人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法:利用PCR技术扩增人脂联素基因完全编码序列,选用Gateway原核表达体系,经过BP反应、LR反应两步反应,将PCR产物克隆入pET-DEST42质粒,构建融合表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达脂联素融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,NDSB201高效复性后,使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞,RT-PCR法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖-6-磷酸酶转录水平的影响。结果:成功构建了表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,DNA序列测定结果与预期一致。IPTG诱导表达的融合蛋白经纯化后Western Blot鉴定具有人脂联素抗原性,并可使培养的肝细胞中葡萄糖-6-磷酸酶转录水平下降。结论:获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

人脂联素cDNA的克隆及序列分析

目的：构建人脂联素cDNA的克隆并进行序列分析。方法：提取人脂肪组织总RNA，运用RT-PCR方法扩增人脂联素cDNA完全编码区，将扩增产物通过TA克隆技术克隆至pMD18-T载体，对重组质粒进行测序验证。结果：成功构建人脂联素cDNA的克隆，重组质粒(pMD18-T／ADPN)经测序与Genebank检索的脂联素cDNA序列进行对比证实为100％同源。结论：所构建的人脂联素cDNA克隆适于进一步的克隆表达。     

脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及其表达与纯化

目的构建大鼠全长脂联素(fAd)和球状域脂联素(gAd)重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行纯化和鉴定。方法将纯化的脂联素克隆产物与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌M15感受态细胞中,并用IPTG诱导表达,并通过亲和层析、去盐、去除内毒素等纯化蛋白。结果PCR获得长度分别为684bp(fAd)和402bp(gAd)的目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank中脂联素序列(序列号:NM_144744)完全一致;含重组脂联素质粒的大肠杆菌在30℃经0.5mmol.L-1IPTG诱导6h时,可溶性蛋白表达量最高。结论成功克隆大鼠脂联素基因,并在大肠杆菌中获得有效表达。     

人脂联素基因在L-02细胞中表达及其功能检测

目的:在人正常肝细胞株L-02中表达外源人脂联素蛋白,并观察其生物学活性。方法:采用脂质体法将成功构建的人脂联素真核表达质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Adiponectin转染L-02细胞;免疫组织化学定位观察脂联素的表达;Western blot检测培养上清及细胞沉淀中脂联素水平;酶联免疫法测定培养基血糖。结果:构建的真核表达质粒能有效转染L-02细胞,并在培养上清及细胞沉淀中检测到脂联素蛋白,该重组蛋白能够降低高糖处理的L-02细胞的血糖水平。结论:重组人脂联素蛋白能在L-02中有效表达,该蛋白定位在细胞质,并且能分泌到胞外,表达产物经体外实验证实具有生物学活性。     

蝎镇痛抗菌活性肽BmK AS的融合表达及蛋白切割

目的构建镇痛抗菌活性肽BmK AS原核融合表达载体,实现可溶性表达,获得重组活性肽BmK AS。方法利用本实验室已构建成功的pET 28a-AS质粒,设计引物经过聚合酶链式反应,将目的基因克隆至pET 32a载体中,构建融合表达载体pET 32a-AS,优化诱导表达条件,实现BmK AS在大肠杆菌BL21(DE 3)中的融合可溶性表达,通过金属离子螯合亲和薄层色谱法对重组蛋白进行初步分离纯化,获得重组融合蛋白后采用凝血酶进行切割去除纯化标签,经SDS-PAGE检测切割效果。结果成功构建重组表达质粒,优化得到低温诱导促进蛋白可溶性表达的方法;采用金属离子螯合亲和薄层色谱法获得重组蛋白;电泳结果表明凝血酶可以切割融合蛋白。结论实现活性肽BmK AS在大肠杆菌中的融合可溶性表达,经凝血酶切割后获得重组镇痛抗菌活性肽BmK AS,为后续药理活性研究奠定基础。     

人胰岛素样生长因子-l的原核表达和纯化

目的构建高表达、易纯化的人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)工程菌。方法采用pET32a(+)质粒构建带羟胺裂解部位的表达载体,转入大肠杆菌DH5α进行诱导表达。表达产物经镍离子-亲和柱色谱分离后进行羟胺裂解。裂解产物纯化后用MALDI-TOF-MS法测定相对分子质量(Mr)。结果重组质粒序列完全正确。工程菌可表达预计Mr的融合蛋白,经Western blot证实有hIGF-1抗原活性。经镍离子-亲和柱色谱分离、羟胺裂解后得到的肽的Mr为7 640,和理论值相符。结论成功构建了表达hIGF-1的工程菌,为开发hIGF-1奠定了基础。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒UL12基因在大肠杆菌BL21和Rosetta菌中的差异表达

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a-UL12,比较重组表达质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性。方法使用PCR的方法扩增出HSV-1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a-UL12,分别转化E.coli BL21和E.coli Rosetta菌。经SDS-PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性。结果重组质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coliRosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高。结论成功构建了表达出了具有较高活性的HSV-1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV-1药物奠定了基础。     

The differential expression of HSV -1 UL12 gene in E.coil BL21 and E.coli Rosetta

目的 构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV -1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a - ULI2,比较重组表达质粒pET32a -UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性.方法 使用PCR的方法扩增出HSV -1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a - UL12,分别转化E.coli BL21和E coli Rosetta菌.经SDS - PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性.结果 重组质粒pET32a - UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高.结论 成功构建了表达出了具有较高活性的HSV -1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV -1药物奠定了基础.     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

脂联素单链抗体基因的克隆及表达

目的 克隆人脂联素单链抗体基因并进行表达。方法提取分泌抗脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,与质粒pUC19载体连接,形成克隆,并对其进行鉴定分析。结果抗体重、轻链可变区扩增拼接后的重、轻链各约为340bp、350bp,基因全长约710bp,将拼接产物插入pUC19质粒中转化大肠杆菌JM109,得到数个克隆,经酶切分析约含710bp片段,与拼接结果基本相同,经测定特异性较好,与其他杂蛋白及载脂蛋白没有交叉反应。结论抗人脂联素单链抗体基因的克隆和表达较为成功。     

Expression system for production of bioactive compounds,recombinant human adiponectin,in the silk glands of transgenic silkworms

Adiponectin is an adipocyte hormone involved in glucose and lipid metabolism. The aim of this study was to develop a human adiponectin expression system in transgenic silkworm using a human adiponectin expression vector. The silk gland of the silkworm is a highly specialized organ that has the wonderful ability to synthesize and secrete silk protein. To express human adiponectin in the silk gland of transgenic silkworm, targeting vectors pB-A3-adiponectin-IRES-RFP and pB-Ser1-adiponectin-IRES-RFP were constructed and then introduced into the silkworm pupa. The transgenic silkworms were verified by PCR and then generated. The level of adiponectin in the transgenic silkworm was 6–10 ng/50 mg of freeze-dried powder, and western blotting using an antibody against human adiponectin demonstrated a specific band with a molecular weight of 30 kDa in the silkworm. These results showed that human adiponectin introduced into the silkworm genome was expressed successfully on a large-scale.     

重组人Hexastatin融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及其纯化

目的构建人Hexastatin蛋白原核表达载体,大量表达并纯化Hexastatin蛋白,为其在体内外的活性研究奠定基础。方法提取人食管癌EC9706细胞总RNA,通过RT-PCR方法扩增人Hexastatin基因,导入pMD18-T载体测序,然后克隆至pMAL-c4x表达载体,IPTG诱导表达,并利用Amylose亲和树脂纯化融合蛋白,产物进行Westernblot鉴定。结果经PCR扩增成功获得了687bp的人Hexastatin基因,测序正确。重组人Hexastatin基因在BL21菌体中获得高效可溶性表达,表达的可溶性蛋白占总蛋白量的24.8%,纯化后的MBP-Hexastatin融合蛋白纯度可达90%,Westernblot证实表达蛋白为目的蛋白。结论人Hexastatin基因克隆、表达及纯化的成功,为进一步在体内外研究其生物活性奠定基础,同时也为肿瘤的生物治疗提供了新的方法。     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建乳腺癌转移抑制基因（BRMS1）的真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc-BRMSI,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础。方法常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizd法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BIIMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3．1／mye—His（-）B上,构建BRMS1的真核表达载体peDNA3．1（-）B／myc．BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Westernblot验证其是否表达。结果重组质粒pcDNA3．1（-）B／myc-BRMS1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS1基因的cDNA序列吻合,重组体peDNA3．1（-）B／myc—BRMS1中插入的目的基因BRMS1是正向、单倍插入。结论成功构建了BRMS1真核表达载体pcDNA3．1（-）B／myc—BRMS1,为深入研究BRMS1基因功能和BRMS1基因治疗奠定了物质基础。     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建乳腺癌转移抑制基因(BRMS 1)的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础.方法 常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizol法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BRMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B上,构建BRMS 1的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Western blot验证其是否表达.结果 重组质粒pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS 1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS 1基因的cDNA序列吻合,重组体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1中插入的目的 基因BRMS 1是正向、单倍插入.结论 成功构建了BRMS 1真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1,为深入研究BRMS 1基因功能和BRMS 1基因治疗奠定了物质基础.     

人肿瘤抑素(tumstatin)的基因克隆及其原核表达

目的克隆人肿瘤抑素(tumstatin)基因,并进行其在大肠杆菌表达的研究。方法用RT-PCR技术从人肾癌旁组织中扩增出肿瘤抑素的cDNA,构建原核表达载体pQE-tum,IPTG诱导重组蛋白质的表达,并利用Ni-NTAHis-Bind树脂纯化该重组蛋白质。结果经PCR扩增成功获得742 bp的人肿瘤抑素基因,测序正确。在大肠杆菌中目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的10%,SDS-PAGE及Western blot分析显示,其相对分子质量为28 000,纯化后的6×His-tumstatin纯度可达92%。结论tumstatin基因克隆、表达及纯化的成功,为其今后的肿瘤抗血管生成治疗研究奠定了基础。     

人nanog-delta48基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,检测其在肝癌SMMC-7721细胞中的表达。方法:通过RT-PCR的方法克隆nanog基因的选择性剪接变异体nanog-delta48全长编码序列,连接入pMD18-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pcDNA5/FRT,构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,测序无误后经脂质体介导转染到SMMC-7721细胞中,通过RT-PCR初步鉴定其在SMMC-7721细胞中的表达,并通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染前后的细胞增殖活力。结果:成功克隆nanog-delta48基因全长编码区,测序证明pcDNA5/FRT-nanog-delta48重组真核表达载体构建成功,使其在SMMC-7721细胞中过表达,MTT检测nanog-delta48转染入SMMC-7721细胞后,增殖能力增强。结论:剪接变异体nanog-delta48基因可能具有与nanog基因类似的活性。