Survivin基因siRNA表达载体的构建及其在食管癌EC109细胞中的表达

目的 为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗，构建针对survivin基因的siRNA的表达载体，转染细胞EC109后观察其对survivin基因表达的抑制作用。方法 利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因mRNA的寡核苷酸序列，插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survivin。重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109，western blot检测转柒前后survivin蛋白的表达情况。结果 测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致，证实成功构建了针对survivin基因的siRNA表达载体。Western blot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达。结论 针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建，并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达。     

CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

人血管内皮生长因子mRNA靶向siRNA表达载体的构建和表达

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)mRNA靶向siRNA表达载体,观察其表达情况.方法:设计人VEGF靶向的发夹样siRNA,依据设计,合成2条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneo-GFP载体,转化扩增后得到重组载体pSUPERneo-GFP-siVEGF,进行序列测定.用脂质体转染法将重组载体转染食管癌细胞株Eca109,采用RT-PCR检测转染细胞VEGF mRNA的表达水平. 结果:经过酶切鉴定与测序,pSUPERneo-GFP-siVEGF构建成功.稳定转染该重组体的Eca109细胞VEGF mRNA表达水平明显降低.结论:成功构建了针对VEGF mRNA的siRNA载体, 转染细胞后可显著抑制VEGF mRNA的表达.     

HER4基因siRNA载体的构建及其沉默作用

目的RNA干扰是由双链RNA引发的转录后基因沉默。为了研究表皮生长因子受体对食管癌细胞的作用,文中构建针对人HER4基因的小干扰RNA（siRNA）及其表达载体,转染人食管癌细胞Eca-109,观察其基因沉默效果,探索食管癌基因治疗的新途径。方法根据siRNA设计原则,设计针对HER4基因的两条寡核苷酸链,退火后与载体SUPER．neo＋gfp连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染食管癌细胞Eca-109,用荧光定量PCR和Western blot方法检测HERd蛋白表达情况。结果经酶切鉴定和DNA测序分析后,提示HER4靶向RNA干扰重组载体构建成功。转染食管癌细胞后,用荧光定量PCR和Westernblot法检测HER4基因表达水平显著降低。结论成功地构建了针对人HER4基因的siRNA表达载体,并可有效抑制食管癌细胞Eca-109中该基因的表达。     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

RNAi抑制骨肉瘤细胞KDR蛋白表达的研究

目的研究siRNA表达载体对骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白表达的抑制作用。方法构建psuper质粒，化学合成2段编码发卡RNA序列、靶向KDR基因的寡核苷酸，克隆进pSuper的pol Ⅲ HI启动子的下游，重组构建抑制KDR表达的siRNA质粒，并转染入骨肉瘤MG63细胞，Western blot检测转染后KDR基因在蛋白水平表达的变化。结果酶切后电泳鉴定正确的重组质粒小量扩增后测序，证实成功构建了KDR siRNA表达质粒，转染入细胞后，有效抑制了KDR基因在蛋白水平的表达。结论成功构建的siRNA表达载体有效抑制了骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白的表达，为进一步分析骨肉瘤中KDR基因的功能及肿瘤治疗奠定了研究基础。     

siRNA对HepG2细胞survivin表达的抑制作用

目的　研究siRNA对肝癌细胞株HepG2中survivin基因表达的抑制作用。 方法　设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列 ,中间间隔 9个核苷酸序列 ,通过定向克隆至载体PSilencer 2 .1,构建siRNA真核表达载体 ,经稳定转染HepG2细胞后应用RT PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。 结果　测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT PCR及流式细胞术检测 ,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达 73%和 75 %。结论　构建的PSilencer( ) survivin重组质粒能有效抑制survivin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达 ,从而为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。     

Rab25基因siRNA表达载体的构建鉴定及在人卵巢癌细胞A2780中的表达

目的为研究Rab25基因的功能及卵巢癌的基因治疗,构建针对Rab25基因的siRNA表达载体,转染细胞A2780后观察其对Rab25基因表达的抑制作用,为探索卵巢癌基因治疗的新途径打好基础。方法根据基因库上的Rab25mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSUPER质粒中,并对重组质粒(命名为pSUPER/Rab25siRNA)进行酶切及序列鉴定,后转染卵巢癌细胞A2780,RT-PCR检测转染前后Rab25的表达情况。结果双酶切证实Rab25siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。RT-PCR检测显示转染卵巢癌细胞A2780后有效抑制了Rab25基因的表达。结论成功构建Rab25siRNA表达载体,为卵巢癌基因治疗开辟新途径。     

RNA干扰技术抑制EC-109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究

目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对survivin基因的siRNA,抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC-109细胞的凋亡. 方法:构建针对survivin的siRNA表达质粒,转染至EC-109细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点收集转染细胞,利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒,观察siRNA抑制survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况. 结果:荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达46.70%. 半定量RT-PCR检测到pSIREN/S质粒在EC-109细胞内对survivin基因的转录抑制率为74.04%;蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒pSIREN/S的EC-109细胞survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%,而对照质粒pSIREN/CN对survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. 经pSIREN/S转染的EC-109细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder,流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%. 结论:survivin特异性siRNA可明显抑制survivin基因的转录和表达,并能有效地诱导EC-109细胞的凋亡,为下一步在体内利用pSIREN/S重组质粒沉寂survivin基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础.     

Induction of apoptosis of human colon cancer cells by siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene

This study constructed siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene and observe the apoptosis induction effect of it in human colon cancer cells, siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed and transfected into human colon cancer cells. The effect of siRNA recombinant expression vector was detected by RT-PCR, Western blot, MTT reduction assay and flow cytometry. It was confirmed by restriction endonuclease and sequence analysis that siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed successfully. Inhibition rate of survivin siRNA at mRNA and protein levels was 36.33% and 44.65% respectively. Growth of cancer cells was inhibited and the apoptosis rate was （17.24±2.13）%. The siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene has been constructed successfully. It not only can inhibit the expression of survivin gene, but also can induce apoptosis in human colon cancer cells remarkably.     

Fas基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。     

siRNA干扰survivin表达对腺样囊性癌细胞株ACC-M的抑制作用

目的探讨靶向survivin基因RNAi对腺样囊性癌增殖的抑制效应。方法设计、合成siRNA(small interfering RNA),构建表达载体pGenesil-shRNA-survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-M细胞株。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western-blot法分别检测转染后的ACC-M细胞中survivin mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法来检测细胞的增殖。结果测序证实表达载体构建成功,在pGenesil-shRNA-survivin的ACC-M细胞株中,survivin mRNA及蛋白表达明显降低,ACC-M细胞增殖受到抑制。结论pGenesil-shRNA-survivin重组质粒能有效抑制腺样囊性癌细胞增殖。     

Western blotting检测survivin封闭载体转染大肠癌SW620细胞的实验研究

【目的】探讨KNA interferenece（RNAi）对survivin在大肠癌细胞SW620表达的影响及siRNA干扰后诱导survivin蛋白表达降低的机制。【方法】构建survivin特异性的RNA封闭性载体survivin，通过培养大肠癌细胞SW620，survivin封闭性载体转染SW620细胞；Hoechest染色大肠癌细胞，通过荧光显微镜观察细胞形态变化；Western blotting分析肿瘤细胞的蛋白表达情况。【结果】DNA测序证实表达质粒构建成功；免疫荧光显微镜可见细胞凋亡小体；Western blotting显示：大肠癌survivin的蛋白表达明显弱于对照组。【结论】Survivin与大肠癌的发生存在一定的关系，RNAi能够下调survivin的表达。     

RNA干扰抑制Survivin表达对人喉癌细胞药物敏感性的影响

目的:探讨RNA干扰技术抑制Survivin基因表达对增强人喉癌HEP-2细胞化疗药物敏感性。方法:针对Survivin mRNA序列设计合成小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pRNAT-Survivin重组表达载体,转染人喉癌HEP-2细胞;通过RT-PCR和Western blot分析其对HEP-2细胞内源性Survivin表达的影响;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察HEP-2细胞对化疗药物5-FU和优福定敏感性的改变。结果:成功构建pRNAT-Survivin重组质粒,并成功转染HEP-2细胞;RT-PCR和Western blot结果证实重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制Survivin基因表达(P<0.01);MTT及流式细胞仪结果证明在5-FU和优福定联合作用下,pRNAT-Survivin组HEP-2细胞的生长抑制率明显增高(P<0.01)。结论:pRNAT-Survivin可抑制Survivin在人喉癌HEP-2细胞中的表达,并增强HEP-2细胞对化疗药物敏感性。     

NF-κB基因RNA干扰载体的构建

目的:构建核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)基因的RNA干扰载体,观察其抑制NF-κB蛋白的效率.方法:分别构建大鼠NF-κB基因的pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-NF-κB重组真核表达载体和pSilencer 1.0-U6-siRNA-NF-κB重组载体,用两种重组载体转染COS-7细胞,在荧光倒置显微镜下观察大鼠NF-κB-绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western免疫印迹方法检测.结果:荧光倒置显微镜观察及Western免疫印迹检测结果均显示随着pSilencer 1.0-U6-siRNA-NF-κB重组载体浓度的增加,NF-κB-绿色荧光融合蛋白表达量逐渐减少.结论:成功构建NF-κB基因的RNA干扰载体.     

Bmi-1 siRNA对宫颈癌Hela细胞体外增殖能力的影响

[目的]观察siRNA沉默Bmi-1表达对Hela细胞增殖能力的影响。[方法]构建了表达Bmi-1 siRNA的重组真核表达载体,将其转染入Hela细胞,利用荧光法观察转染效率。用RT-PCR及Western blot方法检测转染后细胞Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白的表达情况;用MTT比色法、台盼蓝拒染法检测Bmi-1 siRNA对Hela细胞增殖的抑制作用;用流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期;用平板克隆形成实验检测Bmi-1 siRNA对Hela细胞的单细胞增殖能力的影响;应用免疫细胞化学(SP法)及Western blot法检测各组细胞Ki-67及CyclinD1的表达。[结果]将构建好的重组质粒成功转染进入了Hela细胞中且转染效率在90%左右;Bmi-1 siRNA转染Hela细胞Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白表达沉默,Bmi-1表达沉默后抑制Hela细胞增殖并使细胞周期阻滞于G0-G1期,能明显抑制Hela细胞的单细胞增殖能力;同时Ki-67及CyclinD1的表达均明显下降。[结论]siRNA介导的Bmi-1基因的表达沉默能抑制Hela细胞的增殖能力,Bmi-1表达可能与宫颈癌的发生发展相关。