姜黄素诱导人髓母细胞瘤Daoy细胞自噬的实验研究

目的：观察姜黄素（Curcumin）诱导人髓母细胞瘤Daoy细胞自噬的作用,并探讨其可能的作用机制。方法：体外培养人髓母细胞瘤Daoy细胞,不同浓度姜黄素作用24、48、72 h,MTT 法检测细胞增殖;荧光染色、RT-PCR和Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达;RT-PCR和Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达。PI3K激动剂insulin处理细胞后,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达变化。结果：姜黄素明显抑制Daoy细胞的生长,呈时间-剂量依赖性。免疫荧光显示Beclin1和LC3在姜黄素处理组中的表达明显增强。姜黄素作用不同时间,Daoy细胞中Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA和蛋白水平均增高（mRNA：F=1 360.962、42.366,P=0.000、0.000;蛋白：F=32.723、11.847,P=0.001、0.008）,而PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达受到明显抑制（F=329.662、80.638、183.536,P=0.000、0.000、0.000）。PI3K激动剂insulin不能有效阻断姜黄素引起的PI3K、p-Akt和p-mTOR的降低。结论：姜黄素诱导自噬抑制髓母细胞瘤Daoy细胞生长,其机制可能与上调自噬相关基因表达,抑制自噬负调控PI3k/Akt/mTOR信号通路有关。     

中和白介素⁃17对博来霉素诱导的特发性肺纤维化及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的：研究中和白介素?17（interleukin?17,IL?17）对博来霉素（bleomycin,BLM）诱导特发性肺纤维化及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。方法：C57BL/6小鼠随机分为对照组、BLM组、中和抗体组和自噬抑制组。BLM组、中和抗体组和自噬抑制组利用BLM（5 U/kg）诱导特发性肺纤维化模型形成,对照组给予等量生理盐水。造模第1天起自噬抑制组小鼠腹腔注射3?甲基腺嘌呤（3?methyladenine,3?MA）,每周5次,连用4周,其他3组则注射等量的生理盐水。中和抗体组和自噬抑制组小鼠分别从造模后第3 d起,每隔3 d尾静脉注射抗鼠IL?17抗体,于28 d取材,采用Masson三色染色和羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）含量测定评价肺纤维化程度和胶原蛋白的表达变化,利用ELISA检测肺泡灌洗液中转化生长因子?β1（transform growth factor?β1,TGF?β1）的含量,Western blot分析LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin?1、p62、p?PI3K/PI3K、p?Akt/Akt和p?mTOR/mTOR的蛋白表达。结果：与BLM组相比,中和抗体组羟脯氨酸和TGF?β1含量显著下降（P < 0.01）,肺纤维化程度明显降低（P < 0.01）,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin?1表达明显上调（P < 0.01,P < 0.05）,p62表达减少（P < 0.05）,而p?PI3K/PI3K、p?Akt/Akt、p?mTOR/mTOR比值显著降低（P < 0.05）。结论：IL?17在肺纤维化中的作用与抑制细胞自噬有关。中和内源性IL?17,能显著改善BLM诱导的肺纤维化,降低TGF?β1产生,抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,激活细胞自噬。     

槲皮素对人前列腺癌PC-3细胞自噬及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的影响

目的 观察槲皮素对人前列腺癌PC-3细胞活力、凋亡、自噬及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。方法 体外培养PC-3细胞,采用CCK-8法检测PC-3细胞活力,TUNEL染色检测PC-3细胞凋亡,吖啶橙染色观察PC-3细胞自噬小泡,GFP-LC3质粒转染分析观察PC-3细胞自噬小体,Western blot分析检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3融合蛋白(LC3)、Beclin-1和PI3K/Akt/mTOR 信号通路蛋白的表达。结果 槲皮素以浓度-时间依赖性的方式抑制PC-3细胞活力,并诱导细胞凋亡;能够增加PC-3细胞自噬小泡和自噬小体的数量;能够升高PC-3细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1表达,同时降低磷酸化-PI3K、磷酸化-Akt和磷酸化-mTOR的表达。结论 槲皮素可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路诱导PC-3细胞发生自噬。     

miR-21对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖与凋亡的影响

探讨miR-21对类风湿关节炎（RA）滑膜成纤维细胞（FLS）增殖与凋亡的影响。方法 Realtime PCR方法检测正常和RA-FLS中miR-21表达差异。RA-FLS分成Control组、miR-NC组（转染mimics control）、miR-21组（转染miR-21 mimics）、miR-21+IGF-1组（转染miR-21 mimics,PI3K/Akt信号通路特异性激活剂IGF-1处理）,CCK-8实验分析细胞增殖活性变化,流式细胞术分析细胞凋亡水平变化,Western blot方法分析细胞中C-Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达变化。结果 与正常-FLS比较,RA-FLS中miR-21表达水平降低（P＜0.05）。与Control组、miR-NC组比较,miR-21组RA-FLS细胞中miR-21表达水平升高,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率增加,细胞中C-Caspase-3、Bax蛋白表达增多,Bcl-2蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平降低（P＜0.05）。与miR-21组比较,miR-21+IGF-1组RA-FLS增殖活性升高,细胞凋亡率降低,细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达增多,C-Caspase-3、Bax蛋白表达减少,Bcl-2蛋白表达增多（P＜0.05）。结论 上调miR-21可抑制RA-FLS增殖,诱导细胞凋亡,机制可能与降低PI3K/Akt信号激活水平有关。     

黄芩苷对脂多糖诱导的大鼠滑膜RSC-364细胞自噬的抑制作用

目的：探讨黄芩苷通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素（PI3k/Akt/mTOR）信号通路对脂多糖（LPS）诱导的大鼠滑膜RSC-364细胞自噬的影响,并阐明其作用机制。方法：将对数生长期大鼠滑膜RSC-364细胞分为对照组、模型组、地塞米松（DXMS）组、10 μmol·L^-1黄芩苷组、20 μmol·L^-1黄芩苷组和40 μmol·L^-1黄芩苷组。对照组RSC-364细胞只加入培养基,其他各组RSC-364细胞均采用1 mg·L^-1LPS体外刺激12 h制作炎症细胞模型。采用MTT法检测各组RSC-364细胞存活率,RT-PCR法检测各组RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1和微管相关蛋白-轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ） mRNA表达水平,Western blotting法检测各组RSC-364细胞中Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ和P62蛋白表达水平。结果：与对照组比较,模型组RSC-364细胞存活率明显升高（P<0.01）,模型组RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR mRNA和P62蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）,Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,不同浓度黄芩苷组RSC-364细胞存活率明显降低（P<0.05或P<0.01）,RSC-364细胞中PI3k、Akt、mTOR mRNA和P62蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）,Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）。结论：黄芩苷可能通过激活PI3k/Akt/mTOR信号通路抑制LPS诱导的RSC-364细胞自噬。     

银杏内酯K调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨银杏内酯K（GK）调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响。方法 取对数生长期的MCF-7细胞,设置分组为对照组、GK低浓度（GK-L,12.5 μg/mL）组、GK中浓度（GK-M,25 μg/mL）组、GK高浓度（GK-H,50 μg/mL）组、GK-H+AMPK抑制剂（Compound C,50 μg/mL GK+50 μmol/L Compound C）组。观察各组细胞形态以及细胞增殖、凋亡、自噬状况并分析自噬相关基因LC3、P62、Beclin1 mRNA表达以及AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、LC3、P62、Beclin1表达。结果 与对照组相比,GK-L、GK-M、GK-H组细胞自噬泡数量增多,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62表达显著下降,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著增加（P＜0.05）;与GK-H组相比,GK-H+Compound C组细胞自噬泡数量减少,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62显著增加,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著降低（P＜0.05）。结论 GK可以诱导乳腺癌细胞自噬和凋亡、抑制其增殖,可能与激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路有关     

过表达TLR4基因对胃癌细胞自噬的抑制作用及其机制

目的 采用慢病毒过表达胃癌细胞中Toll样受体4（TLR4）基因,探讨其对胃癌细胞自噬的作用,并阐明其作用机制。 方法 处于对数生长期的胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞分为未感染组、阴性对照病毒组和基因过表达组,分别给予无慢病毒感染、空载体慢病毒和过表达TLR4慢病毒稳定感染。采用Western blotting法检测正常胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌BGC-823细胞、SGC-7901细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法分别检测各组细胞中TLR4、Beclin1和微管相关蛋白轻链3（LC3）mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）、磷酸化PI3K／磷酸化Akt（p-PI3K／p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）信号通路相关蛋白及细胞自噬相关蛋白（LC3、Beclin1和p62）蛋白表达水平。 结果 BGC-823细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平高于胃黏膜上皮GES-1细胞。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞增殖活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。与阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,BGC-823细胞中Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）,SGC-7901细胞中LC3和Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中LC3和Beclin1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,p62、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。 结论 过表达TLR4基因可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路明显抑制胃癌细胞的自噬活性。     

CH25H调控细胞自噬和凋亡对喉鳞状细胞癌进展影响

目的探讨胆固醇25-羟化酶（CH25H）通过调控细胞自噬和凋亡对喉鳞状细胞癌（LSCC）进展的影响。方法通过转染CH25H过表达质粒,构建CH25H稳定过表达的人LSCC细胞系AMC-HN-8细胞（AMC-HN-8/CH25H）,转染空白质粒为转染对照（AMC-HN-8/Mock）,同时设置未转染空白对照（AMC-HN-8）。采用实时荧光定量PCR检测各组细胞CH25HmRNA表达水平,Westernbolt检测CH25H、凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2关联X蛋白（Bax）、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（C-caspase-3）]、自噬相关蛋白[微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC3）Ⅱ、Beclin-1、p62]以及磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路蛋白[PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）]的表达水平。流式细胞术检测各组细胞凋亡率,免疫荧光检测各组细胞LC3Ⅱ表达。构建裸鼠LSCC移植瘤动物模型,采用随机数字表法将裸鼠分为AMC-HN-8组、AMC-HN-8/Mock组、AMC-HN-8/CH25H组,每组8只,分别接种对应细胞,检测CH25H对LSCC细胞生长以及凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白的影响。结果相比AMC-HN-8和AMC-HN-8/Mock组细胞,AMC-HN-8/CH25H组细胞CH25H表达上调（P＜0.05）,凋亡率显著增加（P＜0.05）,CH25H表达促进了Bax和C-caspase-3表达,抑制了Bcl-2的表达。同时CH25H表达促进了LC3Ⅱ和Beclin-1的表达,抑制了p62的表达,表明过表达CH25H可促进LSCC细胞的凋亡和自噬。此外,CH25H抑制了PI3K/Akt致癌信号通路的激活。在移植瘤裸鼠模型中,过表达CH25H可抑制体内LSCC肿瘤生长。结论CH25H在LSCC细胞中通过PI3K/Akt信号通路调控细胞自噬和凋亡进而影响肿瘤进展。     

阿伐他汀通过PI3K/Akt/mTOR途径调节白血病细胞自噬的作用及机制

目的:研究阿伐他汀对白血病细胞K562自噬的影响及相关信号机制。方法:取对数生长期的K562细胞,分为阴性对照组、阿伐他汀组、阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组、阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组。共培养24h后,采用吖啶橙染色观察细胞自噬体的变化,Western Blot检测Ⅱ型自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅱ)和自噬血管基因Beclin-1的表达,RT-PCR和Western Blot检测磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达。结果:与阴性对照组相比,阿伐他汀抑制白血病细胞K562自噬体的形成(P<0.05),下调LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达(P<0.05)。与阿伐他汀组相比,阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达增加(P<0.05);阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达增加(P<0.05)。与阿伐他汀组相比,阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组p-Akt和p-mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05);阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组p-Akt和p-mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05)。结论:阿伐他汀可以抑制白血病细胞K562自噬,推测其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

基于PI3K/Akt通路沉默miR-26b对妊娠期高血压胎盘滋养细胞增殖、凋亡的影响

目的 分析沉默微小RNA-26b（Micro RNA-26b,miR-26b）对妊娠期高血压胎盘滋养细胞增殖、凋亡及磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide-3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）通路的影响。 方法 购买人胎盘滋养细胞,使用100 μmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯诱导胎盘滋养细胞模拟妊娠期高血压微环境,分为细胞空白组（N-硝基-L-精氨酸甲酯诱导胎盘滋养细胞）、过表达组（N-硝基-L-精氨酸甲酯诱导胎盘滋养细胞后做miR-26b过表达质粒转染）、沉默组（N-硝基-L-精氨酸甲酯诱导胎盘滋养细胞后做miR-26b沉默质粒转染）。检测3组细胞增殖、细胞凋亡、细胞PI3K/Akt通路蛋白表达情况。 结果 与空白组相比,过表达组miR-26b表达量升高,沉默组miR-26b表达量降低（P＜0.05）,说明miR-26b转染成功。过表达组24 h、48 h、72 h细胞增殖率逐渐降低,沉默组逐渐升高,3组在组间、时点间、组间·时点间差异均有统计学意义（P＜0.05）。与空白组相比,过表达组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表达量降低,Bax蛋白表达量升高（P＜0.05）;与空白组相比,沉默组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表达量升高,Bax蛋白表达量降低（P＜0.05）;与过表达组相比,沉默组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表达量升高,Bax蛋白表达量降低（P＜0.05）。 结论 沉默miR-26b可抑制妊娠期高血压胎盘滋养细胞凋亡、促进增殖,其作用机制可能与PI3K/Akt通路被激活相关。     

新风胶囊通过miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR抑制骨关节炎CD4+T与软骨细胞共培养的免疫炎症

目的 观察新风胶囊（XFC）含药血清通过调控miR-23a-3p /PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制骨关节炎（OA）CD4+T与软骨细胞共培养中免疫炎症反应的作用机制。方法 选取30例OA患者（OA组）及30例正常人（NC组）检测miR-23a-3p、10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（PTEN）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达,观察临床指标：红细胞沉降率（ESR）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）、IgA、IgG、IgM、补体 C3、补体C4的表达,并观察通路与临床指标的相关性。观察 30 例 OA 患者经 XFC 治疗后通路及临床指标的变化。分离及提取 OA-CD4 +T 细胞,transwell小室培养OA-CD4+T细胞与OA-CH,SD大鼠给药灌胃制备XFC含药血清;采用CCK8法检测OA-软骨细胞的细胞增殖;双荧光素酶报告实验分析miR-23a-3p和PTEN的靶向关系;RT-PCR技术检测共培养细胞中miR-23a-3p、PTENmRNA、PI3KmRNA、AKTmRNA、mTORmRNA 的表达;采用 ELISA 法检测 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的水平;Western blotting 检测PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达。结果 与NC组相比,OA组miR-23a-3p、PTEN、PI3K、AKT、IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著上调,而PTEN、IL-10表达显著下调（P<0.01）;相关性分析表明：miR-23a-3p与IL-6呈正相关（P<0.01）,PI3K与IL-10呈正相关,mTOR与IL-6、IL-10、补体C3、补体C4呈正相关（P<0.01或P<0.05）;加入XFC含药血清,miR-23a-3p及PI3K/AKT/mTOR通路被抑制,L-1β、IL-6、TNF-α表达水平下降、IL-10表达水平升高（P<0.01）;Model组miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR、IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平升高,PTEN、IL-10表达水平降低（P<0.01）;miR-23a-3p经过表达后,miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR、IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平显著升高,PTEN、IL-10表达水平显著降低（P<0.01或P<0.05）;XFC组IL-1β、IL-6、TNF-α表达降低,IL-10表达升高,miR-23a-3p、PI3K、AKT、mTOR表达下调,PTEN表达上调（P<0.01或P<0.05）。结论 XFC可通过下调miR-23a-3p的表达,抑制PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路的活化,改善IL-1β、IL-6,IL-10和TNF-α的表达,降低OA患者炎症反应。     

鲍曼不动杆菌荚膜通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进鼠巨噬细胞自噬和凋亡

[Abstract\]Objective: To study the capability of Acinetobacter baumannii with different thickness capsules induce Raw 264.7 cell autophagy and apoptosis, and its potential mechanisms. Methods: A baumannii was isolated from the sputum of patients with pneumonia. The bacterial capsule was stained by Congo red staining, and the bacterial strains with significantly different capsule thickness were selected for subsequent study. Raw 264.7 cells were infected with thick capsular strain (Ab H strain) or thin capsular strain (Ab B strain), and the cells were harvested at 1 h, 3 h and 6 h after infection. The expression of autophagy related proteins LC 3 and Beclin 1, as well as the phosphorylation levels of PI3K, Akt and mTOR were determined by Western blotting. Flow cytometry was used to determine the reactive oxygen species(ROS) production and apoptosis rate. Results: After A. baumannii was stained with Congo red, the cells were shown purple black, the background was red, and the capsule was not stained. The bacterial capsule thickness was clearly judged. Two strains with significant differences in capsular thickness were grouped, namely thick capsular strain (Ab H strain) and thin capsular strain (Ab B strain). The expression of autophagy related protein Beclin 1 of Raw 264.7 cells induced by Ab H strain were significantly higher than that of Ab B strain (P<0.05), and the apoptosis rate of Raw 264.7 cells induced by Ab H strain was also significantly higher than that of Ab B strain (P<0.05). Two strains of A. baumannii could induce a significant increase in the production of ROS in Raw 264.7 cells (P<0.05), and the ability of Ab H strain to induce ROS production was significantly higher than that of Ab B strains (P<0.05). After Raw 264.7 cells were infected with two strains respectively, the phosphorylation levels of PI3K, Akt and mTOR were significantly inhibited, and the inhibition increased when the time prolonged (P<0.05). Conclusion: A. baumannii could induce autophagy and apoptosis of Raw 264.7 cells, and the induction ability is positively correlated with bacterial capsule thickness. A. baumannii with thick capsule has a stronger ability to induce ROS production in Raw 264.7 cells and inhibit the activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, which ultimately enhances autophagy and apoptosis of Raw 264.7 cells.     

miR-92b与PI3K/Akt在糖尿病肾病中相关性的初步研究

目的 探讨miR-92b 与信号通路PI3K/Akt 在糖尿病肾病中的相关性。方法 选取8 周龄的C57BL/6 雄性小鼠12 只,随机分为正常对照组和糖尿病肾病组,利用枸橼酸钠建立糖尿病肾病小鼠模型;选取人肾小管上皮HK-2 细胞12 瓶,随机分为高糖组、低糖组和左旋葡萄糖组,用高糖刺激建立糖尿病肾病细胞模型。利用实时荧光定量PCR 检测小鼠肾脏组织和细胞中miR-92b 表达水平,Western blot 检测小鼠肾脏组织和细胞中Akt 和PAkt 的表达水平。结果 糖尿病肾病组和高糖组miR-92b 表达水平明显低于对照组（P<0.05）,而P-Akt/Akt 表达水平明显高于对照组（P＜0.05）。将信号通路PI3K/Akt 抑制剂LY294002 加入到高糖诱导的糖尿病肾病细胞模型中,信号通路PI3K/Akt 被抑制的同时,miR-92b 表达显著升高（P＜0.05）。结论 糖尿病肾病时,miR-92b 与PI3K/Akt 的表达呈负相关。     

Insulin enhances apoptosis induced by cisplatin in human esophageal squamous cell carcinoma EC9706 cells related to inhibition of autophagy

Background Chemoresistance is common among patients with esophageal squamous cell carcinoma （ESCC）.We investigated the effect and mechanism of insulin on enhancing anticancer functions of cisplatin in human esophageal cancer cell line EC9706.Methods The viability of EC9706 cells exposed to cisplatin was assessed using MTT assay.The times T1,when the number of living cells reached a plateau and T2,when the number of living cells reached a new plateau after the addition of insulin were found.T1 and T2 plateau cells were stained by Annexin V-FITC/PI and monodansylcadaverin （MDC）.Fluorescent microscopy was used to observe the expression of apoptosis and autophagy intuitively.Apoptotic ratio and fluorescent intensity were analysed by flow cytometry （FCM） quantitatively.Western blotting analysis was used to estimate the protein expression levels of AKT,mTOR,PI3K,PTEN,autophage related indicator LC3-Ⅱ and autophage related protein Beclin1 changes that occurred in the course of treatment.Results A larger number of typical autophagosomes were detected in EC9706 cells exposed to cisplatin.Insulin can increase the apoptosis induced by cisplatin.Apoptotic ratio of T1 plateau cells （（32.6±4.3）％） is significantly less than T2 plateau （（47.5±5.6）％）.MDC fluorescent intensity at T1 plateau （104.9±13.2） was significantly higher than intensity at T2 plateau （82.6±10.3）.After cotreatment with insulin,the expression level of LC3-Ⅱ,Beclin1 and PTEN in T2 plateau cells were significantly downregulated,but AKT,mTOR and PI3K expressions significantly upregulated compared with T1 plateau.Conclusions Insulin could enhance cisplatin-induced apoptosis in human esophageal squamous cell carcinoma EC9706 cells related to inhibition of autophagy.The activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway induced by insulin resulted in the suppression of autophagy in EC9706 cells,which may be attributed to the anticancer effects of cisplatin.     

抑制miR-30a/HMGA2介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗诱导的细胞凋亡的作用

目的：探讨微小RNA(microRNA,miR)-30a/高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗(以下简称化疗)药物诱导的细胞凋亡的影响。方法：随机选取30例经化疗药物治疗后表现为化疗敏感和化疗抵抗的骨肉瘤患者组织,分为化疗敏感组(n=15)和化疗抵抗组(n=15),采用real-time PCR检测两组中miR-30a和HMGA2的mRNA表达水平,以及骨肉瘤细胞U2-OS经不同浓度的化疗药物(顺铂、阿霉素、氨甲蝶呤)处理后miR-30a的mRNA表达水平;采用蛋白质印迹法检测细胞内自噬相关因子Beclin 1,自噬微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、自噬抑制因子P62的表达情况。在骨肉瘤细胞U2-OS中转染miR-30a模拟物和抑制剂,构建miR-30a高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况;采用单丹磺酰尸胺(monodansylcada,MDC)染色法检测细胞内自噬水平,ROS荧光探针-二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)检测细胞内ROS水平,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡程度,线粒体膜电位荧光探针JC-1检测细胞线粒体氧化损伤程度;采用双荧光素酶法检测miR-30a与HMGA2的相互作用,同时通过转染HMGA2模拟物和HMGA2-shRNA干扰质粒载体,构建HMGA2高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况。结果：化疗抵抗组中miR-30a的mRNA水平显著低于化疗敏感组(P<0.05),HMGA2的表达与miR-30a相反(均P<0.05)。在相对低浓度(5 μml/L)的化疗药物刺激下,骨肉瘤细胞U2-OS内的miR-30a mRNA表达下调,Beclin 1和LC3B均显著上调(均P<0.01),P62显著下调(P<0.01)。在miR-30a高表达组中,与对照组相比,Beclin 1和LC3B的表达水平与miR-30a明显下降(P<0.05),P62的表达水平明显升高(P<0.05),在miR-30a低表达组中则相反;在经过化疗药物处理后的miR-30a高表达组中,细胞自噬水平更低,细胞存活率更低,ROS水平更高,线粒体氧化损伤程度更高,细胞凋亡水平更高(均P<0.05),miR-30a低表达组则相反(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测验证了miR-30a与HMGA2的靶向互补配对关系;与对照组相比,HMGA2高表达组中Beclin 1和LC3B的表达水平与HMGA2明显升高(P<0.05),P62的表达水平明显下降(P<0.05),在HMGA2低表达组中则相反。结论：积极发挥miR-30a/HMGA2抑制骨肉瘤细胞自噬的功能,能够破坏细胞应对ROS介导的自噬与凋亡的平衡,增强化疗药物对细胞的杀伤作用。     

阿托伐他汀抑制脑胶质瘤细胞的增殖和促进凋亡：基于上调miR-146a表达与抑制PI3K/Akt信号通路

目的 探究阿托伐他汀（AVT）对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响及其对miR-146a/PI3K/Akt信号通路的作用。方法 将人脑胶质瘤细胞U251分为4组：对照组（Conrtrol）、AVT组、AVT+转染miR-146a无关片段组（AVT+miR-146a NC）、AVT+转染miR-146a干扰组（AVT+miR-146a inhibitor）。Control组不加任何药物,AVT组加入8.0 μmol/L 的AVT,AVT+miR-146a NC组转染miR-146a NC后加入8.0 μmol/L 的AVT,AVT+miR-146a inhibitor组转染miR-146a inhibitor后加入8.0 μmol/L 的AVT。RT-PCR检测miR-146a表达,MTT检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移情况,Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达。结果 药物干预48 h,与Control组相比,AVT组细胞miR-146a表达、细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）,细胞增殖率、侵袭指数、迁移指数、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均明显降低（P<0.01）。与AVT组相比,AVT+miR-146a inhibitor组细胞miR-146a表达、细胞凋亡率均明显降低（P<0.01）,细胞增殖率、侵袭指数、迁移指数、p-PI3K 和p-Akt蛋白表达均明显升高（P<0.01）,AVT+miR-146a NC组上述指标无显著性差异（P>0.05）。结论 AVT能够抑制人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移,促进细胞凋亡,其机制与上调miR-146a表达,抑制PI3K/Akt信号通路相关。