广东药学院重点学科——微生物与生化药学

微生物与生化药学是生物制药的重要学科方向，它以现代分子生物学理论为基础，以基因工程技术为核心，以现代生物技术药物为平台，研究对象涵盖重组蛋白类药物（包括基因工程疫苗）、重组DNA类药物（包括基因治疗药物与基因疫苗）、基因工程抗体与微生物次生代谢类药物。     

恶性疟多表位疫苗在鼠疟的保护性试验

为寻找恶性疟原虫基因工程多表位疫苗保护性评价的模型动物,利用鼠约氏疟原虫（Plasmodium　yoelii）及伯氏疟原虫小鼠（Phasmodium　bergher）模型对本实验室构建的恶性疟原虫（Plasmodium　falciparum）多表位基因工程候选疫苗进行了体内保护性及免疫模式试验。结果在约氏疟原虫,先用该疫苗基因的大肠杆菌表达蛋白免疫、后用含同一基因的重组痘苗病毒加强免疫组与野生型痘苗病毒免疫组及空白对照相比,小鼠的死亡时间延长（P<0.01）。结果初步显示,约氏疟原虫鼠模可用作该基因工程多表位恶性疟原虫候选疫苗的保护性评价。     

人源性抗体库技术及其应用前景

抗体是机体免疫系统的重要效应分子。抗体制备经历了多克隆抗体（PcAb）、单克隆抗体（McAb）、和基因工程抗体的过程。抗体库技术的问世,加速了人源化抗体的开发,生产了大量用于研究、更适于体内诊断和治疗的基因工程抗体。抗体药物已成为生物制品类药物的重要部分,截止2004年底,经美国食品药品管理局（FDA）批准的抗体药物已有近20种,其中80％是基因重组抗体,目前正在进行临床验证的抗体药物也有数百种。重组人源性抗体作为药物具有广阔的应用前景。     

生物药品的开发进展及临床应用

当今 ,生物学领域飞跃发展 ,尤其在生物医学方面已从分子学水平、基因工程、细胞工程、酶工程、微生物工程开发出大量生物药品。目前 ,国际上已批准上市的基因工程产品 4 0多个 ,包括细胞因子类 ,激素类、酶类和重组疫苗等。我国生物技术的研究开发起步较晚 ,但跟踪、仿制、发展迅速 ,已从原来的单纯动物脏器制药发展为生物工程技术制药 ,国内已批准 15个生物工程药物或疫苗投放市场。1　国内外生物药品开发现状1.1　近 2年开发的部分重要成果见表 1。1.2　国内的主要产品。目前 ,国内市场上已有基因工程乙肝疫苗、干扰素、重组人的介素 - …     

三种不同国产乙型肝炎重组疫苗免疫效果及复种初探

为探讨乙肝基因重组疫苗预防接种策略，以全程免疫后检测抗－HBs水平的方法观察3种不同疫苗的免疫效果。结果表明：长春生产的细胞产基因重组乙肝疫苗（10微克／支），免疫效果较好，而北京和深圳生产的两种重组酵母乙肝基因工程疫苗（5微克／支），免疫效果不理想，前后两者差异显著（P＜0．001），后经过对其中抗－HBsS/N值＜10人群采取不同方法复种后，合并第一轮全程接种总评，阳转率和保护性抗体阳性率均有较大提高，两种酵母苗保护性抗体阳性率均提高30％以上。从而提示：目前应用乙肝基因工程疫苗预防接种，必须采取在全程免疫后查抗－HBs峰值并及时复种的免疫策略，才能取得可靠的免疫效果。     

基因疫苗在肿瘤免疫治疗中的研究进展

肿瘤的治疗目前仍是世界性的难题,随着免疫学和分子生物学的发展,肿瘤疫苗的发展经历了肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗三个阶段。肿瘤基因疫苗也称DNA疫苗,是目前研究的热点,主要包括与肿瘤相关抗原（TAAs）有关的全长、表位、独特型（Id）和融合DNA疫苗,能够自主复制的RNA疫苗,与树突细胞（DCs）相关的肿瘤基因疫苗等。近年来,肿瘤基因疫苗在动物基础研究和临床前研究,     

莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的诱导表达

目的 为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法 采用377型DNA自动测序仪对莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的插入片段进行DNA序列测定,并通过计算机软件对其进行限制性内切酶酶谱分析。然后将重组质粒pBX1在大肠杆菌中进行诱导表达,并对其表达产物进行免疫印迹分析。结果 （1）重组质粒pBX1插入片段大小为477bp,其核酸序列与文献报道的p83基因全序列相应区段相比较仅有一个碱基的变异,（2）成功绘制了该插入片段的限制性内切酶酶谱;（3）重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后获得了29kd的融合蛋白;（4）Western-blotting分析表明该融合蛋白能与莱姆病多价抗血清呈强阳性印迹反应。结论 该研究成功地对莱姆病螺旋体83kd抗原蛋白特异性区段进行了基因重组和表达,为进一步研究其在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础。     

一种可能用于治疗的新疫苗─—DNA疫苗简介

DNA（去氧核糖核酸）疫苗也可称之为“基因疫苗”，是与传统的疫苗（如麻疹疫苗）和基因工程疫苗（重组疫苗，如酵母菌表达的乙肝疫苗）完全不同的疫苗。其主要区别是：①前两种疫苗主要是蛋白质，将这种蛋白质注射至人体就可以诱生免疫反应，从而达到预防的目的。而DNA疫苗不是蛋白质而是核酸（基因），将这种基因注射到人体内，使其在人体内表达各种抗原，从而诱生人体的免疫反应，达到预防和治疗的目的川；②前两种疫苗主要是诱生体液免疫反应（产生抗体），而在病人体内诱生细胞免疫反应的能力比较差，因而主要用于预防，而DNA疫苗…     

浅议基因工程药物的质量控制

生命科学正成为21世纪的领头科学。生物药物毒性低、副作用小、容易为人体吸收，因此在药品中比例趋增。自1982年全世界第一个基因重组新药“人胰岛素”在美国上市以来，美国现已有近百种基因工程重组生物技术药物获FDA批准上市；自1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物重组人干扰素alb，现已正式批准上市的达20种。《中国药典》（2000年版）首次载入了基因工程产品。     

火鸡疱疹病毒繁殖非必须基因重组病毒用转移载体的构建

目的：构建用于基因工程疫苗制作的火鸡疱疹病毒（HVT）外源基因转移用载体。方法：利用PCR技术，从感染火鸡疱疹病毒的鸡胚成纤维细胞（CEF）基因组中成功地扩增出火鸡疱疹病毒的繁殖非必须基因-US基因，将该PCR产物克隆进PGEM-T载体中，利用末端平滑化技术和连接反应，把报告基因LacZ基因插入到US基因中。结果：构建出了用于制作重组HVT病毒的转移载体。结论：本研究以LacZ作为报告基因，成功的将其插入到US基因中，为将来应用HVT基因工程疫苗奠定了良好的基础。     

兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法

为了有效地预防和根除山羊痘，研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）疫苗株AV41胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因克隆、鉴定的基础上，构建转移载体。将痘苗病毒（Vaccinia Virus，VV）晚期启动子P11和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）报告基因片段插入含有TK片段同源臂的载体pTK的KpnI酶切位点，经酶切、PCR鉴定出，命名为pTK-LacZ。用脂质体法转染感染了GPVAV41株的犊牛睾丸（bovine testes，BT）细胞，待出现80%以上的细胞病变时收获病毒，经过连续9代蓝色蚀斑筛选、纯化和PCR鉴定，获得纯化的表达LacZ基因、TK功能缺失的重组病毒，命名为rGPV-LacZ。生物学特性研究显示，LacZ基因的插入不影响重组病毒的增殖特性，其毒力、生长特性与亲本株相似，保持原有疫苗株的生长特性，而且在BT细胞和羔羊睾丸（lamb testes，LT）细胞连续传20代遗传性状很稳定。本研究筛选、纯化的重组病毒rGPV-LacZ可以区分自然感染和疫苗免疫动物，为进一步研制山羊痘病毒基因工程标记疫苗奠定了基础。     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）强制泛素（Ub）化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1（-）,并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。     

三种不同国产乙型肝炎重组疫苗免疫效果及复种初探

为探讨乙肝基因重组疫苗预防接种策略,以全程免疫后检测抗-HBs水平的方法观察3种不同疫苗的免疫效果。结果表明:长春生产的细胞产基因重组乙肝疫苗(10微克/支),免疫效果较好,而北京和深圳生产的两种重组酵母乙肝基因工程疫苗(5微克/支),免疫效果不理想,前后两者差异显著(P<0.001),后经过对其中抗-HBs S/N值<10人群采取不同方法复种后,合并第一轮全程接种总评,阳转率和保护性抗体阳性率均有较大提高,两种酵母苗保护性抗体阳性率均提高30％以上。从而提示:目前应用乙肝基因工程疫苗预防接种,必须采取在全程免疫后查抗-HBs峰值并及时复种的免疫策略,才能取得可靠的免疫效果。     

基因工程疫苗发展研究

基因疫苗的研制主要针对一些严重威胁人类健康的重大疾病,如癌症、艾滋病、自身免疫性疾病、心脑血管疾病、神经障碍性疾病、呼吸系统疾病、糖尿病和遗传病等.传统疫苗主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗和用某些成分制成的亚单位疫苗.现代生物技术的发展为疫苗的研制带来了新的机遇,人们可以通过重组DNA技术克隆表达保护性抗原基因,利用表达产物或重组体制成疫苗.     

今后几年我国重点发展6项生物医药项目

据国家卫生部门消息，今后几年我国将重点发展6项生物医药项目。据了解，这些重点发展项目包括改进抗生素工艺；开发各种疫苗与酶诊断试剂，重点是乙肝基因疫苗与单克隆抗体诊断试剂；对中草药有效生物活性成分的提取、发酵生产；开发活性蛋白与多肽类药物，重点为干扰素、生长激素等；开发靶向药物，以治疗肿瘤药物为重点；应用微生物转化法与酶固定化技术发展氨基酸工业，开发甾体激素，改进现有传统生产工艺。     

钩端螺旋体外膜抗原基因OMPL1在卡介苗中的克隆和初步表达

采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体（简称钩体）赖型０１７菌株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ＯｍｐＬ１，并克隆到大肠杆菌—卡介苗穿梭质粒载体ｐＹ６００２中，重组质粒经电转化导入卡介苗。斑点杂交筛选重组卡介苗，再通过免疫印迹对其表达进行初步研究。在所得６个重组卡介苗中，有３个表达了ＯｍｐＬ１基因产物，其中一个表达较强。该研究为发展新一代高效广谱的钩体基因工程疫苗打下了基础。     

细粒棘球蚴中国大陆株线粒体苹果酸脱氢酶基因的克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基因片段，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选基因奠定基础。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据国外细粒棘球蚴mMDH（线粒体苹果酸脱氢酶）基因的已知序列设计一对引物，采用RT—PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆侏mMDH基因。将PCR产物纯化后，亚克隆到pGEM—T载体并构建成基因工程菌株后进行序列测定和分析。结果 用RT—PCR成功扩增出细粒棘球蚴中囤大陆株mMDH基因，测序表明该基因开放阅读框为1017bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为99％，理论蛋白编码的氩基酸序列同源性为99％。结论 在国内首次获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基囚序列，为进一步构建重组表达基因工程菌株打下良好的基础。     

新型防龋疫苗——变形链球菌基因疫苗防龋应用基础研究

1．主要研究内容：（1）基因疫苗的构建;通过基因重组技术成功地构建了含主要致龋菌变形链球菌毒力因子基因的重组质粒pcDNA3-pac、pcDNA3-gtf B、pcDNA3-pac A和pcDNA3-pac P。（2）基因疫苗的鉴定：经双酶切、测序等分析证实目的基因片段插入相位正确,未改变其阅读框架。（3）基因疫苗在真核细胞中均能正确转录和表达。（4）将构建的基因疫苗经不同途径免疫定菌鼠,进行了以下几方面的研究：①筛选出颌下腺周注射是最有效的免疫防龋途径;②通过血清和唾液中特异性抗体的动态变化过程的监测,表明所构建的基因疫苗能诱导高效价的特异性血清和唾液抗体;③以龋齿计分、牙面菌斑指数及唾液中变形链球菌计数多方面的观察,表明所构建的基因疫苗具有显著防龋作用。（5）基因疫苗的生物安全性研究：通过基因疫苗整合入宿主细胞基因组可能性的研究,表明基因疫苗是安全的。     

戊型肝炎病毒 ORF2截短蛋白 p154在毕赤酵母中的分泌性表达及其抗原性

目的：利用毕赤酵母系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF2编码蛋白第452～605氨基酸多肽（p154）,探讨毕赤酵母表达系统用于研发戊型肝炎基因工程疫苗的可能性。方法：采集戊型肝炎患者粪便,进行RT-PCR检测和测序鉴定,并依此为模板扩增ORF2 p154基因,克隆到表达载体pPICZαA上,电转化入毕赤酵母宿主菌GS115,经筛选鉴定后将携带目的基因的重组克隆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。结果：利用基因重组技术构建了含HEV p154片段的pPICZαA重组质粒,并在毕赤酵母菌株GS115中实现了分泌性表达,表达的目的蛋白p154分子质量约为22 kDa,上清中p154表达量可达到200μg· ml -1。 p154可与HEV感染兔恢复期血清及HEV单克隆抗体6F9进行反应,表明酵母表达的p154具有良好的抗原性。结论：HEV ORF2 p154在毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,为进一步研发真核表达的戊型肝炎基因工程疫苗奠定了实验基础。     

八方荟萃：我国自主研制的新一代基因重组乙肝疫苗上市

利用我国自主知识产权的基因重组技术研制生产的新一代基因重组乙肝疫苗——“汉逊瑞安”取得了国家新药证书及国家食品药品监管局颁发的药品批准文号，通过了国家食品药品监管局GMP（药品生产质量管理规范）认证，现已正式上市。这标志着我国基因工程疫苗研制技术和疫苗产业化规模生产技术向国际水平又迈进了一大步。据中国疾病预防和控制中心有关专家介绍，医学界至今尚无根治乙肝的良药，疫苗接种是预防乙肝最有效、最经济的方法，也是降低继发性肝硬化和肝癌的有效策略。