青霉素酰化酶研究——Ⅰ.抑制作用,纯化和性质

丙酮、乙醇和苯丙氨酸是大肠杆菌青霉素酰化酶的竞争性抑制剂,分别抑制模拟底物3-苯乙酰胺基6-硝基苯甲酸水解的活力。青霉素酰化酶粗酶液经硫酸铵盐析,pH5沉淀,SE-Sephadex C50层析,苯丙氨酸-Sepharose 4B疏水层析和DEAE-Sephadex A25层析可得纯酶,聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳呈现一条带,比活为27.5u/mg蛋白。纯化总活力回收率为28.1%。青霉素酰化酶分子量约为90000,有两个亚基,分子量分别为70000和20000,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,催化青霉素G水解的米氏常数为2.94mmol/L。     

人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的纯化

目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型主要衣壳蛋白 L 1的纯化方法。方法 :分别利用亲和层析和离子交换层析对重组融合蛋白 p ET30 a- 6× His- L 1进行了纯化。结果 :以包涵体形式表达的重组蛋白在变性条件下经 Ni- NTA Agarose、Q- Sepharose FF纯化 ,透析复性后均获得较高纯度 ,回收率分别为 30 %和2 9%。结论 :亲和层析和离子交换层析都是纯化重组 L 1蛋白的适宜方法 ,二者纯化效率相当。     

重组人干扰素α2b表达与分离纯化研究

目的从湿菌体中分离纯化重组人干扰素α2b。方法采用(NH4)2SO4盐析-H3PO4处理-CM32离子交换层析-DE52离子交换层析-Sephadex G100凝胶层析等非亲和层析纯化方法。结果回收率约为30%,HPLC检验纯度达96%,每毫克蛋白比活力达1.66×108IU。结论分离纯化系统令人满意,回收率较高。     

hIL-3突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :将天然型hIL 3蛋白经定点突变为hIL 3突变体蛋白 ,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法 :超声破碎细菌得到包涵体 ,经DEAEFastFlow,SephaecrylS 200HR等层析步骤纯化。结果 :经以上一系列纯化 ,得到的人IL 3突变体蛋白纯度达90 % ,比活性为7.3×104 U/ml ,总回收率为100 %。结论 :突变体hIL 3在大肠杆菌中得到高效表达 ,并获得高纯度、高活性的hIL 3蛋白。     

双水相萃取与疏水层析分离基因工程人溶菌酶

采用双水相萃取与疏水层析分离纯化重组巴氏毕赤酵母表达的基因工程人溶菌酶.通过正交实验方法研究了聚合物浓度、盐浓度和pH对双水相体系萃取人溶菌酶过程的影响.结果表明:当双水相萃取的pH为4,硫酸钠、氯化钠、PEG4000的质量浓度为0.13、0.06和0.08时,人溶菌酶上相回收率达98.8%,纯化因子18.0,浓缩因子3.6.双水相萃取后选用高效疏水层析色谱纯化人溶菌酶,经苯基高取代基介质疏水层析后得到纯化因子为22.7,收率为88.4%的人溶菌酶纯化产品,电泳纯度检测为100%.     

重组人IL-31蛋白纯化方法的比较研究

目的 比较两种方法纯化rhIL-31的效果.方法 将含pET32a/rhIL-31的重组菌E.coil.BL21(DE3)经IPTG诱导表达,通过超声波破碎,包涵体的提取溶解,分别经G75凝胶层析和镍琼脂糖凝胶FF层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE对纯化结果进行比较分析.结果 镍琼脂糖凝胶FF层析法的杂蛋白去除率高于凝胶层析法,所得蛋白纯度略高.结论 比较重组人IL-31蛋白的纯化效果,镍琼脂糖凝胶FF层析的效果比G75凝胶层析的效果好.     

鹅绒藤全植株中巯基蛋白酶的提取、纯化及部分性质研究

为了从鹅绒藤(Cynanchum chinese R.Br.)全植株中提取、纯化巯基蛋白酶并进行部分性质研究,采集全植株,粉碎后用盐析、凝胶层析、离子交换层析方法纯化蛋白酶。结果,得到两种活性蛋白,其中一种经SDS-PAGE鉴定为均一条带,分子质量15.8KD;作用最适pH 7.0,最适温度50℃。对Hb A-β链水解的Km值为1.23×10-6mol/L。巯基酶抑制剂、保护剂实验提示该酶为巯基蛋白酶。结论,实验流程简洁可行,提纯得到的蛋白酶纯度较高、得率中等。     

结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆及表达

目的构建在大肠杆菌中高效表达结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶(ICL)的重组质粒,实现ICL在原核表达系统的高效稳定表达.方法采用PCR和克隆技术构建含有结核杆菌H37Rv ICL基因的表达质粒pET30(a)-Rv0467,转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达.目的蛋白经金属螯合层析纯化后,对其活性进行初步研究.结果构建了高效表达结核杆菌H37Rv ICL的质粒;在E.coli BL21(DE3)中得到高效表达,目的蛋白占总蛋白含量的30%;表达产物以可溶性形式存在,通过金属螯合层析纯化,所得酶的纯度为90%;目的蛋白具有ICL的活性.结论利用原核表达系统成功克隆表达了结核杆菌H37Rv的ICL,为以ICL为靶点建立新型抗结核药物奠定了基础.     

hTNFα寡聚组氨酸融合蛋白的表达

目的　利用大肠杆菌表达系统对人肿瘤坏死因子(hTNFα)的寡聚组氨酸(6×His)融合蛋白进行表达和纯化研究。方法　采用大肠杆菌表达系统的表达载体pET-28a(+)和pET-22b(+)表达了hTNFα的6×His融合蛋白,其6×His分别位于融合蛋白的N和C端,并利用寡聚组氨酸与过渡态金属离子的高亲和力性质,经Ni2+-IDASepharose6B亲和柱对表达产物进行了纯化。结果　其表达量分别为菌体总蛋白的45%和8%。前者在胞内以不溶性包涵体存在,未对表达产物作进一步纯化;后者在胞质空间以可溶性存在,经亲和纯化的hTNFα-6×His纯度可达90%以上,得率为0.4mg/100ml,并对L929细胞具有杀伤的功能,其活力为5.42×104U/mg。结论　表达产物经纯化后具有细胞毒的活性。     

人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化

①目的分离纯化人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）。②方法应用正丁醇抽提、丙酮沉淀、热处理、ＤＥＡＥ－纤维素和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０柱层析，从人类胎盘中提纯ＰＬＡＰ；聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）和高压液相层析（ＨＰＬＣ）鉴定其纯度；十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳测其亚基分子量。③结果ＰＬＡＰ的纯化倍数为１６１倍，比活力为１３８ｍｍｏｌ·ｓ－１／ｇ；纯化的ＰＬＡＰ经ＰＡＧＥ鉴定为单一区带，ＨＰＬＣ分析为单一对称峰；测得酶的亚基分子量为６４．６９ｋｕ．④结论纯化的ＰＬＡＰ已达电泳纯和层析纯，可用于其结构与功能的研究