贵阳腐霉类枯草杆菌蛋白酶(Pr1)的纯化与部分特性研究

目的:纯化灭蚊真菌贵阳腐霉胞外蛋白酶类枯草杆菌蛋白酶,并测定其分子量.方法:培养贵阳腐霉菌丝体,用几丁质诱导,使其产生大量胞外酶,对其产酶条件进行了部分优化.将粗酶液经过脱盐,浓缩进一步纯化,再过Sephadex G-100柱子层析并进行SDS-PAGE,分离类枯草杆菌蛋白酶.结果:(1)以几丁质为唯一碳氮源,在26℃,初始pH值6.0,1%的菌丝接种量为最佳诱导条件;(2)分离得到的类枯草杆菌蛋白酶,并测定其分子量约为33kDa.结论:类枯草杆菌蛋白酶纯化成功,结果较理想,为进一步研究提供依据.     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的分离纯化及酶学性质

采用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Butyl-Sepharose CL 4B疏水层析,从重组大肠杆菌DH5a菌体中分离纯化得到粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA).经纯化,AfPGA纯度较粗酶提高50.6倍、比活达到212.7 U/mg,经HPLC测定纯度为92.8%,收率为78%.理化性质分析表明:AfPGA含有2个亚基(α亚基和β亚基,其Mw分别为2.90×104和5.92×104;AfP-GA等电点约为7.9～8.0,最适pH约为10.0,并在pH>7.0时表现出了稳定的催化活力.     

福寿螺纤溶酶的分离纯化及其性质研究

目的:建立一种高效的福寿螺纤溶酶(ACFE)分离纯化技术,并研究其理化性质.方法:福寿螺经组织匀浆、缓冲液抽提与选择性热变性,再经大豆胰蛋白酶抑制剂耦联的Sepharose 4B亲和层析、DEAE-Sephacel离子交换层析与羟基磷灰石亲和层析.结果:分离纯化得到一种均一的ACFE成分,其分子量为32 kD,pI为3.6,最适pH在9.5～11.0之间,该酶热稳定性强,能抗4 mol/L脲处理;其具有水解合成底物S-2288和Chromozym P的活性,活性受Zn2 、Cu2 等抑制,受对氨基磺酸氟(PMSF)抑制,但不受对羟甲基苯磺酸(PHMB)影响.结论:首次从福寿螺体内分离纯化得到ACFE.     

角质细胞生长因子2的优化表达及纯化研究

目的优化工程菌的表达,比较肝素亲和层析、离子交换层析两种方法的角质细胞生长因子2（keratinocyte growthfactor,KGF-2）的纯化产量及纯度,以获取高效的提纯工艺。方法工程菌分别进行生长密度和诱导时间的实验,并将细茵裂解液上两种层析柱进行分步洗脱,收集目标蛋白,进行电泳分析。结果获得高表达KGF-2工程菌,表达率为29％;用两种层析方法获得电泳纯KGF-2。结论 离子交换层析在纯化过程中具有一定优势。     

孕血清中早孕因子的分离纯化

目的:通过离子交换层析和亲和层析的分离方法从孕血清中得到纯化的早孕因子(EPF),为进一步制备单克隆抗体做准备。方法:采用依次经过DEAE52阴离子交换层析,SP Sepharose F.F阳离子交换层析,Con ASepharose4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl6B亲和层析分离纯化方案,最终得到具有早孕因子活性的Hepa-rin-Ⅱ成分,早孕因子活性采用活性玫瑰花环抑制实验检测,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化物。结果:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两条带,相对分子量分别为46.30kDa和10.71kDa。结论:经过四步层析得到较纯的EPF样品,并认为EPF在血清中可以以单体和多聚体形式存在。     

对一种源于蜗牛的壳聚糖水解酶的不同纯化方法的选择

目的研究源于蜗牛的壳聚糖水解酶的纯化方法，得到壳聚糖水解酶的纯品，从而为氨基酸序列分析、基因克隆及工业菌制备奠定前期基础。方法对比疏水作用层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱（HA）层析、凝胶过滤层析等方法纯化蜗牛酶的实际效果，确定纯化的最佳条件，从而设计出最合理的纯化方案。结果分别用苯基琼脂糖柱层析，DEAE—Sepharose离子交换层析，羟基磷灰石柱层析，Sephacryl S-300凝胶过滤层析分离蜗牛酶，最终确定为用弱阴离子交换填料DEAD—Sepharose，疏水作用层析，凝胶过滤层析进行分离。结论本文探讨了蜗牛酶的不同纯化方法，建立了一种从蜗牛酶中分离高效高纯度壳聚糖水解酶的方法，为壳寡糖的酶解工业生产提供了新方法。     

双水相萃取与疏水层析分离基因工程人溶菌酶

采用双水相萃取与疏水层析分离纯化重组巴氏毕赤酵母表达的基因工程人溶菌酶.通过正交实验方法研究了聚合物浓度、盐浓度和pH对双水相体系萃取人溶菌酶过程的影响.结果表明:当双水相萃取的pH为4,硫酸钠、氯化钠、PEG4000的质量浓度为0.13、0.06和0.08时,人溶菌酶上相回收率达98.8%,纯化因子18.0,浓缩因子3.6.双水相萃取后选用高效疏水层析色谱纯化人溶菌酶,经苯基高取代基介质疏水层析后得到纯化因子为22.7,收率为88.4%的人溶菌酶纯化产品,电泳纯度检测为100%.     

用Streamline SP从大肠杆菌中初步分离纯化anti-HBsAg Fab最适吸附条件的选择及验证

目的 选择阳离子交换介质Streamline SP分离纯化anti-HBsAgFab的最适吸附条件。方法试管法分别测定平衡缓冲液在不同DH和不同离子强度下,阳离子交换介质Streamline SP对预分离纯化蛋白的吸附效果。用l mlSP预装柱及自装28 ml Streamline SP柱进行离子交换层析以验证吸附效果。结果NaAc-HAc作为平衡缓冲液在pH4．4、离子强度100-600mmlo/L可以使阳离子交换介质Streamline SP与蛋白吸附达到最佳效果。在该条件下用l ml SP预装柱及自装28ml SP柱进行离子交换层析,均验证了这一吸附效果。结论试管法选择的离子交换层析的最适吸附条件用于从大肠杆菌中初步分离纯化anti-HbsAg Fab切实可行。     

贵阳腐霉类胰蛋白酶纯化的初步研究

目的对贵阳腐霉(Pythium guiyangense)类胰蛋白酶(trypsin-like protease,Pr2)进行初步的分离、纯化。方法将该菌诱导24h后获得的粗酶液,经过PEG20000的包埋浓缩、透析,和两次SephadexG-100凝胶层析后,进行SDS-PAGE电泳检测和分子量测定。结果纯化的Pr2蛋白酶经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示为单一条带,分子量为31.5kDa。结论本研究初步纯化了贵阳腐霉Pr2蛋白酶,测得分子量为31.5kDa,为针对贵阳腐霉Pr2蛋白酶的进一步研究有重要意义。     

重组血红蛋白的原核表达、纯化和鉴定

目的利用大肠杆菌表达载体,表达血红蛋白(Hb)基因,并进行纯化及鉴定。方法将原核表达载体pHE 2-Hb转化入E.Coli JM109,经IPTG诱导表达;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,用Western blot鉴定纯化出的目的蛋白。结果 SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量约为67 kD,与理论值相一致;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,Western blot检测表明得到纯度较高的目的蛋白。结论利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究Hb的生物传氧机制研究和以Hb为基础载氧药物的研究提供重要基础和研究依据,并将为血液替代品和相关疾病的治疗研究奠定研究基础。     

青霉素酰化酶研究——Ⅰ.抑制作用,纯化和性质

丙酮、乙醇和苯丙氨酸是大肠杆菌青霉素酰化酶的竞争性抑制剂,分别抑制模拟底物3-苯乙酰胺基6-硝基苯甲酸水解的活力。青霉素酰化酶粗酶液经硫酸铵盐析,pH5沉淀,SE-Sephadex C50层析,苯丙氨酸-Sepharose 4B疏水层析和DEAE-Sephadex A25层析可得纯酶,聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳呈现一条带,比活为27.5u/mg蛋白。纯化总活力回收率为28.1%。青霉素酰化酶分子量约为90000,有两个亚基,分子量分别为70000和20000,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,催化青霉素G水解的米氏常数为2.94mmol/L。     

牛凝血酶的分离纯化

目的:以牛血为原料对凝血酶进行分离纯化.方法:采用DEAE离子交换纤维素柱层析和SephadexG-200分子筛层析从牛血浆中纯化得到牛凝血酶.结果:所得凝血酶制品比活为39.8U/mg蛋白,活性回收率为34.3%,纯化倍数为7.6.结论:与传统方法相比,本实验方法得到的凝血酶保持了较高的活力和回收率,具有方法简便、效果较好的特点.     

蚯蚓脱氧核糖核酸酶纯化及酶学性质

目的:从蚯蚓组织中纯化得到一种脱氧核糖核酸酶(取名为蚯蚓脱氧核糖核酸酶,简称EDNase)并研究其酶学性质.方法:采用丙酮沉淀、离子交换层析、高效液相层析、SDS-PAGE电泳,毛细管等点聚焦电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等方法.结果:经证实这种纯化方案的纯化倍数是137,酶得率为45.6%.EDNase的相对分子质量约为63 000.Mg2+,Mn2+和ca2+对酶活性有较强的抑制作用,而Na+则轻微的提高酶的活性.在pH 4.4～5.2的范围内EDNase酶活性稳定,其最适pH值为4.8.该酶的最适温度为37℃,在40℃范围内酶具有较高的稳定性.EDNase的等电点为6.20.在以小牛胸腺DNA为底物的条件下,酶的Km为1.52 g/L,Vmax为4.89 mg/(mL·min).该酶可有效降解超螺旋质粒DNA,线状λ-噬菌体DNA和细菌染色体DNA,对RNA未见任何降解作用.结论:这种酶具有独特的酶学性质,不同于以往所知的脱氧核糖核酸酶.     

生物素标记法分析MCF-10A细胞质膜蛋白质

 目的 优化细胞膜蛋白分离纯化技术,以期实现快速、高效分析细胞膜蛋白质。方法 本文以乳腺细胞系MCF-10A为模型,用sulfo-NHS-LC-biotin标记完整的活细胞,使细胞表面蛋白生物素化,细胞裂解后利用链亲和素对膜蛋白进行分离富集,再洗脱膜蛋白,达到分离纯化的目的。利用液相层析偶合串联质谱技术（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）鉴定提取得到MCF 10A膜蛋白。结果 sulfo-NHS-LC-biotin浓度为0.2 mg/mL时得到的标记纯化膜蛋白最多,可作为标记最适浓度。利用这种方法鉴定出256个蛋白质,生物信息学分析表明其中膜蛋白占63%,比传统膜蛋白分离纯化方法得到的结果好。结论 这种方法省去常规分离膜蛋白时所需的超速离心,具有操作简单、可行性高、平行性高的特点,有望用于规模化肿瘤膜蛋白的差异比较,为肿瘤早期诊断及治疗提供新的靶标。     

一种新的沙蚕纤溶酶的纯化、活性鉴定及部分分子特性

目的：从沙蚕Nereis virens的体腔液中纯化、鉴定出一种新的纤溶酶,并对其进行分子表征。方法：运用离子交换层析、凝胶过滤层析等常规色谱方法纯化蛋白酶,采用纤维蛋白板检测法鉴定纤溶活性及活性分布曲线,利用2D-电泳方法检测此纤溶酶的表观分子量和等电点,并检测多种蛋白酶抑制剂对其酶活性的影响,以确定此蛋白酶的类型。结果: 获取一种新的具有极强纤维蛋白水解活性的单链蛋白酶,其相对分子质量为29000,等电点为4.5,其蛋白水解活性在pH7.8和45℃时表现为最高,并能被二异丙基氟磷酸（DFP）和甲苯磺酚氟（PMSF）完全性抑制,确证其为一种典型的丝氨酸内肽酶。结论：Nereis virens的体腔液中存在一种纤溶活性极强的单链丝氨酸内肽酶,该纤溶酶对预防和治疗血栓性疾病具有一定的药用价值。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的纯化及生物学活性鉴定

目的：纯化rLTB并对其生物学功能进行初步研究。方法：重组基因工程菌发酵后，以包涵体形式表达的rLTB经过洗涤、变性溶解后，分别采用Q　Sepharose^TM High Performance阴离子交换层析和Phenyl FF(high sub）疏水层析对其进行纯化并透析复性，然后采用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，并选用ELISA、动物实验和Western-blotting实验对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果：得到纯度达97．85％的rLTB,复性的rLTB经检测具有良好的生物学活性。结论：得到纯度较高、生物学活性较好的rLTB，可用于进一步的研究。     

孕妇血清中早孕因子的分离与纯化

目的：建立一条从妊娠早期妇女血清中分离纯化早孕因子的技术路线，获得高纯度的早孕因子。方法：采用依次经过DEAE 52阴离子交换层析、SP Sepharose F．F阳离子交换层析、ConA Sepharose 4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl-6B亲和层析分离纯化的方案，最终得到具有早孕因子活性的Heparin-Ⅱ成分，早孕因子活性采用活性玫瑰花环抑制实验检测。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化物。结果：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有一条电泳区带，相对分子量为10．91kDa。结论：这条分离纯化早孕因子的技术路线是可行的，得到的相对分子量为10．91kDa的蛋白质为电泳纯的早孕因子。     

DHCC受体的纯化

本文报告了正常雄性家兔小肠粘膜细胞核提取液,经 38％饱和废硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析、DNA-纤维素层析、羟基磷灰石层析、Sephadex G—200凝胶过滤,最终得到纯化5200倍的DHCC受体40μg,产率为9％。     

人肝癌组织特异性γ-谷氨酰转移酶分离纯化

目的:分离纯化人肝癌组织中特异性γ-谷氨酰转移酶(GGT),为进一步制备其抗血清提供抗原材料,以便对肝癌早期诊断进行研究。方法:人肝癌组织经匀浆、离心、溶解、透析、凝胶层析及凝集素亲和层析等步骤进行分离纯化;纯化过程用IFCC推荐方法监测GGT催化活性,紫外法监测蛋白质出峰图谱,Lowry法测定蛋白含量。结果:经过粗提、DEAE阴离子交换层析、凝胶过滤层析及凝集素亲和层析等纯化步骤得到电泳纯的GGT,其比活为10.58U/mg蛋白,纯化倍数为84.9,得率为1.60%。结论:该方法能够较好地分离纯化人肝癌组织中特异性GGT。     

两种偶联剂对胎盘型碱性磷酸酶层析行为的比较

本文分别选用两种偶联剂溴化氰和环氧氯丙烷活化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，以Ｌ－苯丙氨酸（Ｌ－ｐｈｅ）为配基合成亲和吸附剂纯化胎盘型性磷酸酶，并对二者层析行为进行比较。实验证明；用环氧氯丙烷活化合成的Ｌ－ｐｈｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ仅一次亲和柱层析就可得到用溴化氰两次亲和层析相近的结果，用环氧氯丙烷活化方法即简单又安全。