ABCG2/Bcrpl基因在大鼠肝脏卵圆细胞中的表达

目的探讨ABCG2／Bcrp1基因在大鼠肝脏卵圆细胞中的表达及意义。方法建立大鼠2-乙酰氨基芴／三分之二肝切除模型，二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心分离大鼠肝脏卵圆细胞，采用荧光定量PCR技术检测ABCG2／Bcrp1基因在大鼠肝脏卵圆细胞和肝细胞中的表达水平，免疫组织化学、免疫荧光双标染色和Westernblot方法检测该转运蛋白的表达。结果大鼠肝卵圆细胞中ABCG2／Bcrp1基因的表达水平是肝细胞的13．8倍，ABCG2／Bcrp1蛋白相对分子质量大小为72000，定位于卵圆细胞膜。其表达位于门脉区周围，并向肝小叶延伸。免疫荧光双标染色显示与OV-6共表达。结论大鼠肝卵圆细胞表达高水平的ABCG2／Bcrp1，后者参与肝干细胞免受外源性化学物质损伤的自我保护机制。     

大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞标志分析

目的研究简单易行的成体大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞鉴定方法。方法采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12d切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和RT-PCR分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达。结果分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达。生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性。结论简单易行的肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础。     

硫氧还蛋白2在2-乙酰氨基芴加肝切除诱导的卵圆细胞中的表达及意义

目的 观察硫氧还蛋白2(Trx2)在2-乙酰氨基芴(2-AAF)加肝切除诱导的卵圆细胞增殖中的表达,并探讨其表达的意义.方法 Balb/c小鼠喂饲2-AAF加2/3肝切除方法诱导肝脏卵圆细胞的增殖.经门静脉灌注消化法和等密度离心法分离卵圆细胞,并在体外进行原代培养.免疫荧光和双标法对培养的细胞进行鉴定.免疫组化法检测卵圆细胞的增殖,免疫荧光法检测Trx2在卵圆细胞和肝实质细胞中的表达,TUNEL法检测卵圆细胞和肝实质细胞的凋亡.结果 喂饲2-AAF后引起肝脏损伤,与肝切除前相比,肝切除后肝脏损伤明显加重(P＜0.01),同时有明显的卵圆细胞增殖.卵圆细胞中Trx2的表达明显高于肝实质细胞,同时其凋亡率明显低于肝实质细胞(P＜0.01).结论 喂饲2-AAF加2/3肝切除可以引起严重的肝损伤,促进卵圆细胞增殖,卵圆细胞高表达Trx2可以抑制自身凋亡和损伤,在肝脏功能的恢复过程中起着非常重要的作用.     

小鼠成体肝脏干细胞体外培养模型的建立

目的 观察正常成体小鼠肝细胞的增殖能力和分化潜能,分离成体小鼠肝脏内可能存在的干细胞或祖细胞,建立细胞培养模型.方法 应用改良的Seglen二步法灌注和离心分离肝脏细胞,用含血清的改良DMEM培养基进行培养,持续观察超过60 d.应用免疫荧光技术对肝细胞及其形成的克隆进行Albumin、AFP和CKl9染色.结果 部分肝脏细胞培养第2～3天后活化,迅速增殖并形成细胞克隆,培养30 d后克隆内出现类似成熟的肝细胞,细胞克隆持续扩增超过60d.该类细胞培养第1天强阳性表达肝细胞标记物Albumin,培养第5天细胞克隆开始表达肝脏干细胞标记物AFP,第55天表达胆管细胞标记物CKl9.结论 在成体小鼠未损伤肝脏内存在一种成体肝脏祖细胞(adult hepatic progenitor cells,AHPCs),该细胞体外培养具有较强的增殖能力,可分化为肝细胞和胆管细胞,并成功建立了AHPCs的体外培养模型.     

大鼠2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中卵圆细胞增殖动力学的初步研究

目的 研究大鼠肝脏卵圆细胞增殖模型中卵圆细胞增殖率的变化,进一步了解卵圆细胞生物学特性.方法 采用2-乙酰胺基芴/部分肝切除(2-AAF/PH)的方法建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型.免疫荧光双标技术检测肝切除术后不同时间点肝脏石蜡切片中卵圆细胞标志物上皮细胞黏附分子和增殖标志物增殖细胞核抗原的共表达情况,对阳性细胞进行定量计数分析;并采用荧光双标和天狼猩红染色观察此过程中肝星状细胞激活和肝脏胶原沉积的情况.结果 术后第2天门静脉区开始出现少量卵圆细胞,到第9天数量达到高峰,此后数量逐步下降.此过程中卵圆细胞的增殖率逐步下降,从第2天的(91.3±1.6)%下降到第12天的(53.6±4.4)%,差异有统计学意义(P＜0.01).激活的肝星状细胞一直伴随卵圆细胞增殖并向肝实质延伸,分泌的胶原形成细胞外基质包绕小管样结构的卵圆细胞.结论 2-AAF/PH模型中卵圆细胞数量达到高峰前,其增殖率已经开始逐渐下降.肝星状细胞可能通过分泌细胞外基质和多种因子严格调控卵圆细胞的增殖.     

大鼠肝卵圆细胞的分离培养和体外分化研究

目的 观察大鼠肝卵圆细胞的活化，为进一步研究肝卵圆细胞特征建立简单的分离培养方法。方法 利用2-乙酰氨基笏／部分肝切除建立肝卵圆细胞活化的大鼠模型，采用选择性消化法从该模型中分离纯化肝卵圆细胞，并做免疫细胞荧光鉴定。用丁酸钠诱导其分化。结果 成功地建立了肝卵圆细胞活化模型，并从中分离培养了表达OV6、CK19、AFP、白蛋白、c-kit、Thy1、CD45和CD34的卵圆细胞。在丁酸钠刺激下它可向肝细胞分化。结论 利用选择性消化法可以分离到肝卵圆细胞，并且其具有肝干细胞的特征。     

大鼠肝卵圆细胞的体外分离、培养及脾内移植

我们在成功建立和优化大鼠肝卵圆细胞增殖模型的基础上[1,2 ] ,在体外对大鼠肝卵圆细胞进行分离与培养 ,并将其移植入同种异体大鼠脾脏内 ,观察其在脾内的演变结果 ,为肝干细胞移植的临床应用提供实验依据。一、材料与方法1.大鼠肝卵圆细胞分离 :采用本室建立和改进的体外两步灌流法分离大鼠肝实质细胞和非实质细胞[3 ] ;所获细胞先用 5 0g离心 ,沉淀即为肝实质细胞 ,上清液中富含肝卵圆细胞 ,上清液采用 5 0 0g进行离心 ,沉淀物中富含肝卵圆细胞 ,加F12培养液悬浮细胞 ,再用相同条件离心 ,反复 3次 ,将沉淀物用F12培养液制备成细胞悬液 ;…     

自噬对肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中增殖的影响

目的观察自噬对肝卵圆细(hepatic oval cell,HOC)在缺血缺氧微环境中增殖的影响。方法体外培养肝卵圆细胞建立缺血缺氧模型,检测缺血缺氧0、2、4、8和24 h的自噬情况,每个时间点设置单纯缺血缺氧组(ischemia-hypoxia),缺血缺氧+氯喹组(ischemia-hypoxia+CQ),正常对照组(control)。以CCK-8法检测各组HOC增殖能力的变化;Hoechst 33258染色观察细胞凋亡;应用丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色荧光定位法、免疫荧光细胞化学染色法观察各组细胞的自噬,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞LC3-II/I蛋白表达情况。结果缺血缺氧对肝卵圆细胞的增殖有抑制作用,且缺血缺氧时间越长抑制越明显。与对照组相比,随着缺血缺氧的时间的延长,MDC染色阳性细胞数,细胞免疫荧光强度和自噬特异标记分子LC3 II水平及LC3-II与LC3-I的比值显著增加(P0.05)。加入自噬抑制剂CQ后肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中的存活率与未加CQ比较显著下降(P0.05)。结论缺血缺氧可以抑制肝卵圆细胞增殖,并且可诱导肝卵圆细胞自噬;自噬有利于肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中稳定细胞内环境,维持细胞的存活。     

肝脏胞外基质成分参与卵圆细胞介导的肝再生

目的 探讨肝再生中肝脏胞外基质成分与卵圆细胞的相互关系及作用.方法 采用免疫组化及免疫荧光双标的方法动态观察大鼠卵圆细胞增殖模型中肝脏胞外基质成分(层粘连蛋白和纤维连接蛋白)的定位及与卵圆细胞的关系. 结果 肝部分切除后第2天,卵圆细胞开始向门静脉周围区域增殖.层粘连蛋白主要出现在门静脉周围的肝窦状隙内,纤维连接蛋白在整个肝小叶内表达显著增加.术后第4～9天,卵圆细胞进一步向肝实质内增殖,门静脉周围纤维连接蛋白表达增加,中央静脉周围表达减少.层粘连蛋白及纤维连接蛋白与卵圆细胞关系紧密.术后第12～15天,随着卵圆细胞分化为小肝细胞结节,大多数层粘连蛋白及纤维连接蛋白位于结节周边,少数出现在结节内.第18天以后,正常的肝小叶结构开始恢复.结论 卵圆细胞与肝脏胞外基质成分存在紧密联系;局部肝脏微环境可能通过细胞与基质之间的相互作用在卵圆细胞介导的肝再生中发挥重要的调控作用.     

大鼠肝卵圆细胞与肝星状细胞在2-AAF/PH模型中的增殖及关系研究

目的 研究大鼠肝卵圆细胞与肝星状细胞增殖过程中关系,探讨肝星状细胞(HSCs)对卵圆细胞增殖分化的调控作用.方法 利用2-乙酰氨基芴/部分肝切除(2-AAF/PH)建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型,对术后不同时间点的肝组织标本进行常规组织学观察,并用卵圆细胞标志物OV-6和HSCs激活标志物desmin进行免疫组化染色和免疫荧光双标,对阳性细胞进行半定量计数并分析两者相关性.结果 PH后第2天,门静脉区域开始出现小管样结构的卵圆细胞和HSCs增殖;PH后第4～6天,HSCs形成网格状伴随卵圆细胞迅速增殖,向肝实质内侵入;PH后第9天,HSCs与卵圆细胞增殖达到顶峰;PH后第12～15天,出现新生小肝细胞结节及小肠样化生,HSCs随卵圆细胞显著减少,位于小肝细胞结节周围,结节内有少量HSCs;PH后第18～21天,HSCs与卵圆细胞进一步减少或消失.直线相关分析表明两者高度相关.结论 HSCs参与了肝卵圆细胞介导的肝再生,可能通过产生多种生长因子以及重塑胞外基质对卵圆细胞的增殖分化具有重要的调控作用.     

端粒酶在大鼠肝卵圆细胞中表达的意义

目的 检测大鼠肝卵圆细胞端粒酶活性,探讨端粒酶表达与卵圆细胞增殖分化的关系.方法 采用2-AAF/PH模型诱导大鼠卵圆细胞增殖,改良的胶原酶灌注结合密度梯度离心法分离,用细胞免疫荧光和电镜鉴定卵圆细胞.采用免疫组织化学、RT-PCR、荧光定量PCR等方法检测卵圆细胞端粒酶的表达,组间比较采用t检验分析其意义.结果 采用2-AAF/PH模型成功诱导大鼠卵圆细胞增殖.分离的卵圆细胞核大,卵圆形,胞质少,呈铺路石样生长.电镜发现细胞核质比大,胞质内细胞器少且发育不成熟.细胞免疫荧光结果表达OV-6、AFP、CK-19、albumin、c-kit.端粒酶逆转录酶(TERT)表达在门静脉周围增殖的卵圆细胞核内,随着卵圆细胞逐渐向肝细胞方向分化,TERT阳性细胞数逐渐减少.大鼠正常肝组织TERT mRNA表达水平最高,为LE-6卵圆细胞的2.27倍;分离的卵圆细胞TERT mRNA表达水平为LE.6卵圆细胞的1.26倍;采用2μg和4μg细胞提取物分析细胞的端粒酶活性,随着LE-6卵圆细胞传代次数的增加,由24代传至40代,端粒酶活性由△A=1.05、1.15降低到△A=0.25、0.45(t=17.74,12.38,P<0.05).结论 卵圆细胞具有端粒酶活性,端粒酶可能是卵圆细胞维持其增殖能力和多分化潜能的一个必要条件.     

大鼠肝卵圆细胞的分离与鉴定

目的：分离、培养和鉴定大鼠卵圆细胞。方法：以3'-me-DAB刺激卵圆细胞迅速增生,改良梯度离心法分离、培养大鼠卵圆细胞,观察其形态及增值特点并进行细胞免疫组织化学鉴定。结果：改良的梯度离心的方法能够有效地分离大鼠肝卵圆细胞,卵圆细胞胞体为卵圆形,代谢缓慢,具有干细胞的特点,可以形成集落,并且表达OV6、CD34及Nestin。结论：改良梯度离心法分离的细胞具有干细胞的特点,可以表达卵圆细胞特异性的表面标记OV6、造血干细胞表面标记CD34和神经中间丝蛋白Nestin,具有横向分化的可塑性,为进一步实验研究提供参考依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学特性研究

目的 探讨体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,并研究其生物学特性.方法 取大鼠股骨和胫骨,以Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,MTT法测定细胞的生长曲线,流式细胞仪细胞表面抗原.结果 原代分离的BMSCs,培养48 h开始贴壁,胞体由圆形变为椭圆形、多角形或短梭型;培养第12天,见胞体渐变为长梭型,并达90%单层融合;经传代扩增,细胞进一步纯化.7代以前,细胞在2 d内处于潜伏期,第3天进入对数生长期,第7天进入平台期;10代后增殖速度变慢;流式细胞仪鉴定BMSCs表而抗原,CD44、CD90、CD34阳性率分别为99.62%、95.13%、2.06%.结论 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法有效分离纯化大鼠BMSCs,且细胞生长稳定,增值能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性.     

乙型肝炎病毒X基因诱导卵圆细胞恶性转化的研究

目的 研究乙型肝炎病毒X(HBx)基因对卵圆细胞转化和分化的影响.方法 用稳定表达HBx的转基因即圆细胞株pEGFP-HBx卵圆细胞作为实验组,pEGFP卵圆细胞及LE/6卵圆细胞作为对照组,运用倒置相差显微镜和透射电镜、流式细胞术、糖原染色、软琼脂生长、实时定量PCR、细胞免疫化学技术观察和检测pEGFP-HBx卵圆细胞在细胞形态、细胞周期、分化标志物、癌基因c-myc及TGF-α的变化.结果 (1)与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞体积增大,核具有明显异型性;(2)流式细胞仪检测显示,与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞G0/G1期细胞百分比下降,S期和G2/M期细胞百分比明显升高,而且非整倍体细胞明显增多;(3)糖原染色显示,pEGFP-HBx卵圆细胞胞质内可见大量糖原颗粒;(4)软琼脂中可见pEGFP-HBx卵圆细胞克隆形成;(5)癌基因c-myc及TGF-α表达量明显增高,卵圆细胞分化指标HNF-4α、AFP表达上升,CK-7、CK-19表达下降,未见有cps1 mRNA表达.结论 HBx基因可以引起卵圆细胞异常分化,并直接诱导卵圆细胞发生恶性转化.     

The role of oval cells in rat hepatocyte transplantation

BACKGROUND: Oval cells are liver cells capable of differentiating into either hepatocytes or biliary epithelial cells. We compared growth of hepatocytes and biliary epithelial cells between spleens transplanted with oval cell-free and oval cell-enriched rat liver cells. METHODS: Oval cell-enriched liver cells were obtained from livers of adult rats that had undergone treatment with acetylaminofluorene and partial hepatectomy, although oval cell-free liver cells were obtained from livers of untreated rats. Hepatocyte and biliary epithelial cell growth in the spleen was evaluated by counting periodic acid-Schiff-positive cells and cytokeratin 19-positive cells respectively in sections from transplanted spleens. RESULTS: Spleens transplanted with oval cell-free liver cells and spleens transplanted with oval cell-enriched liver cells contained similar numbers of hepatocytes after 2 weeks. Numbers of hepatocytes in spleens transplanted with oval cell-free liver cells decreased markedly at 4 and 8 weeks, then increasing slightly until 32 weeks. In spleens transplanted with oval cell-enriched liver cells, numbers of hepatocytes decreased only slightly at 4 weeks and then increased markedly. At 4, 8, 12, 16, 24, and 32 weeks, numbers of hepatocytes in spleens transplanted with oval cell-enriched liver cells respectively were 2.3, 3.5, 4.5, 6.7, 6.3, and 15.1 times hepatocyte numbers in spleens transplanted with oval cell-free liver cells. Numbers of biliary epithelial cells in spleens receiving oval cell-enriched liver cells showed changes similar to those in spleens transplanted with oval cell-free liver cells, increasing markedly at 4 weeks and then markedly and rapidly decreasing. CONCLUSIONS: Intrasplenic transplantation of oval cell-enriched liver cells enhanced growth of hepatocytes compared with transplantation of oval cell-free liver cells; this was not true for biliary epithelial cells.     

人诱导性多能干细胞的无饲养层培养及鉴定

目的：探索人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）的无饲养层培养方法,并对此方法培养的iPSCs进行鉴定。方法将人iPSCs接种于玻璃粘连蛋白（Vitronectin XF）包被的培养皿上培养,采用EDTA消化传代。倒置显微镜下观察iPSCs的生长状态;碱性磷酸酶（ALP）染色鉴定;采用PCR和免疫荧光检测iPSCs多能性基因SSEA?1、Nanog、Sox2的表达情况。结果倒置显微镜下可见iPSCs呈典型的克隆状生长,克隆呈圆形或椭圆形,边界清晰、整齐;ALP染色结果阳性;PCR结果显示人iPSCs强表达多能性基因SSEA?1、Nanog、Sox2;免疫荧光结果显示多能干细胞特异性指标SSEA?1、Nanog、Sox2均呈阳性。结论无饲养层培养体系培养人iPSCs,细胞能稳定增殖,保持自我更新潜能及多能性。     

肝卵圆细胞对大鼠肝硬化组织TGFβ/smad信号传导的影响

【摘要】〓目的〓探讨肝卵圆细胞对TGFβ/smad信号传导通路影响的机制,并证明肝卵圆细胞对肝硬化的发展是否有阻止和逆转的作用。方法〓对肝卵圆细胞进行增殖、分离、培养后,移植于肝硬化大鼠肝脏组织,以未经移植的大鼠做对照,分别进行组织病理学和肝功能及蛋白表达水平的检测,分析ALB、AST、ALT、TGFβ1、TGFβRⅡ、Smad2、Smad4 、Smad7的情况。结果〓移植肝卵圆细胞的鼠肝硬化组织纤维化减少,肝功能明显改善(P<0.05),肝硬化组织TGFβ/smad信号通路中各蛋白表达量有差异。结论〓肝卵圆细胞刺激肝硬化细胞后TGFβ/smad信号通路中各蛋白的表达是不同的,肝卵圆细胞对肝硬化组织有阻止和逆转的作用。     

HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定

目的 构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒pEGF-HBx,建市稳定、高效表达乙型肝炎病毒x基因(HBx)的大鼠卵圆细胞株,以便进一步研究HBx基因和卵圆细胞在肝癌发牛过程中的作用和机制.方法 用PCR方法从质粒pcDNA3.1-HBx中扩增含Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的HBx基因序列.对增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-NI)及扩增的HBx目的 基因片段进行双酶切,纯化后用连接酶连接得到重组体pEGFP-HBx,将其转化大肠杆菌DHSα,抗生素筛选培养得到阳性克降,提取质粒后用双酶切和基因测序进行鉴定.通过脂质体介导将质粒pEGFP-HBx转染到大鼠卵圆细胞株(LE/6)中,经G418筛选,尤限传代后得到稳定表达EGFP-HBx融合蛋白的细胞株.分别采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞株中HBx基凶的表达情况.结果 双酶切及基因测序结果均显示构建的pEGFP-HBx质粒中含有完整的HBx基因片段.将得到的抗性细胞株培养传代20次后仍表达强的荧光;RT-PCR及免疫细胞化学检测均发现HBx基因在抗性细胞(LE/6)中得到了稳定转录和翻译.结论 已成功构建带HBx基因的真核表达质粒pEGFP-HBx,获得了稳定、高效表达EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圆细胞株,为进一步研究HBx基凶和卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制奠定了实验基础.