WT1基因表达下调对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响

目的 探讨WT1基因表达下调对人红白血病耐药细胞系K562/A02阿霉素敏感性的影响.方法 将WT1mRNA的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA)构建至真核表达载体后转染K562/A02细胞,流式细胞术检测转染效率;荧光定量RT-PCR和Western blot法分析WT1基因在转染前后表达的差异;pWT1shRNA转染K562/A02细胞48 h并经阿霉素作用后,MTT法检测各组细胞阿霉素IC50值;流式细胞术检测细胞阿霉素累积量及细胞凋亡率.结果 与未转染对照组及空载体组相比,转染WT1shRNA质粒的K562/A02细胞WT1mRNA和蛋白水平均明显降低;经阿霉素诱导24 h后,其对阿霉素的敏感性明显增高,相对逆转率为71.5%,细胞内阿霉素的累积量较各对照组明显增高(P值均<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论 靶向WT1shRNA干扰质粒可有效抑制K562/A02细胞WT1基因表达,增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

联合转染mdr1和mcl1基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对mdr1和mcl1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对K562/A02细胞耐药的逆转作用.方法根据mdr1和mcl1基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性shRNA干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染K562/A02细胞,用G418和(或)Hygro B筛选出稳定表达的细胞克隆.用RT-PCR分析mdr1和mcl1 mRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术测定细胞P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率.结果成功构建两个基因的shRNA干扰表达质粒.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组mdr1基因和mcl1基因的mRNA相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染后K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对K562/A02细胞耐药逆转率最高,P糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P《0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P《0.01).联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P《0.05).结论转染mdr1或mcl1基因的shRNA干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果.mcl1基因可能与K562/A02耐药相关.     

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景：survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。目的：构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。方法：以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coliTOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。结果与结论：将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24h比48h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。     

联合转染mdrl和mcll基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对 mdrl 和 mell 基因的短发夹 RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对 K562/A02细胞耐药的逆转作用。方法根据 mdrl 和 mell 基因表达序列设计有效的 RNA 干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性 shRNA 干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染 K562/A02细胞,用 G418和(或)Hygro B 筛选出稳定表达的细胞克隆。用RT-PCR 分析 mdrl 和 mcll mRNA 的表达;MTT 法检测阿霉素对 K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术测定细胞 P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率。结果成功构建两个基因的 shRNA干扰表达质粒。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染 K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组 mdrl 基因和 mell 基因的 mRNA 相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染后 K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对 K562/A02细胞耐药逆转率最高,P 糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P<0.01)。联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论转染 mdrl 或 mell 基因的 shRNA 干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转 K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果。mell 基因可能与 K562/A02耐药相关。     

RHD基因的克隆及其在K562细胞中的表达

本研究目的在于克隆人类红细胞RHD基因，构建RhD表达载体，观察其在K562细胞中的表达。从脐血网织红细胞中提取总RNA，采用逆转录聚合酶链反应扩增RHD／CE基因，扩增产物通过TA连接克隆到pGEM-T质粒，采用测序方法筛选多个克隆获得RHD基因。将获得的RHD基因进一步亚克隆构建pcDNA3．1(-)表达载体。重组表达载体通过superfect试剂盒转染K562细胞，最后观察K562细胞中RHD基因的转录和表达。结果表明：成功分离克隆到RHD基因，构建的pcDNA3.1(-)重组表达载体经酶切和测序证实RHD cDNA序列及插入方向正确。转染后的K562细胞内有相应的mRNA转录，细胞表面有RhD抗原表达。结论：RHD cDNA转染的K562细胞能表达RhD抗原，该表达体系有助于进一步研究各种RhD变异型的分子基础。     

CD44基因沉默对K562/A02细胞逆转耐药及生物学活性的研究

本研究旨在探讨CD44基因表达抑制对白血病多药耐药细胞株K562/A02耐药性及生物学活性的影响。根据CD44基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,将其插入质粒表达载体中,获得针对CD44mRNA的特异性siRNA真核质粒(pGCsiRNA-CD44),转染K562/A02细胞。用实时荧光定量RT-PCR检测K562/A02细胞CD44、mdr-1和bcl-2mRNA的表达;用MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术(FACS)检测细胞周期;Hochest33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果表明:针对CD44基因的siRNA真核质粒可有效沉默K562/A02细胞的CD44基因:与对照组相比,转染了4条pGCsiRNA-CD44质粒的K562/A02细胞CD44表达均明显受抑,以转染了siCD44-1的细胞中抑制最强。转染pGCsiRNA-CD44质粒48小时后,K562/A02细胞CD44mRNA表达水平下降64.1%(p0.05),同时mdr-1与bcl-2mRNA的表达量较对照组分别下降了25.6%与50.8%;K562/A02细胞IC50为(17.97±1.61)μg/ml,无义序列质粒转染后阿霉素对K562/A02细胞的IC50为(16.95±1.72)μg/ml,pGCsiRNA-CD44转染后IC50明显降低为(8.77±1.63)μg/ml(p0.01)。转染48小时后,G0/G1期细胞比例提高了10.7%;细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论:特异性CD44siRNA可显著抑制K562/A02细胞CD44基因的表达,抑制细胞增殖,诱导其凋亡,并有效逆转K562/A02细胞的多药耐药性。     

mdr1和GSTπ基因缄默逆转K562/A02细胞多药耐药性的研究

目的研究短发夹状小分子干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)对白血病多药耐药细胞株K562/A02mdr1和谷胱甘肽S-转移酶(GST)π基因的表达和功能的影响。方法根据mdr1mRNA第79~99位和GSTπmRNA第308~327位核苷酸为作用靶点,合成针对靶区域序列的shRNA,克隆入pSilencer2.1-U6neo,克隆产物为pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ,转染K562/A02细胞株。用实时荧光定量PCR检测K562/A02细胞mdr1和GSTπmRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞半数抑制浓度(IC50)。结果经pSilence-mdr1转染后的K562/A02细胞mdr1mRNA表达量下降了71.5%,从(2.80±1.65)×108拷贝/μg RNA下降至(3.90±2.37)×107拷贝/μg RNA(P<0.01);同时pSilence-GSTπ作用后,K562/A02细胞GSTπmRNA表达量较对照组下降了39.8%,从(2.30±1.14)×105拷贝/μg RNA下降至(5.40±2.45)×104拷贝/μg RNA(P<0.01);空载体转染后阿霉素的耐药指数为23,pSilence-mdr1转染后为8,pSilence-GSTπ转染后为10,差异有统计学意义(P<0.01)。结论shRNA可有效逆转K562/A02细胞mdr1和GSTπ的多药耐药性。     

应用Gateway技术构建pLenti6-Akt shRNA真核表达载体

目的 应用Gateway技术构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株HepG2,验证该载体能否下调Akt基因的mRNA水平.方法 以Akt基因为靶点设计两条具有短发卡结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6入门表达载体(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;利用Gateway技术进行LR位点特异性重组,将shRNA导入目的 表达载体pLenti6/Block-it DEST Vector,再行测序鉴定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对mRNA水平的抑制效果.结果 经菌落PCR和DNA测序鉴定:pENTR/U6-Akts入门载体和pLenti6-Akts目的 表达载体中插入片段的序列正确,RT-PCR结果表明将shRNA分别转染HepG2细胞后,Akt的mRNA表达受到明显抑制,其中1shRNA比2#shRNA抑制效果明显.结论 利用Gateway技术成功构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体,为以Akt基因为靶点的肝癌基因治疗方案奠定了实验基础.     

靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系,G418（500 mg/L）有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降（P〈0.05）。结论：成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。     

发夹状siRNA逆转白血病K562/A02细胞株mdr1和GSTπ功能的研究

目的研究发夹状小分子干扰RNA(small RNA interference,siRNA)对白血病多药耐药细胞株K562/A02多药耐药基因(mdr1)和谷胱甘肽S-转移酶(GSTπ)基因功能的影响。方法以 mdr1 mRNA第79-99和GSTπ mRNA第308-327核苷酸为作用靶点,合成针对靶区域序列的发夹状 siRNA,克隆入pSilencer2．1-U6 neo,克隆产物为pSilence mdr1和pSilence GSTπ,转染K562/A02细胞株。用Western blot和荧光免疫组化法观察P糖蛋白(P-gp)和GSTπ蛋白的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞半数抑制浓度(IC50)。结果 Western blot检测显示转染pSilence mdr1和pSilence GSTπ的K562/A02细胞株与K562/A02细胞对照组相比,P-gp和GSTπ的表达明显下降,分别从0．75 ±0．02和0．54±0．02下降到0．48±0．05和0．39±0．02(P值均<0．01),α-微管蛋白的表达没有变化;转染pSilence核纤层蛋白A/C的K562/A02细胞株与对照组相比,核纤层蛋白A/C表达明显下降,但P-gp和GSTπ的表达不变;荧光免疫组化显示P-gp和GSTπ阳性细胞比例从转染前的(71．25± 9．65)％和(81．25±6．49)％下降到转染后的(35．25±5:97)％和(41．25±4．43)％(P值均<0．01); 转染空载体后K562/A02细胞对阿霉素的耐药指数为23,转染pSilence mdr1和pSilence GSTπ后分别下降为8和10,差异有统计学意义(P<0．01),结论 siRNA可有效、特异地逆转K562/A02细胞株 mdr1和GSTπ的多药耐药性。     

shRNA介导的RNA干扰对小鼠T淋巴细胞CD28基因的沉默效应

目的 探讨短发夹状RNA(shRNA)对C57BL/6J小鼠T淋巴细胞CD28共刺激分子基因沉默效应,评价shRNA对目的 基因干扰效应的时效性和稳定性,筛选出高效的干扰序列用于后期的动物实验.方法 首先构建3个载有CD28特异性shRNA(shRNA1～3)的表达质粒和1个非特异性shRNA表达质粒,将其分别转染小鼠脾淋巴细胞,以非特异性的shRNA表达质粒组和未转染组分别作为阴性对照和空白对照,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平评价转染l～20 d内CD28 shRNA对CD28基因的干扰效应,并筛选出干扰效率最高的序列.结果 ①成功构建了CD28 shRNA表达载体;②3种CD28 shRNA均可在mRNA和蛋白质水平有效沉默目的 基因,与实验对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01):CD28 mRNA拷贝数持续降低,3种CD28 shRNA转染C57BL/6J小鼠脾细胞20 d,小鼠脾细胞CD28 mRNA拷贝绝对数分别下降了99.62%、99.89%和99.80%;CD28蛋白表达水平分别降低了(84.90±0.65)%、(96.49±0.03)%和(91.76±0.32)%,以CD28 shRNA 2组的抑制效率最高(P＜0.01).结论 ①特异性的CD28 shRNA可长期、稳定地介导CD28基因沉默;②针对CD28基因不同位点的不同shRNA也有干扰效率的差异.     

转化生长因子-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：针对转化生长因子-β（TGF-β）Ⅱ型受体基因的不同部位，构建不同TG-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA（shRNA）表达质粒载体，在转录后水平抑制TGF-βⅡ型受体的表达，对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法：用DNA重组技术将针对人TGF-βⅡ型受体基因不同部位所设计的4对shRNA序列克隆到真核表达质粒pSilencer^TM 3．1-H1 neo vector中，构建TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-β R ⅡshRNA1、2、3、4。脂质体介导转染成人原代成纤维细胞，经G418筛选抑制TGF-βⅡ型受体表达的稳定细胞克隆。结果：3个TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-βRⅡ shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westem blotting均证实3种shRNA重组质粒中pSilencer^TM3．1-H1—TGF-βRⅡshRNA2可明显降低细胞内TGF-βⅡ型受体mRNA峰度及TGF-βⅡ型受体蛋白表达。结论：成功构建了TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilenceir^M3.1—H1-TGF-βRⅡshRNA1、2、3，并筛选出特异而高效的阻断TGF-βⅡ型受体表达的克隆。此实验结果为进一步研究TGF-βⅡ型受体蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

PEGFP-C1/U6质粒载体介导的表达MDR1 shRNA的质粒构建

为了构建pEGFP-C1／U6载体介导MDR1短发卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）表达的质粒，针对MDR1的19碱基大小的片段．分别设计2对寡核苷酸，形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pEGFP-C1载体（命名为pEGFP-C1／U6），两对DNA双链连接后形成中间由9个碱基序列间隔的反向互补序列，构建成能产生MDR1短发卡RNA的质粒。结果表明：经酶切、连接后构建成的质粒（pEGFP-C1／U6／A和pEGFP-C1／U6／B），经酶切与测序证实构建成功，无任何碱基突变。结论：成功构建了能表达MDR1 shRNA的质粒栽体pEGFP-C1／U6／A和pEGFP-C1／U6／B，此项研究结果可能为临床上逆转肿瘤多药耐药提供一种有效的方法。     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。     

FLT3靶向短发夹状干扰RNA体外转录合成及作用

FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）是一种酪氨酸激酶受体,在大多数急性髓系白血病（AML）患者中持续激活,与患者预后差密切相关。为探讨3种FLT3靶向短发夹状干扰RNA（shRNA）对急性髓系白血病细胞株THP-1的沉默效应,设计和体外转录合成3个FLT3靶向shRNA（shRNA1、shRNA2、shRNA3）,体外转染THP-1细胞;以RT-PCR法检测FLT3mRNA水平表达,用流式细胞术、免疫荧光测定法检测FLT3蛋白的表达。结果显示：shRNA1、shRNA3可显著下调FLT3mRNA的表达,其中shRNA1的抑制作用较强。25nmol/LshRNA1转染48小时对FLT3mRNA的抑制率是（72.95±2.07）%,作用可达72小时。5nmol/L及以上浓度的shRNA1对FLT3mRNA表达有下调作用,作用存在量-效关系。15nmol/LshRNA1的抑制率是（67.53±0.66）%。FLT3蛋白位于细胞膜上,shRNA1对其有较强的抑制作用,转染72小时蛋白抑制率达（79.67±0.66）%。结论：FLT3-shRNA1具有较好的FLT3基因靶向抑制作用,可作为进一步研究该基因作用机制及靶向治疗可能性的工具。     

SIK2 shRNA重组腺病毒载体构建及其在3T3-L1脂肪细胞的表达

目的构建特异性小鼠盐诱导基因（Salt induced kinase2,SIK2）的shRNA腺病毒载体,干扰脂肪细胞中SIK2的表达。方法设计3对靶向SIK2的shRNA,插入穿梭质粒pENTR/U6载体,转染3T3-L1脂肪细胞,通过Real-timePCR方法筛选最佳沉默SIK2效果的穿梭质粒,经腺病毒同源重组后,重组小鼠SIK2shRNA腺病毒载体经脂质体转染HEK293A细胞,在细胞内包装获得腺病毒颗粒AdV-SIK2-shRNA,并进行大量扩增和纯化。纯化的腺病毒感染成熟的3T3-L1脂肪细胞,通过Real-time PCR及免疫印迹法检测鼠SIK2在3T3-L1脂肪细胞中的表达水平。结果纯化后的Ad-shRNA-SIK2重组腺病毒载体可特异下调成熟3T3-L1脂肪细胞SIK2 mRNA和SIK2蛋白的表达。结论干扰3T3-L1脂肪细胞SIK2表达的短发夹RNA重组腺病毒载体构建成功。     

Efficient gene transfer of HIV-1-specific short hairpin RNA into human lymphocytic cells using recombinant adeno-associated virus vectors.

The cellular introduction of short, interfering RNA leads to sequence-specific degradation of homologous mRNA, a process termed RNA interference (RNAi). Here, we report that recombinant adeno-associated virus 2 (rAAV-2) can be used to transfer short hairpin (sh) RNA expression cassettes genetically into human cells. HIV-1 replication was suppressed by >95% in H9 cells and primary human lymphocytes that expressed shRNA targeting the first exon of the viral transactivator protein tat compared to control cells. rAAV-2 integrated stably into the host genome, leading to long-term expression of tat shRNA. Our findings demonstrate the utility of rAAV-2 for the genetic transfer of shRNA expression cassettes into human cells, providing an alternative to using retroviral vectors as RNAi delivery systems.