hnRNP B1 siRNA对肺癌组织hnRNP B1表达干扰效果的体内研究

目的 在体内实验中观察所构建的核内不均一核糖核蛋白B1(hnRNP B1)特异性的siRNA真核细胞表达载体对肺癌组织hnRNP B1表达的干扰作用.方法 选取转染本课题组已构建并经体外实验证实有较好干扰效果的两对hnRNP B1特异性的siRNA真核细胞表达载体(重组质粒A和B)的人肺腺癌细胞株A549,将其接种于BALB/C nu/nu裸鼠右前腋下,构建肺癌动物模型.分别应用RT-PCR和免疫组织化学的方法检测接种40、60 d时肿瘤组织中的hnRNP B1 mRNA和蛋白质表达水平.结果 hnRNP B1特异性的siRNA真核细胞表达载体在体内表达40 d时均能较稳定而明显地抑制肿瘤组织中hnRNP B1 mRNA的表达,免疫组织化学从蛋白表达方面也予以证实,而且重组质粒A和B两组间的表达的差异无统计学意义.但是随着时间的延长(接种60 d时),siRNA的干扰效果会逐渐减弱,与未转染A549细胞比较无明显差异.结论 hnRNP B1特异性的siRNA在体内可以稳定的表达,并且能特异、高效地抑制肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因的表达,有望成为肺癌基因治疗的合理策略之一.     

hnRNP K 在肺腺癌中表达及其作用的研究

目的 研究核内不均一核糖核蛋白K(hnRNP K) 在肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞生长及凋亡的影响.方法 采用SP免疫组织化学方法对经手术切除病理确诊为肺腺癌的70例肺癌组织标本进行hnRNP K蛋白表达的检测,根据不同肿瘤的直径,计算阳性表达率;构建hnRNP K siRNA表达载体,采用Lipofectamine 2000瞬时转染A549细胞24 h后,RT-PCR、Western blot检测A549细胞hnRNP K mRNA及其蛋白表达量;以流式细胞仪检测重组质粒hnRNP K siRNA及siRNAn转染A549细胞后细胞周期及凋亡的变化.结果 肺腺癌组织中肿瘤直径≤3 cm、3～5 cm、≥5 cm的hnRNP K的阳性表达率分别为38.5%、95.2%、91.7%;hnRNP K siRNA转染24 h后的A549细胞hnRNPK mRNA及蛋白表达明显被抑制(P<0.01);hnRNP K siRNA能显著抑制A549的生长及细胞周期的分布,G0/G1的细胞数从37.21%增加到85.60%,S和G2/M的细胞数分别从47.71%、13.00%减少到13.50%和0.32%,差异均有统计学意义(P<0.01).hnRNP K siRNA能促进A549的凋亡,其凋亡率达到4.79%(P<0.01).结论 hnRNP K能促进肺腺癌细胞的生长;hnRNP K siRNA可抑制肺腺癌细胞的生长,促进其凋亡.     

RNA干扰Grp78蛋白对肺癌细胞A549的作用研究

目的 探讨采用RNA干扰Grp78蛋白表达,观察对肺癌细胞A549的作用.方法 通过转染Grp78的siRNA质粒到肺癌细胞A549并进行表达,观察A549细胞的Grp78蛋白的表达及细胞的侵袭和转移能力的变化.结果 RNA干扰肺癌细胞A549的Grp78的表达,能够显著地抑制癌细胞的黏附、伸展,以及MMP-2,MMP-9蛋白的表达,甚至诱导细胞凋亡.结论 siRNA特异性下调Grp78蛋白,可以抑制肺癌细胞A549的侵袭和转移,甚至导致细胞凋亡.     

hnRNP B1 siRNA对肺腺癌细胞A549 p53表达的影响

目的 探讨核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)B1调节肺腺癌细胞A549抑癌基因p53表达的作用.方法 采用前期研究已构建并通过体外实验证实具有较好干扰效果的两对hnRNP B1特异性的小干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体(重组质粒A和D)转染的人肺腺癌细胞株A549作为实验组,对照组为转染空质粒的A549细胞和未转染任何质粒的A549细胞.各组细胞均用10 μmol/L顺铂作用24 h收集细胞.实时荧光定量RT-PCR检测p53 mRNA的表达,Western blot检测P53及磷酸化P53蛋白表达的变化.结果 各组细胞p53 mRNA和蛋白表达量无明显差异,说明hnRNP B1特异性siRNA对A549细胞p53基因mRNA和蛋白表达无影响.转染hnRNP B1 siRNA细胞磷酸化P53蛋白表达率分别为0.87±0.06、0.75±0.06,与空质粒转染组(0.30±0.08) 和未转染组(0.21±0.04)相比明显增高(P<0.01).结论 hnRNP B1 siRNA可上调肺腺癌细胞A549 P53活性,参与肺癌的发生发展.     

沉默神经元特异性烯醇酶基因对肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究神经元特异性烯醇酶(NSE)对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法用免疫细胞化学检测人小细胞肺癌(SCLC)细胞株NCI-H446和非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549中NSE蛋白的表达,再用RNA干扰技术抑制细胞中NSE基因的表达,最后用流式细胞术、Western blotting及分光光度法检测NSE基因下调后细胞周期分布、Ki67蛋白表达、凋亡细胞百分率及Caspase-3活性。结果 A549和NCI-H446细胞均表达NSE蛋白,特异性siRNA转染显著抑制了细胞中NSE基因的表达,抑制率达90%以上,NSE下调后细胞中S期细胞百分率、Ki67蛋白表达量显著降低,而凋亡细胞百分率和Caspase-3活性显著增加。结论 NSE基因的表达促进了伴有NE分化的肺癌细胞的增殖和抑制细胞凋亡,这可能是NE分化的肺癌细胞具有更为恶性表型的原因之一。     

RNA干扰介导的人肺腺癌A549细胞FasL基因沉默及意义

目的构建针对肿瘤凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,研究RNA干扰技术对人肺腺癌A549细胞FasLmRNA表达的抑制作用,探索Fas／FasI途径在肺癌转移中的作用机制。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasLmRNA为靶基因,合成2对编码短发夹结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达质粒pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR检测细胞FasL mRNA水平的变化。结果成功构建发卡样FasLsiRNA真核表达载体,转染人肺腺癌A549细胞后,FasLmRNA的表达水平显著下降。结论成功构建的FasL基因siRNA真核表达载体pSi2．0-FasL能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasLmRNA的表达。     

hnRNP B1对人肺癌A549细胞DNA-PK活性及细胞周期、凋亡的影响

目的 探讨核内不均一核糖核蛋白B1(heterogeneous nuclear ribonucleprotein B1, hnRNP B1)对肺癌细胞抑癌基因DNA依赖蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)的活性、细胞周期和凋亡的影响.方法 根据干扰hnRNP B1基因序列的两段不同靶序列构建2个hnRNP B1的siRNA 抑制表达质粒A、D,转染人肺癌A549细胞.实验分组为重组质粒A、D转染的A549细胞、空质粒转染的A549细胞、未转染的A549细胞、预先用DNA-PK抑制剂NU7026(10 μmol/L)作用1 h的重组质粒A、D转染的A549细胞. Western blot检测各组细胞hnRNP B1表达.采用DNA-PK检测试剂盒检测DNA-PKcs 激酶活性.以流式细胞仪检测细胞周期及凋亡.结果 hnRNP B1 siRNA抑制肺癌细胞hnRNP B1表达;转染hnRNP B1 siRNA细胞的DNA-PK活性、凋亡率较未转染组明显增高(P均<0.05);G1期细胞明显增多(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05).预先用NU7026处理的转染hnRNP B1 siRNA细胞组与未处理的转染组比较,其G1期细胞明显降低(P<0.05), S期细胞明显增多(P<0.05),凋亡率明显降低(P<0.05); DNA-PK酶活性和细胞凋亡率成明显的正相关(相关系数r=0.817,P<0.01). 结论 hnRNP B1可以使DNA-PK酶活性降低,从而影响细胞基因组的稳定及参与调控肺癌细胞周期与凋亡.     

siRNA干扰Pokemon基因影响A549细胞增殖的实验研究

目的 研究siRNA干扰Pokemon基因对肺腺癌A549细胞增殖抑制效应的变化.方法 专业设计合成3条针对Pokemon的siRNA,分别转染A549细胞后,RT-PCR检测转录水平Pokemon mRNA表达的变化,筛选出其中最高效的1条siRNA;用MTT法检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞增殖的抑制作用;流式细胞技术检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞凋亡的影响.结果 3条siRNA均成功转染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞呈圆绿色.RT-PCR结果显示有2条siRNA使细胞中Pokemon的mRNA表达降低(P＜0.05).MTT法结果显示siRNA干扰Pokemon后对A549细胞增殖有抑制作用(P＜0.05),其中48 h抑制效率达(24.14±1.39)％.流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰Pokemon可增加A549细胞的凋亡,凋亡率为14.05％.结论 应用RNA干扰Pokemon基因能够抑制A549细胞的增殖,促进A549细胞的凋亡.Pokemon基因有可能成为肺癌治疗中的一个新靶点.     

hnRNP K siRNA真核表达载体的构建及其在A549肺癌细胞中沉默效应的研究

目的 构建hnRNP K特异性siRNA真核表达载体,体外观察对hnRNP K基因的沉默作用.方法 采用基因克隆技术,将合成的特异性hnRNP K RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体pSUPER,构建hnRNP K siRNA真核表达载体.采用Lipofect AMINE2000将pSUPER空载体和3个重组质粒(pSUPER/hnRNP K siRNAa,pSUPER/hnRNP K siRNAc和pSUPER/siRNAn)分别导入A549肺癌细胞(a、c、n分别代表hnRNP K编码序列中的A链和c链,以及无意义的对照序列Non链).24 h后用RT-PCR和Western blot技术检测各实验组肺癌细胞内hnRNP K mRNA及蛋白水平的表达情况.结果 成功构建了hnRNP K siRNA真核表达载体.转染hnRNP K siRNAa、hnRNP K siRNAc的肺癌细胞24 h后hnRNP K mRNA相对表达量分别为0.24±0.53和0.28±0.57,较对照组显著降低(P均<0.01);hnRNP K蛋白灰度值分别为0.23±0.11和0.28±0.09,较对照组显著降低(P均<0.05).结论 构建的RNA干扰真核表达载体能明显干扰A549细胞hnRNP K mRNA及蛋白的表达,为进一步研究hnRNP K基因的功能并应用于肺癌的治疗研究奠定了基础.     

siRNA联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达的影响。方法 在肺癌A549细胞中转染survivin基因的siRNA,分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blotting方法检测survivin基因mRNA和蛋白的表达。将肺癌A549细胞分为单纯放射组、单纯转染组、转染+放射组,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用细胞集落形成实验检测细胞增殖情况,采用CCK8测细胞生长曲线。结果 siRNA能抑制肺癌细胞survivin基因mRNA和蛋白的表达。siRNA联合预照射较单纯转染和单纯放射能显著增加细胞凋亡率,降低细胞的集落形成,抑制细胞生长。结论 预照射可以增强siRNA对肺癌细胞survivin基因的抑制作用。     

靶向IGF-1R的siRNA增强肺癌细胞对Trail诱导凋亡敏感性的研究

目的 研究IGF-1R特异RNA干扰后肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的改变以及其对Trail的敏感性。 方法 化学合成IGF-1R特异siRNA转录模板,与表达载体连接,转染大肠杆菌扩增后提取质粒,酶切鉴定和DNA测序分析。转染A549细胞后筛选稳定表达IGF-1R-siRNA细胞株,FQ RT-PCR、Western blot和免疫组织化学检测IGF-1R基因表达。MTT法和流式细胞仪测定Trail作用前后转染和非转染A549细胞增殖活性和凋亡率。 结果 成功构建IGF-1R-siRNA表达载体并筛选出稳定表达IGF-1R-siRNA单克隆细胞。和空白对照相比IGF-1R蛋白和IGF-1RmRNA表达分别下降79.01%(0.17±0.06 vs.0.81±0.15)(P＜0.01)和76.05%(1.36±0.26 vs.5.68±0.45)(P＜0.01)。免疫组织化学显示IGF-1R表达降低。Trail作用于IGF-1R-siRNA的A549,细胞增殖速度降低(P＜0.05);凋亡率明显增加(P＜0.01)。 结论 IGF-1R-siRNA表达载体具有RNA干扰作用。IGF-1R表达下降后A549细胞增殖速度减慢,对Trail诱导的细胞凋亡敏感性增加。      

NuclesteminsiRNA对人肺腺癌紫杉醇耐药株A549／Taxol的耐药性逆转的研究

目的：探讨Nuclestemin基因（NS）特异性RNA干扰对人肺腺癌紫杉醇耐药株A549／Taxol细胞耐药性的逆转作用。方法：NS特异性RNAi表达载体转染A549／Taxol细胞。提取肿瘤细胞总RNA,用RT—PCR方法检测NS的表达;利用M1Tr法检测紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）。结果：NS特异性RNAi表达载体转染A549／Taxol细胞后,Ns的表达量明显降低,并且对紫杉醇敏感性的相对逆转率达65．3％。结论：．Nuclestemin基因siRNA能有效逆转A549／Taxol细胞的耐药性,明显提高耐药细胞对紫杉醇的敏感性。     

RNA干扰沉默IGF-I R表达对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性的影响

目的:评价RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子Ⅰ类受体(IGF-I R)表达的阻断效应,和IGF-I R基因沉默后细胞增殖、凋亡等生物学特性及肿瘤细胞对化疗药物敏感性的改变.方珐:应用U6启动子,介导DNA模板转录生成短发夹样RNA(shRNA),并转染人肺癌A549细胞株,从而产生IGF-I R特异性小干扰RNA(siRNA),经RT-PCR和Western blot检测IGF-I R表达的改变;联合应用化疗药物顺铂(DDP),通过MTT法和流式细胞技术等,观察细胞生长、细胞周期、细胞凋亡及DDP半数致死量(IC50)的变化.结果:IGF-I R表达水平明显下降(抑制率高达89.8%),肿瘤细胞增殖能力明显减弱,细胞滞留于G0期的比例上升;DDP对肿瘤细胞24 h、48 h、72 h的IC50均明显减少,IGF-I R siRNAl组DDP作用72h的IC50为0.92 mg/L,明显低于control-siRNA组的3.77 mg/L,0.5 mg/L DDP联合IGF-I R siRNAl作用48 h后,A549细胞的生长抑制率达32.1%,明显高于control-siRNA组的18.9%,细胞凋亡率从27.8%上升至44.2%.结论:运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF-I R的表达,使细胞增殖能力减弱,化疗敏感性增加.     

MT1X siRNA对肺癌A549/DDP细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨金属硫蛋白1X（MT1X）在肺癌耐药细胞株（A549／DDP）顺铂耐药中的作用。方法通过化学合成针对MT1X的siRNA段抑制其在A549／DDP中的表达,实时定量聚合酶链反应（PCR）及WB检测干扰效果,M1Tr及平板克隆形成实验检测干扰前后细胞对顺铂的药物敏感性变化;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果针对MT1X的siRNA片段能在RNA及蛋白水平有效抑制其在A549／DDP中的表达;与对照组相比,MT1X表达被抑制后,肿瘤细胞对顺铂的敏感性明显升高;增殖被抑制,平板克隆形成率明显降低（P〈O．05）,细胞凋亡率显著增高（P〈0．05）。结论针对MT1X的siRNA片段可部分逆转肺癌细胞（A549／DDP）对顺铂的耐受,为提高肺癌的化疗效率提供了一种新方法。     

AEG-1抑制miR-137对非小细胞肺癌增殖调控作用

目的 探讨AEG-1在miR-137抑制非小细胞肺癌(NSCLC)增殖中的作用及机制。方法收集2013年2月~2014年5月在本院手术治疗的65例NSCLC患者肿瘤标本,提取RNA,qRT-PCR检测NSCLC组织、A549、H460及16HBE细胞中miR-137与AEG-1的表达,统计分析NSCLC组织中miR-137与胶质细胞上调基因1(AEG-1)表达的相关性;将A549细胞根据不同转染试剂分成4组:转染miR-137 mimics及空载体组,转染miR-137 mimics及AEG-1表达载体组,转染miR-137 inhibitor及siRNA无关序列组,转染miR-137 inhibitor及AEG-1 siRNA组。用Lipofectamine 2000进行转染,生长曲线实验检测转染后细胞增殖情况。结果在NSCLC组织中miR-137与AEG-1的表达呈负相关;miR-137表达高的NSCLC细胞中AEG-1表达降低;共同转染miR-137 mimics与AEG-1过表达载体的A549细胞在48 h的细胞数高于对照组,而共同转染miR-137 inhibitor与AEG-1 siRNA的A549细胞在48 h、72 h的细胞数低于对照组。结论miR-137与AEG-1在NSCLC组织及细胞中表达呈负相关;AEG-1逆转miR-137对NSCLC细胞增殖的作用。     

c-myc RNA干扰增强肺腺癌细胞对吉西他滨的敏感性

目的：探讨c-mycRNA干扰后肺腺癌细胞A549对吉西他滨敏感性的改变。方法：构建c-myc特异RNA小干扰（siRNA）的表达载体,转染A549细胞,G418筛选出稳定表达c-myc特异siRNA的细胞株,荧光实时定量RT-PCR和免疫印迹检测c-myc基因表达水平。吉西他滨作用于干扰有效A549细胞,分为GE＋siRNA组、GE组、siRNA组和空白对照组。每组12例,四甲基偶氮唑蓝法检测吸光度,流式细胞仪测凋亡率。结果：成功构建c-myc-siRNA表达载体。c-myc基因mRNA和蛋白表达下降71.9%和85.6%。吉西他滨作用于c-myc-siRNA细胞其吸光度在各时间点较单用吉西他滨组、单用c-myc-siRNA组以及对照组均下降（P＜0.01）,凋亡率增加（P＜0.01）。结论：c-mycRNA干扰后A549细胞的增殖减慢,对吉西他滨的敏感性增加。     

RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响

目的 探讨利用RNA干扰技术沉默切除修复交叉互补基因组1(ERCC1)表达对非小细胞肺癌耐药细胞株顺铂化疗敏感性的影响.方法 设计并合成3段靶向人的ERCC1基因的小分子干扰RNA(siRNA),构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine 2000转染入人肺癌细胞株A549/...     

siRNA 表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究

目的 观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化.结果 HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长.结论 HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.