BCR/ABL融合基因表达检测技术建立及其初步应用

目的建立BCR/ABL融合基因表达定量分析的双色荧光定量PCR技术;探讨所建立的双色荧光定量PCR技术在CML早期诊断中的临床应用特点。方法据BCR/ABL融合基因序列,设计合成BCR/ABL融合基因及ABL基因特异的引物TaqM an探针。提取患者骨髓细胞标本总RNA,逆转录成cNDA;在同一PCR反应管中同时进行两种基因的双色荧光定量PCR反应,分别定量测BCR/ABL融合基因和ABL基因的表达量,并计算两种基因表达的比值。检测标本中两种基因的表达量,计算检测的阳性率,所得结果与临床诊断结果对比,以判断该技术在CML检测诊断中的价值。结果成功地建立了BCR/ABL融合基因检测的双色荧光定量PCR技术方法;在35例临床CML患者中,33例检出融合基因阳性,检测阳性率94.3%;12例正常人cDNA均未检出融合基因阳性。结论所建立的BCR/ABL融合基因检测的双色荧光定量PCR是一种快速、准确、高通量而费用又较为低廉的基因检测技术,该技术检测CML具有临床可行性。     

BCR/ABL融合基因产物P~(210)在白血病诊断中的临床意义

目的:建立一种用抗ABL单克隆抗体,检测外周血P210BCR/ABL融合基因蛋白,为临床提供:特异、灵敏、快速诊断白血病的新方法。方法:采用WesternBloting印迹法检测68例符合FBA分型的白血病(CML)患者外周血细胞中P210蛋白。结果:CML患者外周血细胞中P210蛋白均为阳性。结论:外周血BCR/ABL融合基因蛋白检测法材料来源方便病人无痛苦,对提高CML患者的明确诊断和预后评估具有特异、可靠、准确、省时的临床应用价值。     

BCR/ABL融合基因和转录因子FoxO3a在初发和急变慢性粒细胞白血病患者中的表达变化

目的:观察慢性粒细胞白血病(CML)初发和急变患者外周血BCR/ABL融合基因和转录因子FoxO3a的表达变化及其意义.方法:利用EVA Green建立实时荧光RT-PCR检测BCR/ABL、FoxO3a和GAPDH的方法,检测25例CML初发和25例CML急变患者的外周血样本中BCR/ABL融合基因和FoxO3a的表达,以及30例正常人外周血样本中FoxO3a的表达,以GAPDH为内参基因,各组基因表达水平的差异采用△△CT相对定量法.结果:CML急变患者外周血BCR/ABL融合基因的表达水平是初发患者的4.72倍,正常人外周血样本中FoxO3a的表达水平分别是CML初发和急变患者的143.39倍和8.18倍.结论:BCR/ABL融合基因的高表达与转录因子FoxO3a的低表达可能与CML不同阶段的病理过程相关联.     

染色体核型分析和荧光原位杂交技术对慢性粒细胞性白血病的诊治意义

目的 分析染色体核型分析和荧光原位杂交（FISH）检测方法在慢性粒细胞性白血病（CML） 中的诊治意义。方法 171 例标本应用染色体R 显带进行核型分析,218 例标本应用间期FISH 进行分析。 结果 在171 例患者中,116 例（68%）检出Ph 染色体,22 例（13%）存在其他异常核型。218 例CML 患者 标本应用FISH 进行分析,174 例（80%）检出BCR/ABL 基因。76% CML 患者BCR/ABL 融合基因产生的蛋 白类型为P210,3% CML 患者BCR/ABL 融合基因产生的蛋白类型为P210 共表达P190,0.95% CML 患者融 合基因产生的蛋白类型为P190。另外,18% CML 患者存在der（9）部分序列缺失。结论 FISH 对BCR/ABL 融合基因检出率高于染色体核型分析对Ph 的检出率。染色体核型分析可提示Ph 染色体及多种其他异常核型。 FISH 分析可提示是否存在BCR/ABL 融合基因,也可提示不同的融合蛋白类型,还可提示der（9）的部分序 列缺失与否。2 种分析方法可以多角度提示CML 患者的疾病信息,在CML 的诊治中有重要的临床价值。     

BCR/ABL融合基因及细胞免疫表型检测在慢性粒细胞白血病病期演变中的意义

[目的]通过检测BCR/ABL融合基因及表面抗原在31例CML患者外周血单个核细胞中的表达,以寻找其与CML病程进展的相关性.[方法]收集31例CML患者外周血:①逆转录聚合酶链反应:检测BCR/ABL融合基因;②应用流式细胞仪检测外周血单个核细胞CD33、CD34、CD117及HLA-DR的表达.[结果]①CML患者31例,BCR/ABL融合基因检出总阳性率为83.9%;其转录本有两种:b3a2(165 bp)和b2a2(90bp).BCR/ABL融合基因的检出率在慢性期、加速期与急变期患者间差异无显著性意义,但缓解期检出阳性率与其他各期比较明显降低(P＜0.05).②CD33阳性检出率在各期之间比较无统计学意义(P＞0.05);CD34、CD117及HLA-DR阳性检出率在加速期及急变期明显高于慢性期(P＜0.05).[结论]①CML患者外周血单个核细胞BCR/ABL融合基因转录本有两种,即b3a2(165 bp)和b2a2(90bp).②b2a2转录本单独出现及b3a2和b2a2两种转录本同时出现的病例多发生在加速期和急变期,提示出现b2a2型转录本或两种转录本同时存在可能成为CML患者预后较差的标志.③CD34、CD117及HLA-DR的过度表达可提示CML患者病情不稳定及可能出现恶化.     

以急淋为起始的慢性粒细胞白血病骨髓形态学及分子生物学特点

目的:研究以急性淋巴细胞白血病为起始的Ph1阳性、BCR/ABL融合基因阳性的慢性粒细胞白血病细胞形态学和分子生物学特点。方法:采用细胞形态学、分子生物学、组织化学、流式细胞免疫标记技术及染色体检测法。结果:骨髓象以原始、幼稚淋巴细胞为主,粒细胞比例相对于急性淋巴细胞白血病较高;细胞表面标记以CD19、CD20为主,中性粒细胞碱性磷酸酶积分减低,Ph染色体阳性、BCR/ABL融合基因阳性。结论:在细胞形态学基础上,同时开展Ph染色体和BCR/ABL融合基因检测对以急性淋巴细胞白血病为起始的Ph1阳性、BCR/ABL融合基因阳性的慢性粒细胞白血病的诊断是非常必要的。     

抗ABL胞内抗体对K562细胞酪氨酸激酶活性的影响

目的:观察人慢性粒细胞白血病(CML)细胞转导抗ABL胞内抗体基因后,对其酪氨酸激酶活性的影响。方法:构建逆转录病毒载体MSCV-ib-IRES-eGFP,转导K562细胞,分选eGFP 的细胞,用RT-PCR检测胞内抗体mRNA的表达,观察细胞内BCR/ABL、c-ABL酪氨酸激酶活性及细胞总蛋白酪氨酸激酶活性的变化。结果:获得表达胞内抗体的K562细胞:K562-ib-eGFP。RT-PCR证实胞内抗体mRNA在K562-ib-eGFP细胞内表达。与对照组相比,K562-ib-eGFP细胞内BCR/ABL和c-ABL蛋白酪氨酸激酶活性及总蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑制。结论:转导抗ABL胞内抗体能有效降低CML细胞内ABL酪氨酸激酶活性,为进一步研究打下基础。     

实时定量聚合酶链式反应与巢式聚合酶链式反应在 289例白血病融合基因检测中的比较

 目的 比较实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）与巢式聚合酶链式反应（nPCR）在白血病融合基因BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO检测中结果。方法 分别应用RT-PCR与nPCR对289例急慢性白血病初诊和完全缓解的患者BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO融合基因进行检测,结合患者骨髓细胞形态学及临床转归予以分析。结果 46例初诊慢性粒细胞白血病（CML）患者中,RT-PCR法与nPCR法检测BCR/ABL融合基因阳性率分别为95.7%和93.5%（P=0.997）;69例完全缓解CML患者中,RT-PCR法与nPCR法检测阳性率分别为78.4%和58.1%（P<0.005）。32例初诊急性早幼粒细胞白血病（APL）患者中,RT-PCR法与nPCR法检测PML/RARa融合基因阳性率分别为93.8%和90.6%（P=0.996）;114例完全缓解APL患者中,RT-PCR法与nPCR法检测阳性率分别为12.3%和7.0%（P<0.025）。12例初诊急性粒细胞白血病M2（ANLL-M2）患者中,RT-PCR法与nPCR法检测AML1/ETO融合基因阳性率分别为50.0%和50.0%（P=1.0）;16例完全缓解ANLL-M2患者中,RT-PCR法与nPCR法检测阳性率分别为50.0%和12.5%（P<0.05）。结论 RT-PCR较nPCR更为敏感而准确,应用RT-PCR可以提高微小残留病的检出率,为临床诊断和治疗提供更为有效的分子生物学依据。     

慢性髓性白血病基因治疗

攻击慢性髓性白血病(CML)的新型基因疗法将于1998年6月开始进行临床试验。试验的核心是一种逆转录病毒的结构——使甲氨蝶呤耐受基因与针对CML的BCR/ABL基因重新排列特性的反义序列相结合。 CML的癌细胞含有异常小的费城染色体,是第9与第22染色体长臂之间易位的结果。易位融合了部分ABL基因与部分BCR基因。此融合基因的蛋白产物的活性持久,并且与CML的发生有关。     

慢性粒细胞白血病治疗进展及存在的临床问题

慢性粒细胞白血病(CML)可能是一种最早被诊断的白血病。早在1845年人们就认识到CML是一种新的疾病，巨脾及白细胞增多为其特征。1960年，人们发现CML特有的染色体异常，即费城(Ph)染色体。上个世纪80年代，人们发现费城染色体携带一种特异的融合基因——BCR—ABL基因。现在，人们已经知道BCR—ABL融合基因及其编码的带有酪氨     

聚合酶链反应阵列同时定量检测37种白血病融合基因

目的建立一种同时定量检测多种白血病染色体易位形成的融合基因的荧光实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）方法,了解阵列式PCR的应用可行性。方法组合使用82条引物,设立66个PCR平行管,同时定量检测37种白血病常见融合基因形成的125种剪切体和4种白血病常见的原癌基因活化。实时定量PCR采用Eva Green荧光染料法,用ABL基因做内参,用比较Ct法进行相对定量。用此方案对31例白血病患者标本进行检测,其中6例慢性粒细胞白血病（CML）患者做治疗前后或治疗过程中不同时间的对比检测,28人次与多重巢式PCR方案的检测结果进行对照。结果我们建立的PCR阵列方案有较大的线性检测范围（10^2～10^8拷贝／μl）,有较高的检测灵敏度（232拷贝／μl）和精确性;在31例患者标本的检测中,共检测到14种融合基因类型和所有4种原癌基因活化;检测到一例同时有5种融合基因阳性和两种原癌基因活化的患者;和多重巢式PCR检测结果的对比显示本方案灵敏度略低于巢式PCR,但差异没有统计学意义（P=0．009）;6例CML患者标本的检测显示治疗后患者标本中BCR／ABL融合基因及WT1和EVI1原癌基因表达量均呈现不同程度的降低,与临床治疗情况符合;基因定量分析的结果表明本方案能够对常见白血病融合基因和癌基因活化情况进行定量分析,在白血病的诊断及疗效监测中有应用价值。结论PCR阵列法同时定量检测多种白血病融合基因适于白血病初诊患者融合基因的筛查及微小残留病（MRD）的检测,对于检测同时有多种融合基因存在的病例及治疗过程中融合基因的变异情况更为有用。     

研究慢性粒细胞性白血病病理发生中下游信号传导和分子调控的干细胞模型

获得慢性粒细胞白血病人原代干祖细胞模型 ,旨在研究慢粒白血病病理发生中信号传导的分子机制。方法　转导b3a2bcr/ablcDNA到正常人CD34 细胞中构建人原代慢性粒细胞性白血病模型。采用细胞免疫组化测定了p2 10 BCR/ABL在CD34 细胞中的表达 ;细胞粘附、迁移实验进行模型鉴定 ;FACS法测定了p2 10 BCR/ABL转导及对照CD34 细胞p2 7kip和MDR 1Pgp的表达。结果　相对于对照的CD34 细胞 ,转导了bcr/abl的CD34 细胞对纤粘连蛋白 (fibronectin ,FN)的粘附性下降 ;而在FN上的迁移能力增强 ;在低浓度细胞因子或血清条件下表现为凋亡延迟 ;细胞的粒系克隆形成单位数量明显增多 ,这一模型再现了原代慢粒白血病的异常表型特征 ,并以此模型发现p2 10 BCR/ABL转染CD34 细胞上调了p2 7Kip水平并可诱导MDR 1Pgp异常表达。结论　该模型适用于慢粒病理发生中的信号分子传导及分子调控研究 ,提示了慢粒耐药的分子机制。     

Ph1染色体及bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病中的诊断意义

目的 探讨Ph1染色体和bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断中的意义.方法 选择28例慢性粒细胞白血病患者和20例缺铁性贫血患者作为研究对象,采用骨髓细胞短期培养法制备染色体、采用RT-PCR法分析bcr/abl融合基因.结果 28例慢性粒细胞白血病患者中,Ph1染色体阳性者25例(89.3%),bcr/abl阳性者26例(92.9%),Ph1和bcr/abl均阳性25例(89.3%),Ph1阴性、bcr/abl阳性1例(3.6%),Ph1和bcr/abl均阴性2例(7.1%).20例缺铁性贫血患者Ph1和bcr/abl均阴性.结论 Ph1染色体、bcr/abl融合基因的检测有助于慢性粒细胞白血病的诊断和鉴别诊断.     

慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因实时定量检测平台的建立

目的：建立慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia ,CML）患者BCR-ABL融合基因检测及微小残留病变实时定量监测的诊断平台。方法依据GenBank中编码P210蛋白的融合基因M（ b2a2,b3a3）及ABL的基因序列,分别设计引物及Taqman探针,以BCR-ABL阳性的CML患者cDNA为模板,通过PCR扩增出587 bp的基因片段,连入pMD 18-T载体,制备成标准品并绘制标准曲线,运用实时荧光定量PCR（ real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术监测BCR-ABL转录水平的变化。结果成功构建BCR-ABL标准品。应用RQ-PCR探针法,以ABL为内参,对CML患者进行BCR-ABL融合基因的检测,得到比较稳定的定量数据,与定性结果一致。结论自行构建BCR-ABL质粒为标准品,运用RQ-PCR实时监测BCR-ABL融合基因的表达变化,敏感性好,稳定性高,对临床检验具有普遍意义。     

BCR/ABL基因转录水平与慢性粒细胞性白血病病程关系的探讨

应用细胞原位杂交方法,对29例处于不同病期的慢性粒细胞性白血病(慢粒)患者肿瘤细胞中BCR/ABL融合基因的转录水平进行研究。结果发现,急变期组(n=5)和加速期组(n=7)患者的白血病细胞中该融合基因的转录水平明显高于慢性期患者组(n=17)(P<0.01),而急变期组和加速期组之间该mRNA的水平无显著差异。结果提示,白血病细胞中BCR/ABL融合基因的转录水平与病程进展关系密切,采用细胞原位杂交的方法检测白血病细胞中BCR/ABL融合mRNA的水平,不仅可用于慢粒及慢粒急变的辅助诊断,而且可早期预测急变的发生。     

慢性粒细胞性白血病骨髓间充质干细胞的分离纯化及其功能特性的研究

目的 分离、纯化慢性粒细胞性白血病（CML）患者骨髓间充质干细胞（MSC）,并对MSC进行功能、特性鉴定。方法 获取CML患者的骨髓MSC,应用极限稀释法获取单克隆来源的MSC,并在低血清培养液中培养和扩增;流式细胞术检测MSC免疫表型和细胞周期;通过油红O染色、Von Kossa染色和Western印迹检测MSC向脂肪、骨和神经细胞的分化。电镜检测CML患者骨髓MSC的超微结构;通过软琼脂培养法和裸鼠接种,确定CML来源的MSC是否存在致瘤性。结果 MSC在相应的诱导条件下可以向骨、脂肪和神经细胞分化。CML来源的MSC在倒置显微镜下为梭形,表达CD29、CD44、CDl05,而CDllb,CD31、CD34、CD45、HLA—DR均为阴性。CML来源的MSCBCR／ABL融合基因阴性,不具备体内和体外致瘤性。结论CML患者骨髓中存在具有多向分化能力的MSC,该细胞群体不具备体外和体内致瘤性,表现为正常MSC的生物学特征。