活血补肾中药对培养成骨细胞VEGF活性的影响

目的：研究活血补肾中药丹仙康骨胶囊对体外培养成骨细胞VEGF活性的影响，进一步探讨丹仙康骨胶囊抗骨坏死的作用机制。方法：应用RT-PCR及流式细胞仪检测观察不同剂量丹仙康骨胶囊对成骨细胞VEGF mRNA的表达与VEGF的生成的影响。结果：丹仙康骨胶囊可以促进成骨细胞VEGF mRNA的表达与VEGF的生成，并呈剂量依赖性。结论：丹仙康骨胶囊促进成骨细胞VEGF mRNA的表达与VEGF的生成可能是其抗骨坏死的作用机制之一。     

缺氧对成人成骨细胞增殖及分化的影响

目的:在缺氧条件下体外培养成人成骨细胞,探讨缺氧对成骨细胞增殖及分化的影响。方法:将手术中取得的成人髂骨骨块,使用酶消化法进行培养,当细胞传至第2代时,建立成骨细胞缺氧模型,用MTT法观察各组成骨细胞增殖活力的变化;用骨钙素放射免疫法分别检测各组骨钙素含量;用激光共聚焦显微镜对两组培养前3 d细胞血管内皮生长因子(VEGF)光密度值作定量分析。结果:正常组细胞增殖活力较缺氧组强;缺氧组细胞VEGF的光密度值及骨钙素含量均高于正常组。结论:缺氧抑制成骨细胞增殖,缺氧(1~3 d)诱导成人成骨细胞VEGF的高表达并促进成骨细胞的分化。     

TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞增殖和分化影响的实验研究

目的：研究TGF-β对成骨细胞增殖和分化的影响。方法：利用已建立的胎兔颅骨成骨样细胞体外模型，采用MTT法、流式细胞仪检测、骨钙素、胶原和钙含量测定来分析不同浓度的TGF-β对成骨样细胞增殖和分化的影响。结果：低浓度TGF-β（0.010.1ng/ml）促进成骨样细胞增殖，使S期细胞增加，但高浓度TGF-β（110ng/ml）抑制成骨样细胞的增殖。在TGF-β0.01-1ng/ml范围内，与对照组相比，TGF-β各治疗组的骨钙素、胶原和钙含量明显增加，并随TGF-β浓度增加而增加，到TGF-β10ng/ml时，增加不再明显。结论：TGF-β对成骨细胞的增殖表现为双相作用，低浓度促进，高浓度时抑制，可明显促进成骨细胞的分化，并呈一定的量效关系，其有效剂量为0.011ng/ml。     

酒精对骨髓基质细胞增殖及分化的影响

目的 观察酒精对骨髓基质细胞增殖及分化的作用．探讨骨质疏松的病理学机理。方法 以0.09mol/L酒精加入骨髓基质细胞培养物中，测定增殖的骨髓基质细胞数及培养液中骨钙素含量。通过苏丹Ⅲ脂肪细胞染色计数观察酒精作用时间对脂肪细胞分化的影响。结果 实验组骨髓基质细胞数及培养液中骨钙素含量明显低于对照组，脂肪细胞的数量随酒精作用时间延长而增多。结论 酒精抑制骨髓基质细胞增殖及向成骨方向分化，促进其向脂肪细胞分化，这可能与酒精中毒引起继发性骨质疏松时骨量减少、髓内脂肪组织增多有关。     

TGF-β和BMP对胎兔颅骨成骨样细胞增殖和分化相互作用的实验研究

目的研究转化生长因子β(TGF-β)和骨形态发生蛋白(BMP)对成骨细胞增殖和分化的影响及其相互作用。方法取胎兔颅骨成骨样细胞进行体外培养，使用不同方法，加入TGF-β与BMP，在不同时间点检测其成骨样细胞增殖和分化的相互作用。结果TGF-β增加成骨样细胞DNA含量，抑制ALP活性、骨钙素的产生和矿化骨基质的形成。而BMP的作用相反。联合应用时，TGF-β减弱了BMP对成骨样细胞骨钙素产生和ALP活性的增强作用，BMP降低了TGF-β对成骨样细胞DNA合成的促进作用。在序惯性给药时，早期(9d)用BMP治疗并不影响随后加入的TGF-β对成骨样细胞ALP活性和基质钙化的抑制作用。而早期(10d)用TGF-β治疗却诱导了随后加入的BMP对成骨样细胞分化的促进作用。结论TGF-β促进成骨细胞增殖，BMP促进成骨细胞分化，它们在各自的不同时期发挥对成骨样细胞增殖和分化的影响。     

壳聚糖-阿仑膦酸钠对大鼠成骨细胞体外增殖和分化的影响

[目的]观察三种壳聚糖-阿仑膦酸钠(Cs/ALN)复合材料对体外成骨细胞增殖与分化的影响。[方法]用酶消化法分离培养新生SD大鼠颅盖骨的成骨细胞。制备三种比例的Cs/ALN复合材料及不含ALN的单纯Cs支架材料。将细胞分别与4种材料复合培养,Transwell法观察材料对细胞的趋化作用;流式细胞术检测材料对细胞生长周期的影响;酶标仪法、ELISA法分别检测细胞培养上清液中碱性磷酸酶(ALP)及骨钙素(BGP)的含量。[结果]流式细胞术细胞周期检测结果显示10∶1 Cs/ALN复合材料对成骨细胞增殖的促进作用最强。细胞培养上清液ALP及BGP含的测定显示10∶1 Cs/ALN复合材料对成骨细胞分化的促进作用亦最强。5∶1 Cs/ALN和20∶1 Cs/ALN两种复合材料对成骨细胞的增殖和分化也有一定的促进作用;而Cs支架材料则对成骨细胞的增殖和分化无明显促进作用;Transwell试验结果显示,5∶1 Cs/ALN复合材料对成骨细胞的趋化作用最强。[结论]10∶1 Cs/ALN复合材料具有明显促进成骨细胞增殖、分化及一定的趋化作用。     

辛伐他汀体外促进骨形成作用的初步研究

目的 研究辛伐他汀(Simvastatin)对成骨细胞分化、增殖及骨形成的作用。方法 用RPMI 1640培养液分别对水囊引产胎儿及新生大鼠颅顶骨进行组织培养,并将等量的胎儿或大鼠的颅顶骨骨组织分为实验组(辛伐他汀1μmol/L)和对照组,除动态观察比较不同培养液中成骨细胞的增殖状况外,将培养7d后的颅顶骨组织块制成半薄或超薄病理切片,于光镜下和电镜下进行形态学观察,并用测微尺测量新生骨组织厚度,记录成骨细胞数;同时,对留取的培养液测定其中的碱性磷酸酶(AKP)及骨钙素(BGP)的含量。结果 在培养过程中,可见实验组胎儿和新生大鼠颅骨成骨细胞生长活跃,数量多;对照组成骨细胞生长缓慢,数量少,可见大量成纤维细胞。培养7d后可见实验组胎儿及大鼠颅骨新生骨组织的厚度均明显高于对照组(P<0.01);其单位长度(0.3 mm)新生骨组织内成骨细胞数均明显高于对照组(P<0.01)。透射电镜下可见实验组成骨细胞处于活化状态,胞浆内有丰富的细胞器,少见破骨细胞,而对照组成骨细胞处于衰老状态,细胞器少见,可见大量破骨细胞。实验组培养液中AKP及BGP均明显高于对照组(P<0.01)。结论 辛伐他汀在体外实验中具有促进成骨细胞分化、增殖和促进新骨形成的作用;他汀类药物可作为预防、治疗骨质疏松症的有价值的候选药物。     

WO-1对成骨细胞的生物学效应研究

目的 了解WO-1在体外环境中对人成骨细胞增殖、分化的影响，为骨组织工程学研究提供更多的方法。方法 采用培养人胚成骨细胞，以生长曲线和。HTdR法分析WO-1与成骨细胞生物学效应的量效关系，在最佳作用浓度下，以接种细胞克隆形成率，流式细胞技术分析细胞周期，透射电镜观察细胞形态学，了解WO-1对细胞活性和细胞增殖的影响；以ALP活性检测，^3H-Proline掺入实验，放射免疫法测骨钙素合成及I型胶原和骨钙素mRNA的表达等，从蛋白质和mRNA两个水平观察WO-1对细胞功能的影响。结果 WO—1在高浓度时对人胚成骨细胞增殖有抑制作用，低浓度时对人胚成骨细胞增殖有促进作用，最佳作用浓度8μg／ml，在0．25～8μg／ml浓度范围内存在量效关系。在8μg／ml WO-1作用下，实验组人胚成骨细胞接种克隆形成率增加，克隆体积增大；群体倍增时间明显缩短，电镜下见细胞器较对照组发达；而ALP活性、I型胶原合成、骨钙素合成等，在蛋白质及mRNA两个水平均有增加，且与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 低浓度WO-1，可促进体外培养的人胚成骨细胞活性及增殖，加强细胞合成I型胶原、骨钙素等基质的功能，可用作成骨细胞增殖及分化的促进剂。     

成骨细胞在珍珠层复合人工骨表面的粘附和增殖

目的 评价人成骨细胞在珍珠层聚乳酸人工骨上的粘附能力。方法 将珍珠层聚乳酸人工骨与人成骨细胞体外复合培养，采用倒置相差显微镜、扫描电镜、透射电镜及流式细胞仪检测，观察人成骨细胞在珍珠层聚乳酸人工骨上的粘附能力。结果 珍珠层聚乳酸人工骨与人成骨细胞体外复合培养1周后，细胞通过伪足贴附于人工骨表面。透射电镜下成骨细胞形态正常，胞浆内有丰富的粗面内质网和线粒体，并可观察到细胞之间形成的连接。流式细胞仪检测结果显示，附着在珍珠层复合人工骨的成骨细胞增殖指数增高。结论 珍珠层复合人工骨材料有利于成骨细胞的粘附、增殖和分化。     

狗骨髓基质细胞的体外诱导成骨潜能研究

目的：观察狗骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法：采用成年狗双侧髂骨取材进行骨髓基质细胞培养，应用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法观察细胞增殖；以对硝基苯磷酸盐法及骨钙素含量放免测定法测定碱性磷酸酶活性及骨钙素含量；用Von Kossa染色法观察矿化结节；用间接免疫荧光染色法测定Ⅰ型胶原。观察在培养液中添加地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果：骨髓基质细胞呈成纤维样表现，增殖力强。诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素含量明显增高，Ⅰ型胶原表达增多，10～12d达到高峰，并出现矿化结节。结论：狗骨髓基质细胞在本实验条件下，成骨能力肯定，增殖能力强，可作为骨组织工程的种子细胞。     

降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

目的 探讨外源性降钙素基因相关肽（CGRP）对大鼠颅盖骨来源成骨细胞的影响，以进一步了解CGRP促进成骨的作用机制。方法 利用二次酶消化法培养的成骨细胞，加入含不同浓度CGRP的条件培养液，24小时后通过MTT比色，^3H-TdR掺入以及细胞内碱性磷酸酶（ALP）含量的测定来观察CGRP对成骨细胞增殖和分化的影响。结果 CGRP可以明显促进成骨细胞增殖，而且作用呈剂量依赖性。CGRP对细胞内ALP含量无明显影响。结论 CGRP能够直接作用于成骨细胞并通过促进其增殖而有利于骨形成。     

梯度糖溶液对体外培养成骨细胞影响的实验研究

目的：探讨梯度高糖对体外培养成骨细胞（osteoblast，OB）的影响。方法：采用胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶消化法从1～2日龄SD大鼠颅盖骨中分离出OB，倒置显微镜下及HE染色观察其形态，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALPase）染色法、钙化结节染色、Vam—Gieson染色鉴定细胞后用不同浓度的糖溶液加入到成骨细胞培养体系中，作用不同时间，应用MTT比色法、ALPase含量测定、矿化结节形成量等来检测其对成骨细胞增殖和成骨能力的影响。结果：不同浓度的糖溶液在OB培养48h时具有明显的促进增殖作用，但〉15mmol／L的溶液在72h时则呈抑制效应，其中以≤15mmol／L的糖溶液在培养早期有显著促进作用（P〈0．05或P〈0．01），而在培养较长时也无明显抑制效应；≥30mmol／L的糖溶液在OB培养7d时显著抑制ALPase的分泌（P〈0．05）；≥10mmol／L的糖溶液在培养18d时对矿化结节的形成也具有明显的延迟效应；〈10mmol／L的糖溶液对OB分泌ALPase及矿化结节形成无抑制作用。结论：高糖可影响OB增殖、分化与矿化能力，OB增殖耐受的糖浓度为≤15mmol／L，OB分化与矿化过程耐受的糖浓度为〈10mmol／L。     

补肾中药HU-ECS对培养成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响

目的：为了解补肾中药HU-ECS对体外培养成骨细胞的作用。方法：应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法及茜素红染色方法观察HU-ECS对体外培养民骨细胞的增殖、ALP表达及矿化结节形成的影响。结果：HU-ECS具有刺激骨细胞增殖作用（10^-6g/ml组,P＜0.01-0.001）,提高ALP活性及矿化结节形成的数量。结论：HU-ECS具有刺激体外培养成骨细胞增殖及分化成熟的功能。     

哌嗪雌酚酮对新生大鼠头盖骨成骨细胞的影响

目的 了解新合成化合物——哌嗪雌酚酮对体外培养成骨细胞的影响。方法 应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法、von Kossa染色法、流式细胞术及RT-PCR观察哌嗪雌酚酮对体外培养成骨细胞的增殖、分化、矿化结节形成、细胞周期及I型胶原蛋白表达的影响。结果 哌嗪雌酚酮可刺激成骨细胞增殖,刺激骨结节形成(10-7mol/L组,P<0.05)。结论 哌嗪雌酚酮具有刺激体外培养成骨细胞增殖和晚期分化成熟的功能。     

锶磷灰石多孔陶瓷不同孔隙率对成骨细胞生物学行为的影响

目的 比较不同孔隙率的锶磷灰石(含5at%锶的羟磷灰石,Sr-HA)陶瓷在体外培养条件下对兔骨髓成骨细胞生物学行为的影响.方法 抽取健康兔的骨髓组织,体外培养,诱导分化为成骨细胞,分别与孔径约为300μm-600μm、孔隙率分别为50%、60%、70%的Sr-HA以及孔隙率为70%的纯羟磷灰石陶瓷体复合,在不同时间点利用相差显微镜及扫描电镜观察,并进行碱性磷酸酶的定量检测.结果 兔骨髓成骨细胞与不同孔隙率的Sr-HA陶瓷体外培养后,表现出典型成骨细胞的形态特征和生物学特性,Sr-HA多孔陶瓷有利于细胞的贴附、生长与增殖,并对细胞的功能无不良影响.其中,孔隙率为70%的Sr-HA陶瓷更有利于细胞向材料内部爬行.结论 Sr-HA多孔陶瓷是较理想的骨组织工程支架材料,成骨细胞复合Sr-HA陶瓷用于骨缺损的修复,具有广阔的临床应用前景.孔隙率为70%的Sr-HA陶瓷由于具有良好的孔隙连通性,在促进成骨细胞生长方面表现出更佳的效果,较其他孔隙率的Sr-HA陶瓷更适用于骨组织工程支架材料.     

可控微结构EBM钛合金支架与成骨细胞的体外三维复合培养

[目的]探讨可控微结构EBM钛合金支架作为成骨细胞体外培养载体的可行性,并观察载体类蜂巢状孔结构在成骨细胞培养中的作用.[方法]应用直接金属快速成形技术一电子束熔化成形(electron beam melting,EBM)过程直接构建和制备可控性微结构钛合金支架.分离培养1 d龄胎兔颅骨成骨细胞,以兔颅骨源性成骨细胞复合支架作为实验组,以单独培养的兔颅骨源性成骨细胞作为对照组.将成骨细胞与支架复合培养1、7、14 d后,进行倒置相差显微镜、扫描电镜及组织切片染色观察细胞与材料复合情况,以MTT比色法及碱性磷酸酶的定量检测研究材料结构对细胞增殖、分化的影响.[结果]成骨细胞/支架复合培养7d后,大量细胞通过伸出多个伪足粘附在支架表面以及孔周围并与支架牢固结合;培养14 d后支架表面及孔隙内有大量细胞分布,细胞伸出数个突起沿着孔隙壁逐渐向孔隙内延伸、汇集.支架上的细胞增殖、分化以及转移明显增加,与对照组比较有明显统计学差异(P<0.05).[结论]EBM钛合金支架有利于细胞的贴附、生长及增殖,并对细胞的功能无不良的影响.支架类蜂巢状孔结构能够调节成骨细胞在支架内的分布.     

异黄酮类药Genistein对原代培养大鼠成骨细胞增殖、分化、钙含量及矿化功能的影响

目的：了解异黄酮类药Genistein对体外培养成骨细胞的作用。方法：应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法，原子吸收分光光度法及茜素红染色方法观察Genistein对体外培养成骨细胞的增殖、ALP表达，基质钙含量及矿化结节形成的影响。结果：Genistein具有刺激成骨细胞增殖，提高ALP活性，细胞基质钙含量及矿化结节形成的数量的作用。结论：Genistein具有刺激体外培养成骨细胞增殖，分化成熟及促进矿化的作用。     

纤维蛋白胶复合骨形成蛋白的注射型骨修复材料对兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的观察以纤维蛋白胶（fibrin sealant，FS）为载体复合骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的注射型骨修复材料对体外培养的兔骨髓基质细胞（marrow stromal cells，MSCs）增殖和分化的影响，为其临床应用提供实验依据。方法取3日龄新西兰兔骨髓进行培养传代，采用第3代细胞进行研究。实验分为3组，实验组：以含1μg／ml rhBMP-2注射型FS培养细胞；FS对照组：以单纯FS培养细胞；空白对照组：不作任何处理。采用细胞培养、组织化学及电镜等方法对各组兔MSCs的增殖、贴壁率、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性及染色、Ⅰ型胶原表达、超微结构及细胞在材料中的生长情况进行观察。结果各组细胞促增殖作用由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；对细胞贴壁率的影响总体由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。各组ALP活性由强到弱依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；各组细胞的Ⅰ型胶原表达水平由高到低依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，差异均有统计学意义（P〈0.05）。扫描电镜观察，材料表面粗糙，有微孔存在，FS对照组、实验组细胞与材料融合生长。透射电镜观察：实验组细胞向成骨细胞分化程度高，但细胞增殖活性较FS对照组稍差；FS对照组细胞向成骨细胞分化的程度较实验组低，细胞增殖活性较好；空白对照组的细胞增殖活性较差，胞外基质少。结论以FS为载体复合BMP的注射型骨修复材料可显著提高MSCs向成骨细胞方向的分化水平，但对MSCs促增殖作用不明显。