罗格列酮调控PPARγ/HO-1的表达抑制肝星状细胞增殖

目的探讨罗格列酮(RGZ)对肝星状细胞(HSCs)中过氧化酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)及血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响。方法以体外活化的肝星状细胞(HSC-T6)为研究对象,分为:空白对照组、RGZ干预组、RGZ与锌原卟啉-Ⅸ(ZnPP-Ⅸ)共同干预组。采用四甲基偶氮唑盐法检测HSC-T6的增殖情况,酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中透明质酸(HA)及Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)含量,实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法及免疫细胞化学技术检测PPARγ、HO-1的mRNA及蛋白相对表达水平。多组间样本均数的比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验。结果RGZ干预组HSC-T6增殖活性及HA、PⅢP表达较空白对照组显著下降(P值均<0.01),但PPARγ、HO-1的mRNA及蛋白相对表达量均较空白对照组显著增加(PPARγ:2.97±0.22对比1.07±0.05,0.96±0.08对比0.31±0.03;HO-1:4.28±0.73对比1.80±0.36,1.83±0.26对比0.61±0.09),P值均<0.01,差异有统计学意义。RGZ与ZnPP-Ⅸ共同干预组同RGZ干预组比较,HSC-T6增殖活性及HA、PⅢP表达有所升高(P值均<0.05);HO-1的的mRNA相对表达量(3.16±0.38对比4.28±0.73)和蛋白相对表达水平(1.31±0.17对比1.83±0.26)降低,P值均<0.05,差异有统计学意义;PPARγ的mRNA及蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P值均>0.05),但呈下降趋势。RGZ与ZnPP-Ⅸ共同干预组与空白对照组HO-1的mRNA相对表达量(1.80±0.36)及蛋白相对表达量(0.61±0.09)比较,明显增高,P值均<0.05。免疫细胞化学染色同上述结果一致。结论罗格列酮诱导PPARγ表达增加进而抑制HSC增殖活化及胶原产生的作用可能是通过调控其下游HO-1的表达而实现的。     

积雪草酸对HSC-T6细胞Smad7和PPARγ的mRNA表达的影响

目的检测积雪草酸对HSC-T6细胞Smad-7和PPARγ的mRNA表达的影响,探讨积雪草酸抗肝纤维化的分子生物学机制。方法用MTT实验检测积雪草酸对HSC-T6细胞的增殖抑制作用,计算抑制率,确定积雪草酸作用浓度;设置空白对照组与积雪草酸干预组,用半定量RT-RCR检测两组HSC-T6细胞Smad7和PPARγ的mRNA表达差异。结果积雪草酸抑制HSC-T6细胞的增殖,药物浓度为10、20、30、40、50、70、90μmol/L时,抑制率分别为7.47%、12.42%、13.97%、21.32%、47.31%、51.18%、60.36%。空白对照组和积雪草酸干预组的半定量RT-PCR的结果分别为：Smad7/GAPDH mRNA空白对照组为0.267±0.037,积雪草酸干预组为0.358±0.035;PPARγ/GAPDH mRNA空白对照组为0.157±0.054,积雪草酸干预组为0.570±0.066。两组结果间比较差异具有统计学意义,P〈0.05。结论积雪草酸可以上调HSC-T6细胞Smad7和PPARγ的mRNA的表达,从而抑制HSC-T6细胞合成和分泌胶原,改善肝纤维化的病理表现。     

还原型谷胱甘肽对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖及核转录因子NF-E2相关因子2/血红素加氧酶-1信号通路的影响

目的 探讨还原型谷胱甘肽(GSH)对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖及核转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)信号通路的影响.方法 分别用浓度为0、1、2、5、10 mmol/L的GSH作用于经0.1 μg/ml脂多糖活化的大鼠HSC-T6细胞24h后,四甲基偶氮唑盐比色法检测HSC-T6增殖情况,放射免疫法检测细胞上清液中透明质酸(HA)及Ⅳ型胶原的含量,实时荧光定量PCR检测Nrf2和HO-1的mRNA表达水平,免疫细胞化学染色法检测HSC-T6中Nrf2和HO-1的蛋白质表达情况,分光光度计检测HO-1的活性变化.两两比较采用t检验,两变量间的关系采用曲线拟合方法. 结果 GSH能抑制HSC-T6增殖,1、2、5、10 mmol/L组的吸光度值分别为0.79±0.02、0.74±0.03、0.70±0.02、0.62±0.01,均低于0mmol/L组的0.88±0.03(t值分别为3.16、6.09、7.17、11.94,P值均＜0.05).GSH 1、2、5、10mmol/L组的HA表达量分别为(372.98±11.01)μg/L、(320.76±16.37) μg/L、(284.46±13.17)μg/L、(239.08±16.95)μg/L,明显低于0 mmol/L组的(415.74±14.52)μg/L(t值分别为4.07、7.52、11.59、13.71,P值均＜0.05);Ⅳ型胶原表达量分别为(191.27±17.49)μg/L、(163.85±16.26) μg/L、(133.03±13.14)μg/L、(103.31±12.52) μg/L,也低于0mmol/L组的(251.47±14.06) μg/L(t值分别为4.65、7.58、10.66、13.63,P值均＜0.05).0 mmol/L组HSC-T6中Nrf2 mRNA相对表达量(1.21±0.11)低于1、2、5、10 mmol/L组(分别为1.51±0.06、1.92±0.08、2.69±0.07、3.43±0.07),Nrf2蛋白表达的累积吸光度值(17.84±0.61)也低于1、2、5、10 mmol/L组(分别为23.85±0.20、27.90±0.32、33.69±0.75、38.64±0.38); HO-1 mRNA相对表达量(1.25±0.09)低于1、2、5、10 mmol/L组(分别为1.43±0.08、1.73±0.07、2.10±0.08、2.64±0.07),HO-1蛋白表达的累积吸光度值(16.77±0.31)也低于1、2、5、10 mmol/L组(20.75±0.30、24.84±0.24、28.89±0.19、33.88±0.19),差异均有统计学意义(P值均＜0.05).HO-1的活性也随GSH浓度增加而上升.结论 GSH可抑制HSC-T6增殖,减少其细胞外基质HA及Ⅳ型胶原分泌,其机制可能与GSH对HSC-T6的Nrf2/HO-1信号通路调控有关.     

死亡受体通路在曲霉菌素诱导肝星状细胞凋亡中的作用

目的 验证曲霉菌素诱导肝星状细胞HSC-T6凋亡的作用,探讨死亡受体通路在该过程中的意义.方法 将HSC-T6细胞分为曲霉菌素干预组和空白对照组,用流式细胞术检测HSC-T6的凋亡,免疫组化SABC法检测Fas蛋白的表达,分光光度法检测caspase-8的活性.结果 流式细胞术显示,曲霉菌素浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L,作用于干预组HSC-T6细胞1 h后,HSC凋亡指数与对照组相比显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05),且随着曲霉菌素浓度增加,凋亡率也相应增高;曲霉菌素以最低有效浓度0.4 mmol/L干预,Fas的表达及caspase-8活性与空白对照组比较均显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 曲霉菌素诱导HSC-T6细胞凋亡具有剂量依赖性,死亡受体通路在该过程中有重要意义.     

罗格列酮对内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1和血管细胞黏附分子-1表达的影响

目的观察罗格列酮(RGZ)对高糖及C反应蛋白(CRP)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)mRNA和蛋白表达的影响。方法体外培养HUVECs,细胞传至5代,随机分为7组,正常对照组(C组),高糖组(HG组),高糖+CRP组(HGC组),CRP组,高糖+RGZ组(HGR组),高糖+CRP+RGZ组(HGCR组),CRP+RGZ组(CRPR组)。采用RGZ 5.0μmol/L干预HUVECs24 h,RT-PCR、Western blot法分别检测干预前后MCP-1、VCAM-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果HG组、HGC组、CRP组HUVECs中MCP-1、VCAM-1的mRNA和蛋白水平较C组显著升高(P<0.01);RGZ干预后,HGR组、HGCR组、CRPR组分别较HG组、HGC组、CRP组MCP-1、VCAM-1的mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.01)。结论RGZ通过降低HUVECs中MCP-1、VCAM-1的表达,延缓糖尿病动脉粥样硬化的进程。     

转化生长因子-β1促进miR-181a表达诱导肝星状细胞-T6细胞活化

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对miR-181a表达的影响,以及miR-181a对体外培养的肝星状细胞(HSC)-T6细胞的作用。方法 TGF-β1处理HSC-T6细胞后,检测miR-181a和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。miR-181amimics转染HSC-T6细胞后,Western印迹检测α-SMA和Ⅰ型胶原a2链(collagenⅠa2,ColⅠA2)蛋白表达,CCK-8计数法检测细胞增殖。结果 TGF-β1处理组细胞中miR-181a和miR-181b表达量较对照组细胞明显升高,miR-181a转染组细胞中α-SMA和ColIA2表达量明显高于对照组细胞,miR-181a对HSC-T6增殖无明显影响。结论在HSC-T6中,TGF-β1促进miR-181a表达,miR-181a可促进HSC-T6细胞活化和分泌胶原,进一步明确了TGF-β1促进HSC-T6活化的机制。     

PPARγ表达上调体外抑制肝星状细胞的增殖

目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达上调对肝星状细胞增殖及凋亡的影响.方法:体外培养HSC-T6细胞,取对数生长期的细胞,应用1,2,3μmo/L不同浓度的PPARγ激动剂15d-PGJ2作用24 h.同时以不加药物只加无血清培养基作为对照组,24 h后应用RT-PCR的方法观察分析各组间肝星状细胞PPARγmRNA表达的变化,MTT检测HSC增殖.流式细胞仪分析HSC-T6细胞凋亡.结果:经1,2,3μmo/L 15d-PGJ2处理的HSC-6细胞中PPARγmRNA表达比例上调(0.513±0.031,0.697±0.018,0.674±0.03 2 vs 0.198±0.021).MTT结果显示不同浓度的15d-PGJ2对HSC-T6细胞的增殖均有抑制作用,以2μmol/L组最为显著(54.6%±11.1%).流式细胞仪结果显示15d-PGJ2处理组凋亡细胞数明显增多.结论:PPARγ表达上调能够抑制HSC-T6增殖并诱导其凋亡.     

干扰素γ对肝星状细胞-T6细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原等基因表达的影响

目的观察干扰素γ(IFN γ)对肝星状细胞(HSC)-T6细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(colⅢ)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)基因表达的影响。方法浓度0.1、1、10、102、103、104、2.5×105、5×105U/ml IFN γ作用于HSC-T6细胞48 h,采用四甲基偶氮唑盐比色法观察其对HSC-T6细胞生长指数的影响;以1、102、104U/ml IFN γ作用于HSC-T6细胞48 h,采用逆转录聚合酶链反应方法测定其对HSC-T6细胞Col Ⅰ、ColⅢ、TIMP1基因表达的影响。结果空白对照组ColⅠ、ColⅢ、TIMP1基因表达水平分别为2.86±0.21、2.00±0.23、3.90±0.81;1U/m1、102U/ml、104U/ml IFNγ作用于HSC-T6细胞,ColⅠ基因表达水平依次为1.00±0.11、0.42±0.12、0.33±0.12,与空白对照组比较, 差异有统计学意义;ColⅢ基因表达水平依次为1.09±0.1 5、0.52±0.14、0.43±0.18,与空白对照组比较, 差异有统计学意义;TIMP1基因表达水平依次为3.81±0.37、3.50±0.51、3.41±0.31,与空白对照组比较,差异无统计学意义。结论IFNγ明显抑制HSC-T6细胞colⅠ、ColⅢ基因表达水平,而对TIMP1基因表达水平无明显影响,从而可抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,这可能是其抗纤维化的作用机制之一。     

肝星状细胞合成气体信号分子H2S的测定及其意义

目的:测定活化肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)H2S的生成率及对细胞增殖的影响.方法:采用活化大鼠HSC-T6,分4组:对照组、炔丙基甘氨酸(D-Propargylglycine,DL-PPG)组、N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)组、氯化高铁血红素(hemin)组,每组重复6个皿.RT-PCR检测HSC-T6胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)mRNA水平,亚甲基蓝分光光度法测定H2S生成率,MTT法观察不同浓度外源性H2S供体-NaSH(0,50,100,500,1000 μmol/L)对HSC-T6增殖的影响.结果:HSC-T6能自分泌H2S,DL-PPG可明显减少HSC-T6 H2S生成率(4.55 nmol/min±1.06 nmol/min vs 6.79 nmol/min±1.27 nmol/min,P<0.05).RT-PCR显示:HSC-T6 CSEmRNA阳性,DL-PPG、hemin均降低HSC-T6CSEmRNA水平(P<0.05);L-NAME对HSC-T6CSE mRNA无明显影响.50 μmol/L NaSH可明显促进HSC-T6增殖(细胞存活率为116%),500-1000 μmol/L NaSH对细胞增殖无明显影响.结论:活化HSC自分泌H2S,并且影响其增殖.H2S在肝纤维化及肝硬化门脉高压症的发生机制可能有重要作用.     

苦参素调节Wnt/Jnk通路介导的糖代谢抑制肝星状细胞活化

目的探索苦参素(oxymatrine,OM)抗肝纤维化的分子机制。方法使用高糖培养基诱导肝星状细胞(HSC-T6)以及基质胶诱导的静息HSC-T6(M-HSC-T6)的活化,通过OM干预,观察细胞活性的变化。同时建立CCl_4诱导的大鼠肝纤维化模型(模型组),治疗组用OM干预,对照组正常喂养。行HE及Masson染色观察大鼠肝脏病理变化;通过荧光定量PCR及Western-Blot检测各组细胞以及大鼠肝组织α-SMA,Clol1A1以及己糖激酶2(HK2)、果糖激酶(PFKP)表达的变化;使用Western-Blot检测各组细胞以及大鼠肝组织总Jnk和pJnk的表达变化。结果高糖刺激能显著增强HSC-T6以及M-HSC-T6细胞活性,上调HK2、PFKP mRNA以及蛋白质的表达,促进Jnk磷酸化;模型组大鼠肝脏纤维化程度较对照组明显升高,肝组织HK2、PFKP mRNA以及蛋白质表达增加,Jnk磷酸化增强(P0.05)。与之相比,OM能显著抑制HSC-T6活性,改善大鼠肝脏病理变化,降低细胞以及大鼠肝组织HK2、PFKP mRNA及蛋白质表达,减少Jnk磷酸化(P0.05)。结论苦参素通过下调Wnt/Jnk介导的糖代谢过程,抑制HSC-T6的活化,从而延缓肝纤维化进展。     

黄芩素对TGF-β1诱导HSC-T6细胞活化的影响及其机制的研究

目的探讨黄芩素对TGF-β1诱导HSC-T6细胞活化的影响及其作用机制。方法不同浓度黄芩素(125、250、500、1 000 nmol/L)预处理HSC-T6细胞后再加入含TGF-β1(5μg/L)处理细胞48 h。采用MTT法测定其对HSC-T6增殖作用的影响;免疫细胞化学法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;通过分光光度检测HSC-T6内NOX酶的活性;通过免疫荧光染色检测HSC-T6内ROS的生成。结果黄芩素预处理后HSC-T6增殖能力明显减弱,差异有统计学意义(P0.05、0.01,F=37.318),且呈浓度相关性;随着黄芩素浓度的增加,HSC-T6内α-SMA表达逐渐下降,与TGF-β1处理组比较,差异有统计学意义(P0.05);黄芩素预处理后HSC-T6内NOX的活性显著低于TGF-β1处理组,差异有统计学意义(P0.05,F=40.367),而500、1 000 nmol/L黄芩素组NOX的活性比较差异无统计学意义;黄芩素预处理HSC-T6后细胞内ROS表达较TGF-β1刺激组明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论黄芩素可以抑制由TGF-β1诱导的HSC-T6细胞活化;机制与其抑制HSC-T6细胞内NOX活性,从而降低ROS的产生有关。     

四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠肝组织和HSC-T6细胞NOX4基因及其蛋白表达的变化

目的 探讨四氯化碳(CCl₄)诱导的肝纤维化小鼠和肝星状细胞(HSC-T6)还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族氧化酶4(NOX4)基因及其蛋白表达的变化。方法 采用腹腔注射四氯化碳(CCl₄)构建10只小鼠肝纤维化模型,采用qRT-PCR法和Western Blot法检测小鼠肝组织NOX4基因和蛋白表达水平。将肝星状细胞(HSC-T6)分为对照组、无意干预组和NOX4-siRNA干预组,后两组分别采用脂质体2000将无意义序列或NOX4-siRNA转染HSC-T6细胞,采用qRT-PCR法和Western Blot法检测HSC-T6细胞NOX4、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I 型胶原(Col1a I)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)、金属蛋白酶2(MMP-2)、转化生长因子 β1(TGF-β1)、Smad2和Smad3水平,采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞活性氧(ROS)含量,采用MTT法检测细胞增殖,使用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。结果 模型小鼠肝组织出现明显的病理学损伤,有大量的胶原纤维沉积;模型组小鼠肝组织NOX4 mRNA水平显著高于对照组(P＜0.05);与对照组细胞比,NOX4-siRNA干预组细胞NOX4 mRNA及其蛋白、ROS、增殖活性、S期细胞比例、α-SMA、Col1a I、TIMP-1、MMP-2、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3表达水平显著降低,而G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)。结论 肝纤维化组织NOX4呈高水平,下调NOX4可抑制肝星状细胞的增殖和活化,并促进其凋亡,可能是通过下调TGF-β/Smad信号通路实现的。     

过氧化物酶增殖体激活受体γ通过上调miR-124表达抑制急性肺损伤肺泡巨噬细胞炎症反应

目的探讨PPARγ上调miR-124表达对急性肺损伤(ALI)肺泡巨噬细胞炎症反应的抑制作用及分子机制。方法分离和培养10例ALI和10例健康非吸烟者的肺泡巨噬细胞,检测PPARγ、miR-124及其靶基因TRAF6的表达变化;分别用PPARγ激动剂罗格列酮(RGZ)、PPARγ拮抗剂GW9662或miR-124抑制剂(antagomir-124)干预人肺泡巨噬细胞后,real time RT-PCR检测miR-124及其靶基因TRAF6的表达;人单核细胞THP-1细胞转染含miR-124启动子区的虫荧光素酶报告基因质粒,再经PPARγ激动剂RGZ或拮抗剂GW9662处理,检测报告基因活性;小鼠经LPS刺激后再经PPARγ激动剂RGZ处理,或经antagomir-124预处理后,再经PPARγ激动剂RGZ处理后,real time RT-PCR检测小鼠肺组织中miR-124、炎症相关因子TRAF6、IL-6、TNF-α的表达。结果 ALI患者肺泡巨噬细胞中PPARγ与miR-124的表达均降低,而miR-124靶基因TRAF6表达显著升高;激动剂活化的PPARγ能上调人肺泡巨噬细胞的miR-124,并下调miR-124靶基因TRAF6,而PPARγ拮抗剂GW9662可削弱罗格列酮上调miR-124的表达进而减弱miR-124对其靶基因TRAF6表达的抑制作用,并且miR-124抑制剂减弱PPARγ对TRAF6表达的抑制作用;活化的PPARγ显著促进miR-124启动子活性,而PPARγ拮抗剂GW9662,明显减弱PPARγ激动剂罗格列酮对miR-124启动子的转录活性的上调作用;在LPS诱导的小鼠ALI模型上,活化的PPARγ通过上调miR-124抑制小鼠肺组织IL-6、TNF-α的表达,而PPARγ拮抗剂GW9662和antagomir-124预处理均减弱PPARγ对小鼠肺组织IL-6、TNF-α的表达的抑制作用。结论PPARγ激活后可通过上调miR-124表达抑制ALI肺泡巨噬细胞的炎症反应。     

Hedgehog-Gli 1信号通路对肝星状细胞增殖和凋亡的调控作用

目的 研究肝星状细胞(HSC)中hedgehog(Hh)信号通路成员Shh、patched、smoothened(Smo)和Gli-1的表达,及Hh通路抑制剂环耙明对HSC-T6细胞株增殖、凋亡及其激活的影响.方法 体外培养HSC株,提取细胞总RNA,用RT-PCR扩增Shh、patched、Smo、Gli-1基因;用环耙明作用HSC-T6后采用四甲基偶氮唑盐法检测其在体外对HSC-T6的抑制情况,流式细胞仪检测其对HSC-T6细胞周期的影响,碘化丙啶和膜联蛋白-Ⅴ双染荧光标记法及提取细胞DNA检测HSC-T6细胞凋亡,荧光定量聚合酶链反应检测Gli-1,转化生长因子β1、血小板衍生生长因子、Bcl-2 mRNA的表达水平.结果 HSC-T6中表达有Hh通路家族成员.环耙明在50、100、150、200,250 μmol/L作用下,A值分别为1.55±0.07、1.19 ±0.05,0.78±0.06、0.48±0.03、0.38±0.04,正常对照组为1.74±0.03,环耙明组与正常对照组相比,F=636.81,P<0.01,差异有统计学意义.流式细胞术测出干预后环耙明G0/G1期细胞所占比例为65.08%±1.50%,正常对照组为55.41%±2.54%,两组比较,t=-8.05,P<0.01.药物干预后提取DNA及碘化丙啶和膜联蛋白-Ⅴ双染荧光标记均检测出HSC-T6细胞凋亡.荧光定量结果表明,经环耙明干预后,HSC-T6细胞中Gli-1、转化生长因子β1、血小板衍生生长因子、Bcl-2 mRNA的目的基因相对表达量分别0.28±0.05、0.13±0.04、0.07±0.04、0.17±0.02,正常对照组为1,各基因表达量较正常对照组均明显降低,t值分别为23.09、31.34、43.87和59.10,P值均<0.01,差异有统计学意义.结论 HSC-T6中存在Hh信号通路,环耙明能抑制HSC增殖及增殖周期,促进活化的HSC凋亡,其抑制HSC活化可能是通过抑制Hh-Gli-1信号通路的结果.     

调控Notch信号对肝星状细胞活化的影响

目的 探讨肝星状细胞(HSC-T6)内是否存在功能激活的Notch信号分子以及调控Notch信号转导对HSC-T6活化的影响. 方法 用PCR方法检测Notch信号分子mRNA在HSC-T6细胞内的表达,TaqMan探针检测转化生长因子(TGF)β 1刺激HSC-T6后Notch信号分子的表达变化.细胞免疫荧光法检测Notch3和Jagged1在HSC-T6内的表达定位.用携带Notch3胞内域(ICD)的真核表达质粒pcDNA3.1-N3ICD和特异性干扰Notch3的siRNA(Notch3-siRNA)分别转染HSC-T6细胞,Western blot检测Notch3、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和Ⅰ型胶原的表达变化.对数据采用t检验和方差分析. 结果 HSC-T6细胞内存在功能激活的Notch信号转导.TGF β 1(2.0 ng/ml)刺激HSC-T6导致Jagged1、Notch3和HES-1的mRNA水平明显上调,分别提高了2.9、3.2、2.2倍,F值分别为2543.482,287.982和1719.851,P值均＜0.01.pcDNA3.1-N3ICD转染后促使HSC-T6合成α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白增加,较对照组分别提高了5.8倍和4.5倍,t值分别为13.157和9.810,P值均＜0.01;相反,Notch3- siRNA明显抑制HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白,较对照组分别下降了约90％和84％,t值分别为19.863和10.376,P值均＜0.01.而且,Notch3-siRNA能拮抗TGFβ1诱导HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原的作用.结论 Notch信号通路可能通过调控肝星状细胞的活化参与肝纤维化的形成,选择性地干预Notch3信号转导可能成为抗肝纤维化的新途径.     

罗格列酮对老年胰岛素抵抗大鼠肝脏腺苷酸活化蛋白激酶α表达及活性的影响

目的 探讨罗格列酮(RGZ)对老年胰岛素抵抗(IR)大鼠肝脏脂肪酸代谢和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α表达及活性的影响. 方法 22～24月龄雄性Wistar大鼠随机分为老年对照(OC)组和高脂喂养组.4周后高脂喂养组IR状态形成,再随机分为高脂(HF)组和RGZ干预(RGZ)组,RGZ组予RGZ 3mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃,继续喂养4周.测定肝脏TG和AMPKα1、AMPKα2 mRNA表达,以及AMPKα1、AMPKα2、p-AMPKα蛋白表达. 结果 (1)HF组FPG、FIns、FFA、TC和TG高于OC组;而RGZ干预后这些指标均下降;葡萄糖输注率HF组低于OC组,RGZ组高于HF组(P<0.05或P<0.01).(2)肝脏TG HF组高于OC组,RGZ组低于HF组(P<0.01).(3)肝脏AMPKα1、AMPKα2mRNA表达和蛋白表达三组问无统计学差异(P>0.05);肝脏P-AMPKα蛋白表达HF组低于OC组,RGZ组高于HF组(P<0.05或P<0.01). 结论 高脂饮食导致老年大鼠肝脏脂肪酸代谢异常及IR;RGZ干预后AMPKα活性增加和肝脏脂质堆积减少,IR改善.     

Smad3 shRNA抑制TGFβ1对HSC-T6细胞活化的抗肝纤维化作用

目的观察Smad3 shRNA对TGFβ1作用于大鼠HSC-T6细胞增殖、细胞周期以及分泌肝纤维化胶原的影响。方法Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6,应用流式细胞仪检测其感染率,Real-time PCR检测对Smad3 mRNA表达的抑制作用;将HSC-T6对照、HSC-T6+TGFβ1(10 ng/ml)、Smad3 shRNA以及Smad3 shRNA+TGFβ1(10 ng/ml)这4组细胞进行如下检测:(1)MTT检测细胞增殖;(2)流式细胞仪检测TGFβ1作用24、36 h细胞周期分布;(3)Real-time PCR检测24、36 h时细胞周期、增殖及肝纤维化相关基因mRNA的表达变化;(4)ELISA检测24、36 h培养液上清中胶原蛋白(COL)Ⅰ、COLⅢ及α-SMA的含量。结果Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6细胞至96 h,感染率为71.3%,对Smad3 mRNA的表达抑制率为50%。(1)MTT结果显示,TGFβ1促进HSC-T6增殖;与相应未感染Smad3 shRNA病毒组相比,Smad3 shRNA组以及Smad3 shRNA+TGFβ1组细胞增殖能力均下降。(2)细胞周期检测发现,24、36 h时,Smad3 shRNA+TGFβ1组与Smad3 shRNA组相比,细胞周期分布差异无统计学意义(P>0.05);(3)Real-time PCR显示,Smad3 shRNA+TGFβ1组较HSC-T6+TGFβ1组,Smad3、原癌基因(c-myc)、细胞周期依赖性激酶-2(CDK-2)、细胞周期素E(cyclin E)、表皮生长因子(EGF)、核因子-κB(NF-κB)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、COLⅠ及基质金属蛋白酶(MMP)14等基因的mRNA在24、36 h表达均下调,HGF mRNA及COLⅢmRNA在24 h时上调、36 h时下调,Bcl-2 mRNA、MMP1 mRNA及MMP9 mRNA在24 h和36 h两个时段均表达上调。(4)ELISA检测发现,同一时间点比较,分别在24、36 h,TGFβ1可促进HSC-T6细胞COLⅠ(P=0.00,P=0.02)、α-SMA(P=0.00,P=0.01)的分泌;与HSC-T6+TGFβ1组相比,Smad3 shRNA+TGFβ1组COLⅠ于36 h分泌减少(P=0.00)、而α-SMA在24、36 h两个时间点分泌减少(P=0.00)。结论 Smad3 shRNA抑制了TGFβ1对HSC-T6的活化,显示了抗肝纤维化作用。     

罗格列酮对糖尿病大鼠残存胰岛表达肝细胞生长因子的影响

目的 观察罗格列酮对实验性1型糖尿病大鼠残存胰岛表达肝细胞生长因子(HGF)的影响. 方法 SD大鼠随机分为3组,正常对照(Con)组24只,糖尿病(DM)组24只,罗格列酮干预(RGZ)组24只.于应用罗格列酮后5个时间段分别测定各组FBG、FIns.免疫组化法检测胰岛中Ins及HGF的表达,并进行形态学量化分析. 结果 与DM组相比,RGZ组经罗格列酮干预后2周,血清胰岛素水平逐渐上升;血糖水平逐渐下降;胰腺相对β细胞量明显增多;胰岛HGF表达水平提高(P均<0.05).RGZ组胰岛HGF表达水平与胰腺相对β细胞量(r=0.766,P<0.05)及血清胰岛素水平(r=0.740,P<0.05)呈正相关. 结论 罗格列酮能增加实验性1型糖尿病SD大鼠β细胞数量,其机制可能与上调胰岛HGF的表达有关.     

葛根素对大鼠肝星状细胞生长及NF-κB p65和TGF-β1表达的影响

目的探讨葛根素对大鼠肝星状细胞生长及核转录因子κB亚基(NF-κB)p65和转化生长因子(TGF)-β1表达的影响。方法将培养的大鼠肝星状HSC-T6细胞随机分为溶剂组和葛根素组,葛根素组包括0.1、1.0和10.0μmol/L 3个不同浓度组,溶剂组加入二甲基亚砜(DMSO)。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的周期分布,酶联免疫吸附(ELISA)检测细胞中TGF-β1含量,Western印迹检测细胞NF-κB p65蛋白表达。结果葛根素能够呈浓度-时间效应关系抑制HSC-T6细胞增殖,诱导细胞阻滞于G0/G1期。TGF-β1含量和NF-κB p65蛋白的表达水平均随葛根素浓度的增加而降低。结论葛根素能够抑制HSC-T6细胞生长,其作用机制可能与抑制炎症相关因子TGF-β1和NF-κB信号通路有关。     

PPARγ受体在大鼠缺氧性肾小管上皮细胞损伤中的表达及意义

目的：探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ PPARγ）在大鼠缺氧性肾小管上皮细胞（ RTEC）损伤中的表达及意义。方法将体外传代培养的大鼠RTEC 随机分为正常对照组、缺氧模型组、罗格列酮（ RGZ ）组和GW9662组。 RGZ组加入15μmol／L RGZ,GW9662组加入25μmol／L GW9662,将缺氧模型组、RGZ组、GW9662组放入真空罐中制作RTEC缺氧模型。正常对照组细胞不做处理。造模36 h后,采RT-PCR法和Western blot法检测各组RTEC PPARγ、转化生长因子-β1（ TGF-β1）的mRNA及蛋白表达。结果与正常对照组比较,缺氧模型组、RGZ组、GW9662组RTEC PPARγmRNA表达显著升高、蛋白表达显著降低（P均＜0．05）;与缺氧模型组相比,RGZ组RTEC PPARγmRNA表达降低,GW9662组表达上升（ P均＜0．05）。与正常对照组比较,缺氧模型组、RGZ组、GW9662组RTEC TGF-β1 mRNA表达显著降低、蛋白表达显著升高（P均＜0．05）;与缺氧模型组比较,RGZ组RTEC TGF-β1 mRNA表达上升,GW9662组表达降低（P均＜0．05）。相关性分析显示,缺氧性RTEC损伤中PPARγ的蛋白表达与TGF-β1的蛋白表达呈显著负相关（r＝－0．91,P＜0．05）。结论 PPARγ蛋白的低表达可能参与了缺氧性RTEC损伤的发生;RGZ可能通过上调PPARγ蛋白的表达而减轻缺氧性RTEC损伤。