表达HBsAg,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。     

CX43腺病毒表达载体的构建及其在人胃癌BGC-823细胞系的表达

目的:构建并鉴定CX43-IRES2-EGFP的重组腺病毒小质粒表达载体,观察其在人胃癌BGC-823细胞系中的表达。方法:将目的基因CX43片段与IRES2-EGFP进行PCR拼接,重组到腺病毒穿梭载体pAd/CMV/V5-DEST上,构建成腺病毒表达载体pAd-CX43-IRES2-EGFP;经酶切后转染293A细胞进行包装,测定滴度;重组病毒转染人胃癌BGC-823细胞后,通过RT-PCR检测耐药基因MDR的变化,Westernblot检测CX43超表达。结果:经测序验证,腺病毒载体pAd-CX43-IRES2-EGFP构建成功。pAd-CX43-IRES2-EGFP病毒的滴度为:2.8×106ifu/ml。转染人胃癌BGC-823细胞后经Western blot检测到CX43蛋白超表达,耐药基因MDR受到抑制。结论:成功构建腺病毒载体pAd-CX43-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系,检测其对人胃癌BGC-823细胞系具有超表达CX43和抑制耐药基因MDR的作用,为CX43基因转染的研究及基于CX43为靶标的基因药物筛选平台的奠定了基础。     

一种新的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP的构建

 目的 构建表达小鼠甲胎蛋白（murine alpha fetoprotein，mAFP）基因的重组腺病毒载体pAd—BM5-GFP-mAFP，并测定其滴度。方法 从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增mAFP基因，测序确认后，插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，双酶切鉴定重组腺病毒载体。线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞，通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因，并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒，用TCBn法测定重组腺病毒滴度。结果 成功克隆了小鼠mAFP基因，构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP，获得了表达mAFP基因的重组腺病毒，病毒滴度达3．2×10^8PFU／ml。结论 本研究成功构建了pAdBM5-GFP-mAFP载体，获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒，为进一步开展肝癌的免疫基因治疗奠定了基础。     

沉默结缔组织生长因子基因重组腺病毒的构建及功能验证

目的:构建沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-siCTGF,并进行功能验证.方法:选取已验证的能高效沉默CTGF基因的靶序列,克隆入载体pSES-HUS中;将质粒线性化处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠埃希菌BJ5183,构建重组腺病毒载体Ad-siCTGF;腺病毒载体用Pac I酶切线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒;采用"乒乓交互感染法"提高病毒滴度.用此病毒感染4T1细胞,行实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative -PCR, RFQ-PCR)及Western 印迹法验证其沉默效果.结果:Pac I酶切电泳证实重组腺病毒载体Ad-siCTGF构建成功,扩增纯化后测定重组病毒Ad-siCTGF的滴度为2.6×10~(10) pfu/mL.感染此病毒后,4T1细胞中CTGF mRNA表达水平下调至36.27%,蛋白表达水平下调至31.56%.结论:成功构建能沉默CTGF基因的重组腺病毒,为进一步研究CTGF在肿瘤中的作用机制奠定了基础.     

含人AFP基因重组腺病毒载体的构建及其转染树突状细胞瘤苗的制备

目的:构建含人AFP基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗.方法: 将AFP基因亚克隆到pIND 载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-AFP.用PI-Sce Ⅰ和I-CeuⅠ双酶切后将所获AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成pAdeno-AFP重组腺病毒载体.其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体.通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定.包装好的重组病毒载体pAdeno-AFP体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后,FACS分析pAdeno-AFP/DC表面分子的表达,酶联免疫吸附试验法( ELISA) 检测AFP水平.结果: 酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为AFP基因.包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带AFP基因感染树突状细胞,pAdeno-AFP/DC能高水平的表达CD1a,CD11c,CD80,CD86以及HLA-DR,并分泌较高水平的AFP.结论: 构建成功的含AFP腺病毒载体可以在树突状细胞中表达AFP,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础.     

HBx基因重组腺病毒载体构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:利用pAdEasy1腺病毒载体系统构建人HBx基因重组腺病毒,感染肝癌细胞株SMMC7721使HBx基因有效表达。方法:自真核表达载体pcDNA3.1(-)HBx中获得HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中构建pAdTrackCMVHBx,然后经PmeⅠ酶切线性化,电转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感受态细菌中。挑选和鉴定正确的同源重组质粒,然后将线性化的重组质粒转染293N细胞,产生重组病毒颗粒,并进一步感染SMMC7721细胞株。结果:经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定,证实pAdTrackCMVpAdEasy1HBx重组成功,借助荧光显微镜可以观察到绿色荧光蛋白GFP在293N和SMMC7721细胞株中表达。结论:成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,并在SMMC7721细胞中使HBx基因有效表达,为后续研究奠定了基础。     

含人AFP基因重组腺病毒载体的构建及其转染树突状细胞瘤苗的制备

目的：构建含人AFP基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法：将AFP基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-AFP。用PI—SceⅠ和I—Ceu Ⅰ双酶切后将所获AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno—X连接,构成pAdeno—AFP重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno—AFP体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后,FACS分析pAd-eno—AFP／DC表面分子的表达,酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测AFP水平。结果：酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带AFP基因感染树突状细胞,pAdeno—AFP／DC能高水平的表达CD1a,CD11c,CD80,CD86以及HIA—DR,并分泌较高水平的AFP。结论：构建成功的含AFP腺病毒载体可以在树突状细胞中表达AFP,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。     

SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体的构建及检测

目的构建携带融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc(SLC-HP-Fc)的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc表达载体。方法提取SLC-HP基因及含Fc段基因的质粒构建携带目的基因的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMVSLC-HP-Fc,经酶切线性化后转入含有pAdEasy-1质粒的E.coli BJ5183中进行同源重组,得到重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc。线性化后的病毒表达载体通过脂质体Lipofectamine 2000转染293细胞,通过包装扩增并经PCR鉴定后得到大量复制病毒并纯化保存。结果得到重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc,成功转染293细胞出现细胞病变反应,经酶切及PCR法确定目的基因的表达。结论成功构建了SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体,并建立了重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc种子病毒库和工作病毒库,为进一步研究该融合基因与肿瘤相关作用奠定了实验基础。     

CRT180基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗奠定实验基础。方法采用腺病毒表达系统（Vira Power^TM Adenoviral Expression System）构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因,以连接、转化等方法克隆入载体pENTR／D—TOPO以获得重组的入门克隆,经测序及PCR鉴定正确后,用重组酶（LRClonase^TMⅡ Enzyme Mix）进行入门克隆与腺病毒表达载体（pAd—CMV／V5-DEST）间的重组反应,以获得表达克隆（rAd．CRT180）质粒。重组表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。用极限稀释法检测病毒滴度用Western Blot法检测rAd．CRT180载体是否能正确表达CRT180蛋白。结果用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因;重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1．8×10^11pfu／mL,且这个病毒能正确表达CRT180蛋白。结论成功构建了CRT180基因的重组腺病毒载体,可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据。     

IL-3基因修饰的骨髓基质细胞辅助大剂量化疗后造血功能恢复

为研究基因治疗在造血功能损伤后恢复中的应用,本课题以携带小鼠IL-3基因的复制缺陷型重组腺病毒载体转染骨髓基质细胞,对大剂量化疗后的小鼠进行脾内移植观察造血功能的恢复情况.结果表明,缺陷型腺病毒载体能有效地转染小鼠原代骨髓基质细胞,转染效率在80%以上(MOI=10);基因修饰的骨髓基质细胞体外分泌IL-3的水平可达110U/ml/10~6细胞/24小时;在大剂量环磷酰胺治疗后脾内移植IL-3基因修饰的基质细胞能有效地升高实验小鼠外周血白细胞总数;病理检测发现IL-3基因修饰的基质细胞治疗组小鼠脾脏和骨髓中细胞增生较其它组明显活跃;经IL-3基因修饰的基质细胞治疗组小鼠脾淋巴细胞对ConA反应明显增强.结果提示IL-3基因修饰的骨髓基质细胞体内移植对大剂量化疗后机体造血与免疫功能的恢复都有较好的促进作用.     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

Clinico-Pathological Study of 50 Cases of Tumours of Larynx

Otoacoustic emissions have been advocated in the management of otitis media with effusion. However, otoacoustic emissions cannot differentiate different types of hearing loss. This study was conducted to find factor that can differentiate otitis media with effusion from other common causes of hearing loss in children. Children were enrolled in the study and divided in four groups consisting of 25 ears each after pure tone and impedance audiometry: (1) Otitis media with effusion group, (2) Normal ear group, (3) Sensory-neural hearing loss group, (4) Chronic suppurative otitis media group. Otoacoustic emissions were recorded and results were analyzed statistically. The normal hearing group had significant difference from other groups but total band reproducibility of transient evoked otoacoustic emissions did not show any statistical difference in the cases groups. In distortion product otoacoustic emissions, group 1 showed significant difference from group 3 and group 1 had significant difference from all other groups at 4 kHz. The study did not find any factor that differentiates otitis media with effusion from other diseases. Although, distortion product otoacoustic emissions can indicate otitis media with effusion but impedance audiometry should be the main tool in the management of otitis media with effusion.     

Management of intracranial metastases of differentiated carcinoma of thyroid

Summary Brain metastases in differentiated carinoma of the thyroid is a rare occurrence. We treated five documented cases of carcinoma of thyroid with brain metastases out of 400 cases of thyroid cancer treated between 1972 to 1993. 4 were females out of which one was pregnant during the appearance of brain metastases. All cases were treated with thyroidectomy, and radioiodine as primary therapy. Brain metastases developed 6 months to 11 years following treatment of the primary and were treated with radiotherapy and suppressive levothyroxine. We observed the beneficial effect of suppressive thyroxine and the poor prognosis associated with pregnancy and withdrawl of thyroid replacement therapy. 3 of the 5 patients are alive 12–23 months after treatment for brain metastases, while 2 patients died at 4 months and 7 years post brain metastases due to pulmonary and hepatic failure, respectively.     

胰腺实性假乳头状瘤7例临床病理特征并文献复习

目的探讨胰腺实性假乳头状瘤（SPTP）的临床病理特征以及免疫组化特点。方法对7例SPTP进行临床、组织病理、免疫表型的观察并复习相关文献。结果 7例SPTP,男女之比为2∶5,平均年龄34岁,仅3例有临床症状。6例发生于胰腺,有1例发生在胰腺外。肿瘤均呈囊实性;组织学上肿瘤细胞形态较一致,呈巢状排列,并形成假乳头状结构,部分瘤细胞呈透明细胞样细胞改变;间质黏液样变性、异物巨细胞反应及胆固醇样结晶。免疫组化结果显示：瘤细胞Vimentin、AAT呈强阳性,EMA均呈阴性;部分病例NSE、Syn、CgA、CD56、CD10、、AE1/AE3、PR局部阳性。4例术后随访30～114个月,患者均未发现复发及转移。结论 SPTP少见,多见于年轻女性,以实性、假乳头结构为主要组织学特征,并伴有其它多种组织学结构及多向分化的免疫组化表型。免疫组织化学检测结果对SPTP诊断具有重要价值,AAT、Vimentin阳性是诊断SPTP的可靠依据。     

胆囊腺瘤癌变的相关因素分析

目的:探讨胆囊腺瘤癌变与临床因素的相关性。方法:应用ROC曲线,计算胆囊腺瘤癌变的肿瘤大小临界值。应用χ2独立性检验,计算胆囊腺瘤癌变与临床因素的相关性、临床表现与肿瘤位置的相关性。结果:肿瘤良恶性临界值为2.27 cm。胆囊腺瘤癌变与患者的性别、年龄、是否合并结石无明显相关性（P＞0.05）,而与肿瘤大小、肿瘤数目、形态、超声下是否有血流(P＜0.05)等临床病理特征有明显相关性。临床症状与肿瘤是否位于胆囊颈部有明显相关性(P＜0.05)。结论:胆囊腺瘤在超声扫描下表现为单发、无蒂、有血流、直径大于2.27 cm,应高度怀疑已有恶变。肿瘤位于胆囊颈部可引起右上腹胀痛、疼痛向右背部放射、恶心呕吐等临床表现。