组织激肽释放酶在糖尿病视网膜病变患者血清中的变化及其调节血管新生机制

目的　检测组织激肽释放酶（ｔｉｓｓｕｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ,ＴＫＬＫ）、血管内皮细胞生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）和可溶性细胞间黏附分子-１（ｓｏｌｕｂｌｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｎｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌ-１,ｓＩＣＡＭ-１）在糖尿病视网膜病变（ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＤＲ）患者血清中的变化,观察ＴＫＬＫ在低氧条件下对人视网膜微血管内皮细胞（ｈｕｍａｎｒｅｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＨＲＭＥＣｓ）中ＶＥＧＦ和ＩＣＡＭ-１表达的影响。方法　收集２型糖尿病患者６０例,按照ＤＲ分期标准将患者分为糖尿病无ＤＲ组（ＤＭ组）、非增生性ＤＲ组（ＮＰＤＲ组）和增生性ＤＲ组（ＰＤＲ组）,收集同期在本院体检的志愿者作为对照组,每组２０例。ＥＬＩＳＡ法检测血清中ＴＫＬＫ、ＶＥＧＦ和ｓＩＣＡＭ-１的水平。体外ＨＲＭＥＣｓ分别进行常氧和低氧培养,不同浓度重组ＴＫＬＫ处理后,检测细胞增殖、凋亡以及ＶＥＧＦ和ＩＣＡＭ-１的表达。结果　ＤＭ、ＮＰＤＲ和ＰＤＲ组患者血清中ＴＫＬＫ、ＶＥＧＦ和ｓＩＣＡＭ-１水平明显高于对照组,４组总体差异有统计学意义（Ｆ＝２８．８０５,Ｐ＝０．００２;Ｆ＝３２．０４１,Ｐ＝０．００２;Ｆ＝２６．１６９,Ｐ＝０．００１）;ＰＤＲ患者血清中ＴＫＬＫ、ＶＥＧＦ和ｓＩＣＡＭ-１水平显著高于ＤＭ和ＮＰＤＲ组（均为Ｐ＜０．００１）。ＴＫＬＫ与ＶＥＧＦ（ｒ＝０．６２３,Ｐ＜０．０１）和ｓＩＣＡＭ-１水平（ｒ＝０．５９８,Ｐ＜０．０１）均呈正相关。１０μｇ?ｍＬ－１ｒｈＴＫＬＫ可显著抑制低氧诱导的ＨＲＭＥＣｓ增殖以及ＶＥＧＦ和ＩＣＡＭ-１的表达,并可促进细胞凋亡（Ｐ＜０．０５）。结论　ＴＫＬＫ通过与ＶＥＧＦ和ＩＣＡＭ-１相互作用而影响ＤＲ的进展。     

糖尿病视网膜前膜中ICAM-1及Mac-1的免疫组织化学研究

目的 观察增生型糖尿病视网膜病变（ＰＤＲ）的纤维增生视网膜前膜（ＥＲＭ）中粘附分子（ＩＣＡＭ－１,Ｍａｃ－１）的表达。方法 用免疫组织化学方法对９例ＰＤＲ患者行玻璃体切割术时剥离的视网膜前膜进行观察。其中糖尿病视网膜病变Ⅳ期４例,Ⅴ期５例。结果 ＩＣＡＭ－１和Ｍａｃ－１在８例视网膜前膜中表达,表达率８９％,ＩＣＡＭ－１和Ｍａｃ－１阳性表达在糖尿病分型及分期中无明显差别。结论 ＩＣＡＭ－１和Ｍａｃ－１在增生型糖尿病视网膜中表达,糖尿病视网膜病变的发病中有粘附分子参与。     

Notch信号对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞凋亡的保护作用

目的　探讨Ｎｏｔｃｈ１信号对高糖情况下多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-１［Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ-ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓ-１,ＰＡＲＰ-１］和核因子-κＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ,ＮＦ-κＢ）的ｐ５０亚单位（ＮＦ-κＢ５０）介导的人视网膜血管内皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＲＶＥＣｓ）凋亡的抑制作用。方法　体外培养人ＲＶＥＣｓ及ＨＥＫ２９３Ｔ细胞,并进行传代,同时构建高糖（葡萄糖浓度为３０ｍｍｏｌ?Ｌ－１）人ＲＶＥＣｓ细胞模型。构建ｐＣＭＶ-Ｓｃｒｉｐｔ-Ｎｏｔｃｈ１和ｐＣＭＶ-Ｓｃｒｉｐｔ-ＤＬＬ４质粒,酶切鉴定后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法检测重组质粒表达目的基因的效果,同时合成ｓｉＮｏｔｃｈ１并转染高糖培养的人ＲＶＥＣｓ,ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法检测Ｎｏｔｃｈ基因敲除效果。应用免疫共沉淀及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法检测ｓｉＮｏｔｃｈ１对高糖下ＰＡＲＰ-１和ＮＦ-κＢ的相互作用的影响;应用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法检测高糖条件下Ｎｏｔｃｈ１／ＤＬＬ４上调和下调后人ＲＶＥＣｓ中ＰＡＲＰ-１、ｐ-ＡＫＴ、ＮＦ-κＢ５０及ｃａｓｐａｓｅ-３的表达变化。结果　人ＲＶＥＣｓ复苏后２４ｈ贴壁,细胞呈扁平梭形,３ｄ左右细胞开始融合呈铺路石样,单层生长,铺满瓶底,并可见接触抑制现象。免疫共沉淀结果显示高糖组培养的人ＲＶＥＣｓ其ＰＡＲＰ-１结合的ＮＦ-κＢ５０的量较正常对照组增加;将ｓｉＮｏｔｃｈ１转染高糖组培养的人ＲＶＥＣｓ后或同时加入ＤＬＬ４,则人ＲＶＥＣｓ中ＰＡＲＰ-１结合的ＮＦ-κＢ５０的量较前增加显著,提示Ｎｏｔｃｈ能抑制高糖下ＰＡＲＰ-１和ＮＦ-κＢ５０的相互作用。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测结果显示高糖条件下,Ｎｏｔｃｈ１和ＤＬＬ４上调后其ＰＡＲＰ-１及ｃａｓｐａｓｅ-３表达量较前显著降低;Ｎｏｔｃｈ１下调后其ＰＡＲＰ-１及ｃａｓｐａｓｅ-３表达量较前增加;ｐ-ＡＫＴ表达量则相反;提示Ｎｏｔｃｈ信号能抑制高糖诱导的ＰＡＲＰ-１及ｃａｓｐａｓｅ-３的激活及表达。结论　高糖情况下Ｎｏｔｃｈ信号可调控ＰＡＲＰ-１和ＮＦ-κＢ的相互作用,并抑制ＰＡＲＰ-１激活引起的人ＲＶＥＣｓ的凋亡。     

β-榄香烯对糖尿病大鼠视网膜中肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的　探讨β-榄香烯对糖尿病大鼠视网膜肿瘤坏死因子-α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ-α,ＴＮＦ-α）表达的影响。方法　１０周龄ＳＤ大鼠３６只,随机分为６组,除Ａ组（每只大鼠腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液）外其余组腹腔注射链脲佐菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ,ＳＴＺ）制成糖尿病大鼠模型,成模６周后,Ｃ组每只大鼠双眼球周给予空白乳剂５μＬ,Ｄ组双眼球周给予β-榄香烯５μＬ,Ｅ组每只大鼠同时双眼球内给予空白乳剂５μＬ,Ｆ组双眼球内给予β-榄香烯５μＬ,Ｂ组未采取局部注射作为对照。末次给药４８ｈ后处死大鼠,取眼球固定视网膜行免疫组织化学法检测视网膜中ＴＮＦ-α的表达情况;提取视网膜蛋白,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测ＴＮＦ-α蛋白的表达情况。结果　免疫组织化学法检测结果显示:Ａ组视网膜未见阳性染色,Ｂ组视网膜全层可见阳性表达,Ｃ组及Ｅ组阳性表达分布与Ｂ组相同,而Ｄ组及Ｆ组棕色阳性表达下降,其中Ｆ组更显著。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测结果显示:Ｃ组及Ｅ组ＴＮＦ-α蛋白的表达与Ａ组相比差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,Ｂ组较Ａ组增高（Ｐ＜０．０１）,而Ｄ组及Ｆ组表达与Ｂ组差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。结论　β-榄香烯球周及球内注射均可降低糖尿病大鼠视网膜内ＴＮＦ-α的表达,且眼内注射效果更好。     

莱菔硫烷对链脲佐霉素诱导的大鼠糖尿病白内障的治疗作用

目的　探讨莱菔硫烷（Ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ,ＳＦＮ）对链脲佐霉素诱导的大鼠糖尿病白内障的治疗作用。方法　将７２只雄性ＳＤ大鼠随机分为正常对照组、模型组、ＳＦＮ低剂量干预组、ＳＦＮ中剂量干预组、ＳＦＮ高剂量干预组和苄达赖氨酸（ｂｅｎｄａｚａｃｌｙ-ｓｉｎｅ,ＢＤＬ）组,每组１２只,后５组腹腔一次性注射链脲佐菌素（６５ｍｇ·ｋｇ－１）建立糖尿病白内障模型,从造模成功当日开始,ＳＦＮ低、中、高剂量干预组分别给予５０ｍｇ·ｋｇ－１、１００ｍｇ·ｋｇ－１、２００ｍｇ·ｋｇ－１ＳＦＮ灌胃,ＢＤＬ组以２００ｍｇ·ｋｇ－１ＢＤＬ灌胃,其余２组用同体积的生理盐水,每天１次,治疗１２周后,测定空腹血糖水平,裂隙灯观察大鼠晶状体变化并对其混浊度进行分级,分离晶状体并制备成匀浆液,测定丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ,ＭＤＡ）含量及超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ,ＳＯＤ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ-ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ,ＧＳＨ-Ｐｘ）、过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ,ＣＡＴ）活性,ＥＬＩＳＡ检测糖基化终末产物（ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ,ＡＧＥｓ）含量,行Ｗｅｓｔｅｒｎ-ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测醛糖还原酶（ａｌｄｏｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ,ＡＲ）表达。结果　用药后１２周,ＳＦＮ中、高剂量干预组大鼠空腹血糖明显低于模型组（均为Ｐ＜０．０５）,而ＳＦＮ低剂量干预组、ＢＤＬ组仍处于高血糖水平,与模型组比较,差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。正常对照组大鼠晶状体透明,无混浊发生;而模型组大鼠晶状体出现雾状混浊、核混浊,分级为Ⅲ ～Ⅴ级,其混浊度显著高于正常对照组（Ｐ＜０．０１）。与模型组比较,ＳＦＮ中、高剂量干预组晶状体混浊度等级差异明显减轻（均为Ｐ＜０．０５）,而ＳＦＮ低剂量干预组、ＢＤＬ组晶状体混浊度等级与模型组相比,差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。与正常对照组比较,模型组大鼠晶状体组织中ＭＤＡ含量升高,而ＳＯＤ、ＧＳＨ-Ｐｘ、ＣＡＴ活性降低,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。经中、高剂量ＳＦＮ或ＢＤＬ处理后,ＭＤＡ含量较模型组减少（均为Ｐ＜０．０５）,ＳＯＤ、ＧＳＨ-Ｐｘ、ＣＡＴ活性较模型组增加（均为Ｐ＜０．０５）。而ＳＦＮ低剂量干预组上述指标与模型组相比,差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。模型组大鼠晶状体组织中ＡＧＥｓ含量较正常对照组升高（Ｐ＜０．０１）;相对于模型组,经中、高剂量ＳＦＮ处理１２周后,ＡＧＥｓ含量明显减少（均为Ｐ＜０．０５）;而ＳＦＮ低剂量干预组、ＢＤＬ组ＡＧＥｓ含量与模型组比较,差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。运用Ｗｅｓｔｅｒｎ-ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测各组大鼠晶状体组织ＡＲ蛋白表达,结果显示:正常对照组ＡＲ蛋白呈低水平表达,模型组ＡＲ蛋白表达明显上调,与正常对照组比较,差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）;相对于模型组,经中、高剂量ＳＦＮ或ＢＤＬ处理后,ＡＲ蛋白表达水平降低（均为Ｐ＜０．０５）,而ＳＦＮ低剂量干预组ＡＲ蛋白表达水平与模型组比较,差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论　ＳＦＮ对链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病白内障有治疗作用,其机制可能与增强抗氧化能力、抑制ＡＧＥｓ产生及下调ＡＲ表达有关。     

视网膜光损伤中TIMP-1、ERK-1的表达及促红细胞生成素对其影响

目的　研究实验性光损伤小鼠视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ,ＲＰＥ）中金属蛋白酶组织抑制物-１（ｔｉｓ-ｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ-１,ＴＩＭＰ-１）及细胞外信号调节蛋白激酶１（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ-１,ＥＲＫ-１）表达的变化,以及促红细胞生成素（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ,ＥＰＯ）对其的影响,探讨ＥＰＯ对视网膜光损伤发挥保护作用的机制。方法　建立大鼠视网膜光损伤动物模型,于小鼠光照前腹腔注射重组人促红细胞生成素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｈｕｍａｎｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ,ｒｈＥＰＯ）,采用ＨＥ染色观察ＲＰＥ细胞形态学变化,免疫组织化学法检测其ＴＩＭＰ-１、ＥＲＫ-１蛋白的表达。结果　光损伤可以造成小鼠视网膜ＲＰＥ细胞渐进性的破坏。外源性的ＥＰＯ可以促进光损伤后视网膜ＲＰＥ细胞ＴＩＭＰ-１及ＥＲＫ-１表达的增加。随光照时间延长,单纯光照组ＲＰＥ细胞密度逐渐减少,光照后７ｄＲＰＥ细胞密度与正常对照组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。光照后相同时间点,ＥＰＯ处理组的ＲＰＥ细胞密度较单纯光照组稍有增加,光照后７ｄ二者差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。光照后各时间点,ＥＰＯ处理组均较单纯光照组中ＥＲＫ-１的表达明显增强（均为Ｐ＜０．０５）。光照后６ｈ、７ｄ,单纯光照组和ＥＰＯ处理组中ＴＩＭＰ-１的表达差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）;自光照后１２ｈ起至光照后９６ｈ,各时间点ＥＰＯ处理组较单纯光照组中ＴＩＭＰ-１的表达增强（均为Ｐ＜０．０５）。ＥＰＯ处理组ＲＰＥ中ＴＩＭＰ-１的表达与ＥＲＫ-１的表达正相关（ｒ＝０．７９,Ｐ＝０．０３）。结论　外源性ＥＰＯ通过增加光损伤后视网膜ＲＰＥ细胞ＴＩＭＰ-１的表达,有利于ＭＭＰｓ／ＴＩＭＰ平衡的恢复,进一步证实ＥＰＯ对视网膜光损伤的保护作用。ＥＰＯ对ＲＰＥ细胞ＴＩＭＰ-１分泌和表达的调节可能经由ＭＡＰＫ途径。     

多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1通过激活NF-κB途径导致高糖人视网膜血管内皮细胞凋亡

目的　探讨多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-１［ｐｏｌｙ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ-ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓ-１,ＰＡＲＰ-１］和核因子-κＢ（ｎｕ-ｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ-κＢ,ＮＦ-κＢ）在高糖人视网膜血管内皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＲＶＥＣ）中的相互作用及其在人ＲＶＥＣ中的表达定位及作用机制。方法　体外培养人ＲＶＥＣ及ＨＥＫ２９３Ｔ细胞,并进行传代,同时构建高糖人ＲＶＥＣ细胞模型。构建ＰＡＲＰ-ＥＧＦＰ及Ｆｌａｇ-ＮＦ-κＢ质粒,酶切鉴定后转染高糖培养的人ＲＶＥＣ,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测重组质粒表达目的基因的效果,并应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法和免疫共沉淀法检测高糖人ＲＶＥＣ中ＰＡＲＰ-１和ＮＦ-κＢ的相互作用。ＰＡＲＰ-ＥＧＦＰ和Ｆｌａｇ-ＮＦ-κＢ质粒共转染人ＲＶＥＣ,激光共聚焦扫描显微镜检测ＰＡＲＰ-１和ＮＦ-κＢ在高糖人ＲＶＥＣ中的定位及其相互作用。结果　人ＲＶＥＣ复苏后２４ｈ贴壁,细胞呈扁平梭形,３ｄ左右细胞开始融合呈铺路石样,单层生长,铺满瓶底,并可见接触抑制现象。成功构建ＰＡＲＰ-ＥＧ-ＦＰ及Ｆｌａｇ-ＮＦ-κＢ质粒,并有效表达目的基因。免疫共沉淀结果显示ＰＡＲＰ-１和ＮＦ-κＢ是相互作用的蛋白质,高糖组ＮＦ-κＢｐ５０的条带比正常对照组明显增粗,并且高糖情况下ＰＡＲＰ-１结合ＮＦ-κＢ的量较正常对照组明显增加。激光共聚焦扫描显微镜结果显示ＰＡＲＰ和ＮＦ-κＢ均表达于正常的人ＲＶＥＣ的细胞核和核周区域,当受到高浓度葡萄糖影响后,ＰＡＲＰ-１和ＮＦ-κＢ均集中表达于细胞核内,尤以ＮＦ-κＢ最显著。结论　ＰＡＲＰ-１和ＮＦ-κＢ是相互作用的蛋白质,血糖增高时,ＰＡＲＰ-１可能进入细胞核内并结合同时进入细胞核的ＮＦ-κＢ,激活ＮＦ-κＢ信号通路,引起ＲＶＥＣ凋亡,导致ＤＲ的发生。     

补肾活血中药对大鼠慢性高眼压模型视网膜神经节细胞PI3K/Akt信号转导通路p-Akt表达的影响

目的　观察补肾活血中药对大鼠慢性高眼压（ｅｌｅｖａｔｅｄｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅ,ＥＩＯＰ）模型视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓ,ＲＧＣ）ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号转导通路ｐ-Ａｋｔ表达的影响。方法　３０只ＳＤ大鼠随机分成３组:对照组、模型组和给药组,模型组和给药组建立ＥＩＯＰ模型。给药组造模后每天予复方丹参片和杞菊地黄丸的混悬液灌胃,每天１次,连续８周,对照组、模型组每天予生理盐水灌胃。记录造模前、造模后即刻、造模后８周的眼压;光镜下观察各组视网膜厚度和ＲＧＣ数量,电镜下观察视网膜超微结构,免疫组织化学法检测视网膜内ｐ-Ａｋｔ的表达。结果　造模后８周眼压与造模后即刻相比,给药组有降低趋势,差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。造模后８周,给药组与模型组ＲＧＣ数量均低于对照组,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）;对照组视网膜厚度与给药组相比,差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）,而对照组与模型组相比,差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）;给药组ＲＧＣ数量及视网膜厚度均高于模型组,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。电镜下ＲＧＣ超微结构显示,模型组损伤明显,给药组较模型组有所改善。视网膜ｐ-Ａｋｔ表达免疫组织化学结果分析显示,给药组ｐ-Ａｋｔ阳性染色总面积、平均光密度、积分光密度值与模型组相比,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）,给药组黑度（１３９．９７±１１．７９）虽高于模型组（１３７．９５±６．１３）,但差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论　补肾活血中药用于ＳＤ大鼠慢性ＥＩＯＰ模型,能降低眼压,提高ＲＧＣ数量及改善超微结构,增加视网膜厚度,上调ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号转导通路中ｐ-Ａｋｔ的表达。     

CLINICAL STUDIES OF PRIMARY ANGLE CLOSURE GLAUCOMA

ＣＬＩＮＩＣＡＬＳＴＵＤＩＥＳＯＦＰＲＩＭＡＲＹＡＮＧＬＥＣＬＯＳＵＲＥＧＬＡＵＣＯＭＡＷａｎｇＮｉｎｇｌｉ王宁利，ＺｈｏｕＷｅｎｂｉｎ周文炳，ＹｅＴｉａｎｃａｉ叶天才，ＷｕＺｈｏｎｇｙａｏ吴中耀，ＬｉｕＨｕａ刘华ＣＬＩＮＩＣＡＬＳＴＵＤＩＥＳＯＦＰ...     

罗格列酮对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的　观察过氧化物酶体增生物激活受体-γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ-γ,ＰＰＡＲ-γ）激动剂罗格列酮对链脲佐菌素诱导的早期糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ,ＤＭ）大鼠视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓ,ＲＧＣｓ）凋亡的影响,进而从分子学水平上阐明ＰＰＡＲ-γ激动剂对糖尿病视网膜病变（ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＤＲ）的保护作用,为预防及早期治疗ＤＲ提供一种新思路。方法　选择９０只健康的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为三组:正常对照组、ＤＭ＋罗格列酮组和ＤＭ组,进一步将每组大鼠分为给药后４周、８周和１２周三个时间点进行观察。采用一次性腹腔注射５０ｍｇ?ｋｇ－１链脲佐菌素的方法建立ＤＭ大鼠模型。自ＤＭ模型成模后第３天起,ＤＭ＋罗格列酮组大鼠每天给予罗格列酮３ｍｇ?ｋｇ－１灌胃,正常对照组和ＤＭ组每天给予等体积的生理盐水灌胃。于给药后４周、８周和１２周处死各组大鼠,处死前测各组大鼠的血糖和体质量,然后摘除左眼球制成眼杯,采用ＴＵＮＥＬ法测定各组大鼠视网膜上ＲＧＣｓ的凋亡指数,并作对比。结果　给药后４周、８周和１２周,ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠血糖水平均明显高于正常对照组（均为Ｐ＜０．０１）;ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠的体质量均较正常对照组降低（均为Ｐ＜０．０５）。正常对照组大鼠ＲＧＣ层上仅见少量的凋亡细胞;各时间点ＤＭ＋罗格列酮组大鼠ＲＧＣｓ的凋亡指数较ＤＭ组明显降低（均为Ｐ＜０．０１）;ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠ＲＧＣｓ的凋亡指数均明显高于正常对照组（均为Ｐ＜０．０１）。结论　外源性ＰＰＡＲ-γ激动剂罗格列酮能够抑制ＤＭ大鼠视网膜上ＲＧＣｓ的凋亡,对早期ＤＭ大鼠视网膜具有保护作用,有望成为ＤＲ新的治疗手段。     

色素上皮衍生因子的表达与早期糖尿病大鼠视网膜血管形态学的改变

目的探讨色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)mRNA在不同病程糖尿病大鼠模型视网膜中的表达水平及其与早期糖尿病大鼠视网膜血管病变之间的关系。方法 48只健康Wistar大鼠随机分成糖尿病1个月组(DM1)、3个月组(DM3)和6个月组(DM6)与正常对照1个月组(CON1)、3个月组(CON3)、6个月组(CON6),每组各8只。链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠动物模型,分别于造模后1个月、3个月、6个月行视网膜血管铺片和PEDFmRNA的原位杂交,观察大鼠视网膜微血管的改变和PEDFmRNA表达情况。结果 (1)DM3和DM6组可见毛细血管迂曲,走形不规则,管腔粗细不均,以DM6组病变最重,可见无细胞毛细血管。(2)周细胞数量:DM1组与CON1组相比差异无统计学意义(CON1组6.45±0.64,DM1组6.52±0.75,P>0.05),DM3及DM6组均较CON3组、CON6组明显减少(CON3组6.51±0.70、DM3组6.06±0.65,CON6组6.47±0.60、DM6组5.45±0.80),差异均有统计学意义(均为P<0.05)。(3)CON1和DM1组PEDFmRNA在节细胞层、内核层及RPE层均有阳性细胞表达,CON1组64±10、DM1组53±8,差异无统计学意义(P>0.05);CON3组和DM3组PDEFmRNA在节细胞层、内核层、RPE层阳性反应细胞表达减少,CON3组68±11、DM3组49±12,差异有统计学意义(P<0.05);CON6组和DM6组PEDFmRNA仅在内核层和节细胞层表达,RPE层只见极少阳性细胞,CON6组58±8、DM6组34±14,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论糖尿病视网膜病变的发生、发展与周细胞数量减少、PEDFmRNA表达降低密切相关,两者的表达同糖尿病视网膜病变的发生、发展存在时效和空间关系。     

重组腺相关病毒载体介导的色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠视网膜的影响

目的以重组腺相关病毒载体（rAAV）介导色素上皮衍生因子（PEDF）转染糖尿病大鼠视网膜，观察其表达及其对血管内皮生长因子（VEGF）和视网膜微血管的影响。方法 雄性 Wister大鼠链脲佐菌素腹腔注射诱导糖尿病模型。随机分为1（DM1）、3（DM3）、6（DM6）个月组。右眼玻璃体注射rAAV2-CMV-hPEDF作为治疗组，左眼注射rAAV2-CMV-GFP作为自身对照眼。正常大鼠右眼假注射，左眼不注射。应用半定量逆转录聚合酶链反应和Western blot测定VEGF和PEDF的mRNA和蛋白的表达情况，应用视网膜血管铺片观察视网膜微血管的变化。结果注射后大鼠治疗眼视网膜hPEDF mRNA表达不断增强，持续到6个月，达到顶峰。PEDF蛋白表达亦不断增加，与同时间点对照眼相比差异有统计学意义（t=4.292，10.721，16.692；P＜0.01）。治疗组各时间点视网膜VEGF mRNA及蛋白表达量相互间无统计学意义（t=1.621，0.698，0.758；P＞0.05），均显著高于正常对照组（t=5.171，6.857，7.542；P＜0.05），但与同时间点自身对照眼相比表达显著降低（t=2.343，3.263，4.455；P＜0.01）。糖尿病大鼠治疗眼与自身对照眼视网膜微血管形态在1个月时与正常对照组视网膜相比无显著差异，但3个月与6个月时治疗眼与自身对照眼相比视网膜毛细血管损伤改变明显减轻。结论 rAAV2-CMV-hPEDF玻璃注射可增加糖尿病大鼠视网膜PEDFmRNA和蛋白水平表达，改善其早期视网膜微血管的损害，并抑制VEGF的表达，其调节在mRNA水平。 （中华眼底病杂志，2008，24：259-264）     

糖尿病大鼠视网膜中血管内皮生长因子的表达

目的 利用糖尿病大鼠动物模型，通过大鼠视网膜中血管内皮生长因子(vascular endothellal growth fac—tor，VEGF)的表达情况，探讨VEGF在糖尿病视网膜病变(Diabetlc Retinopathy，DR)发展过程中作用机理。方法 复制链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)糖尿病大鼠动物模型，取不同组、不同时期大鼠视网膜，利用免疫组织化学及原位杂交方法，检测VEGF蛋白质及mRNA的表达情况。结果 正常对照组(H)、血糖恢复组及糖尿病1月组(H1)大鼠视网膜均无VEGF蛋白质及mRNA的阳性表达。糖尿病3月组(M3)未见VEGF mRNA表达，而在内核层及节细胞层VEGF蛋白表达阳性(34％)，此表达与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性细胞相同。糖尿病5月组(M5)VEGFmRNA表达阳性率为67％，表达位于视网膜各层，内界膜中的表达与GFAP免疫组化阳性分布相同，VEGF蛋白质表达强阳性(89％)，主要位于内核层、节细胞层的细胞及血管上。结论 VEGF在STZ大鼠视网膜中的表达与病程相关，而且VEGF的产生存在着自分泌和旁分泌多种途径。     

VEGF和PEDF在糖尿病大鼠视网膜脉络膜中的表达

目的:通过免疫组织化学法比较正常大鼠及糖尿病大鼠视网膜、脉络膜组织中VEGF和PEDF的表达情况及相互关系。方法:选取健康雄性Wistar大鼠,随机分成糖尿病组和正常对照组(M0),用链脲佐菌素大剂量一次性腹腔注射诱导1型糖尿病模型。成模后大鼠随机平均分成1mo(M1),2mo(M2),3mo(M3)及5mo(M5)组,免疫组织化学法检测VEGF和PEDF在各组大鼠视网膜及脉络膜的表达。结果:M1大鼠VEGF在视网膜及脉络膜的表达均与M0无明显差别;M2大鼠VEGF在脉络膜有阳性表达(33.3%),在视网膜的表达与M0无明显差别;M3大鼠VEGF在脉络膜有阳性表达(55.6%),在视网膜的表达与M0比较有明显差别(33.3%);M5大鼠VEGF在视网膜及脉络膜阳性表达(88.9%);M1和M2大鼠视网膜PEDF表达与M0比较无明显差别,各组脉络膜均无PEDF表达;M3和M5大鼠视网膜PEDF表达均较M0减弱,且随病程延长表达逐渐减弱(P<0.05),各组脉络膜均无PEDF表达;随着糖尿病病程延长,VEGF/PEDF比值逐渐增大,与M0相比有显著统计学差异(P<0.01)。结论:随着糖尿病病程的延长,VEGF在视网膜及脉络膜的表达均逐渐增强,而PEDF与之相反,在视网膜的表达逐渐减弱,且VEGF/PEDF比值逐渐增大,提示VEGF和PEDF均与糖尿病病程密切相关。     

玻璃体腔注射抗氧化剂NAC对早期糖尿病大鼠视网膜的保护作用

目的:探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对早期糖尿病大鼠视网膜保护作用的机制。方法:健康成年雄性SD大鼠30只,按照随机分配的原则分为正常对照组(CON组,n=10),糖尿病组(DM组,n=20)。DM组禁食12h后,按照60mg/kg体质量剂量一次性左下腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)溶液,CON组注入等量的柠檬酸缓冲溶液。用药72h后,鼠尾静脉取血检测血糖,≥16.7mmol/L者定为糖尿病模型动物。成模大鼠随机分为糖尿病对照组(D组)和NAC治疗组(N组)。模型建立后,N组大鼠每周通过玻璃体腔注射4μL 1.6μg/μL的NAC,CON组、D组大鼠则给予玻璃体腔注射4μL 0.01mmol/L的磷酸缓冲盐溶液(pbs)不限饮食水,分组喂养。每周记录各组大鼠体质量及血糖。糖尿病成模后2mo,处死实验动物,通过HE染色法,检测各组大鼠视网膜内核层厚度;通过免疫荧光法,检测各组大鼠视网膜神经节细胞数量及视网膜中色素上皮衍生因子(PEDF)水平。结果:N组视网膜内核层厚度较D组厚度增加(P<0.01),与CON组厚度无差异(P>0.05)。与CON组相比,D组视网膜神经节细胞数量减少(P<0.01),N组视网膜神经节细胞略减少(P>0.05)。D组视网膜神经节细胞较N组减少(P<0.01)。与CON组相比,D组PEDF表达下降(P<0.01),N组PEDF表达略下降(P>0.05)。D组PEDF表达较N组下降(P<0.01)。结论:抗氧化剂NAC对早期糖尿病大鼠视网膜组织有保护作用的机制可能是通过上调视网膜中PEDF水平。     

糖尿病大鼠视网膜PEDF表达与神经退行性改变

目的观察色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)在糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜中的表达以及视网膜神经细胞损伤情况,探讨早期糖尿病视网膜病变发病机制。方法 72只SD大鼠随机分为正常对照组、DM0.5个月组、DM1个月组、DM3个月组及DM5个月组。DM组大鼠利用链脲佐菌素建立DM模型。RT-PCR及Westernblot检测各组大鼠视网膜PEDFmRNA及蛋白的表达,TUNEL法行原位细胞凋亡检查,透射电镜观察视网膜超微结构改变。结果 PEDFmRNA及蛋白在正常大鼠视网膜的表达量分别为0.410±0.016、0.420±0.030;DM0.5个月组表达未见明显改变,分别为0.399±0.032、0.399±0.032,与正常对照组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05);DM1个月组PEDFmRNA及蛋白表达开始减少,分别为0.344±0.044、0.375±0.028,与正常对照组比较,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01);DM5个月组PEDFmRNA及蛋白表达量约为正常对照组的1/2,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。TUNEL染色显示凋亡阳性细胞主要位于视网膜神经节细胞层,随病程延长逐渐增多。透射电镜显示DM0.5个月组仅视网膜神经纤维层发生轻微超微结构损伤,随病程延长,视网膜全层发生神经退行性病变。结论在发生临床可见的微血管病变前,DM大鼠已发生视网膜神经退行性改变,PEDF在视网膜的表达逐渐减少,提示其可能在早期糖尿病视网膜病变的发生、发展中发挥重要作用。     

氩离子激光光凝前后糖尿病大鼠眼内组织中色素上皮衍生因子的表达

目的:观察氩离子激光视网膜光凝后糖尿病大鼠眼玻璃体及视网膜组织内色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)蛋白质表达的变化。方法:选用先天性糖尿病GK大鼠20只,对所有大鼠左眼施行氩离子激光视网膜光凝,右眼不进行光凝,作为自体对照。激光光凝后3d处死动物,取出眼球,WesternBlot和免疫组织化学染色检测玻璃体和视网膜组织中PEDF蛋白质表达的变化。结果:氩离子激光视网膜光凝后糖尿病大鼠玻璃体和视网膜中PEDF蛋白的表达均明显升高(P<0.01);且PEDF蛋白主要存在于RPE细胞层、光感受器细胞层、外核层和神经节细胞层,内核层表达的强度低于上述4层。结论:氩离子激光光凝可以上调糖尿病大鼠玻璃体和视网膜组织PEDF表达,抑制新生血管形成,达到治疗的目的。     

单核细胞趋化蛋白-1在早期糖尿病大鼠视网膜中的表达及意义

目的　探讨单核细胞趋化蛋白 1 (MCP 1 )在早期糖尿病大鼠视网膜中的表达及其与糖尿病视网膜病变(DR)的关系。 方法　Wistar大鼠随机分为正常对照组 (NC组 )和糖尿病模型组 (DM组 ),每组 12只。大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱发糖尿病模型。8周时全部处死,采用Western免疫印迹法和免疫组织化学法,分析MCP 1在早期DM大鼠视网膜中的表达,对免疫印迹结果采用计算机图像分析系统处理。 结果　8周时,免疫印迹结果显示视网膜中MCP 1的表达DM组明显高于NC组(P<0 01),免疫组织化学法显示 8周时DM大鼠视网膜表面血管、内核层均可见MCP 1阳性着染细胞。 结论　MCP 1在视网膜组织中的表达与DR的发生有密切关系。     

血管内皮生长因子在糖尿病大鼠视网膜中的表达

目的 :观察血管内皮生长因子 (VEGF)蛋白在链脲佐菌素 (STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜中的表达情况 ,以探讨其在早期糖尿病视网膜病变 (DR)中的作用。方法 :选择健康成年Wistar大鼠 4 0只 ,随机分成正常对照组 (CON)、糖尿病 1个月组 (DM1)、糖尿病 3个月组 (DM3)及糖尿病 6个月 (DM6 )组 ,每组 10只。大鼠腹腔内注射STZ诱发大鼠糖尿病。制备大鼠视网膜石蜡切片行免疫组化ABC法染色 ,光镜观察。结果 :VEGF于CON和DM1组只表达于内核层及节细胞层部分细胞 ;病程 3个月时 ,尚可见视网膜血管的阳性反应 ;6个月时 ,阳性反应范围又扩大至视杆内节和色素上皮细胞。结论 :随病程进展 ,VEGF在视网膜中的表达呈逐渐增强的趋势 ,提示它在早期DR的发生、发展中起重要作用     

Ibrolipim对糖尿病小型猪视网膜血管内皮生长因子表达的影响

目的　观察血管内皮生长因子(VEGF)在早期糖尿病视网膜病变中的表达以及Ibrolipim (NO 1886)对 2型糖尿病小型猪血糖的影响;探讨药物Ibrolipim对视网膜VEGF的作用。 方法　采用高脂高蔗糖饲料喂养贵州小香猪,创建 2型糖尿病动物模型,并用Ibrolipim进行干预,用RT PCR、免疫组织化学和Westernblot技术检测VEGF转录和蛋白表达。 结果　正常组视网膜VEGFmRNA表达量少,免疫组织化学反应阳性较弱,VEGF蛋白表达较低;实验组视网膜VEGFmRNA表达上调,免疫组织化学反应呈强阳性 (P<0 01 ),VEGF蛋白表达增高;治疗组视网膜VEGFmRNA及VEGF蛋白表达介于其他两组之间。 结论　早期糖尿病视网膜中VEGF表达增高;Ibrolipim可通过降低血糖,改善视网膜组织缺氧,来抑制VEGFmRNA及蛋白的表达。