不同病程糖尿病大鼠视网膜VEGF和PEDF表达的动态变化

目的 检测不同糖尿病(diabetes mellitus,DM)病程大鼠视网膜VEGF mRNA、PEDF mRNA的表达和视网膜VEGF、PEDF表达强度及部位的变化情况,探讨二者间的相互关系及其对糖尿病视网膜痛变(diabetic retinopathy,DR)发生发展的相关意义,并从细胞因子角度进一步评价STZ诱导的DM大鼠作为早期DR动物模型的应用价值.方法 取64只体质量水平(180±20)g雄性SD大鼠随机分为对照组(CON组)和DM组各32只.于DM成模后2周、4周、6周、8周和10周随机抽样行实时定量PcR检测视网膜VEGF mRNA、PEDF mRNA表达强度;DM 10周时各组随机抽样,免疫组织化学染色检测视网膜VEGF及PEDF的表达强度及部位.结果 经检测,CON组视网膜有VEGF mRNA表达,表达量随时间无明显变化;DM组VEGF mRNA的表达,2周时较CON组有所增高,至6周表达量约为CON组的3倍(P<0.05),10周表达量增高到CON组的6倍(P<0.001).PEDF mRNA也表达于CON组视网膜,DM组2周时的表达量较CON组有所减少,至4周其表达量约为CON组的1/2(P<0.001),10周表达量降至CON组的1/3(P<0.001).视网膜免疫组织化学染色观察,CON组:VEGF主要分布于内核层和节细胞层,PEDF主要分布于内核层和节细胞层,其余各层也可见阳性表达;DM组VEGF表达较CON组明显增强,视网膜各层神经细胞均有强阳性表达;PEDF表达较CON组明显减弱,其分布主要位于节细胞层及内丛状层.DM组VEGF阳性表达MOD=0.545±0.083较CON组0.223±0.072增强,DM组PEDF阳性表达MOD=0.260±0.074较CON组0.329±0.056减弱,结论与正常大鼠相比,DM大鼠视网膜VEGF表达增多、PEDF减少,这可能导致视网膜出现血管渗漏和新生血管等.     

碱性成纤维细胞生长因子在糖尿病大鼠视网膜血管中的表达

目的　通过糖尿病大鼠视网膜血管铺片的原位杂交及免疫组化 ,直接证明视网膜血管中碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)蛋白质及mRNA的表达 ,并探讨bFGF在糖尿病视网膜病变 (DR)发展过程中的作用。方法　复制链脲佐菌素 (STZ)糖尿病大鼠动物模型 ,取不同组、不同时期大鼠视网膜的血管进行铺片 ,并在铺片上进行免疫组化及原位杂交 ,检测铺片的血管上bFGF蛋白质及mRNA的表达情况。结果　 ( 1)正常对照组 (M)、血糖恢复组及糖尿病 1个月组(M1 )大鼠视网膜血管的形态及周细胞数均无明显差异 ,bFGF蛋白质及mRNA均无阳性表达。 ( 2 )糖尿病 3个月组 (M3)血管周细胞数减少 (P <0 0 1) ,细胞核可见bFGFmRNA表达 ( 78% ) ,血管壁可见bFGF蛋白表达阳性 ( 5 6% )。 ( 3 )糖尿病5个月组 (M5)血管周细胞数减少 (P <0 0 1)且可见闭塞毛细血管及血栓 ,细胞核bFGFmRNA表达阳性率高于M3为 89% ,血管壁bFGF蛋白质表达也高于M3为 89%。结论　bFGF在STZ大鼠的视网膜血管中有表达 ,且随着病程的延长其表达加强。     

血管内皮生长因子在糖尿病大鼠视网膜中的表达

目的 :观察血管内皮生长因子 (VEGF)蛋白在链脲佐菌素 (STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜中的表达情况 ,以探讨其在早期糖尿病视网膜病变 (DR)中的作用。方法 :选择健康成年Wistar大鼠 4 0只 ,随机分成正常对照组 (CON)、糖尿病 1个月组 (DM1)、糖尿病 3个月组 (DM3)及糖尿病 6个月 (DM6 )组 ,每组 10只。大鼠腹腔内注射STZ诱发大鼠糖尿病。制备大鼠视网膜石蜡切片行免疫组化ABC法染色 ,光镜观察。结果 :VEGF于CON和DM1组只表达于内核层及节细胞层部分细胞 ;病程 3个月时 ,尚可见视网膜血管的阳性反应 ;6个月时 ,阳性反应范围又扩大至视杆内节和色素上皮细胞。结论 :随病程进展 ,VEGF在视网膜中的表达呈逐渐增强的趋势 ,提示它在早期DR的发生、发展中起重要作用     

糖尿病大鼠视网膜中内质网应激蛋白、HIF-1α和血管内皮生长因子的表达

目的：探索糖尿病大鼠视网膜中内质网应激相关BIP (蛋白重链结合蛋白)、HIF-1α(低氧诱导因子-1α)和VEGF (血管内皮生长因子)的表达及意义。
　　方法：72只雄性SD大鼠,随机分为6组：正常2月对照组(C2m),糖尿病2月组(D2m),正常4月对照组(C4m),糖尿病4月组(D4m),正常6月对照组(C6m),糖尿病6月组(D6m),每组各12只。实验组给予一次性腹腔注射65mg/kg STZ建立糖尿病模型。 ELISA法检测BIP、HIF-1α和VEGF表达水平,免疫组化法观察大鼠BIP、HIF-1α和VEGF视网膜内定位情况。
　　结果：BIP表达随DM 病程的延长而增加( P<0.05),且DM各组与对照组相比,其差异均有统计学意义( P<0.01)。 HIF-1α在DM组中表达较对照组增加,其差异有统计学意义(P<0.05),但DM组各组间差异无统计学意义。 VEGF蛋白在D2 m组与对照组间差别无统计学意义,但 D4 m、D6 m 与对照组间差别有统计学意义( P<0.05),且D4 m和D6 m两组间差别有统计学意义。免疫组化：BIP在对照组视网膜神经节细胞层中少量表达,DM组主要分布于视网膜内核层和神经节细胞层;HIF-1α在对照组基本不表达, DM组各层均有表达;VEGF在对照组大鼠中视网膜各层中少量表达,而DM组大鼠的内核层、外核层及视网膜血管、神经节细胞层中 VEGF 阳性表达。
　　结论：糖尿病大鼠视网膜组织中的 BIP、HIF-1α、VEGF均较对照组增加且随糖尿病病程进展而增加,内质网应激和低氧诱导因子途径均可能在糖尿病视网膜病变的进展中起重要作用。     

血管内皮生长因子在糖尿病在鼠视网膜中的表达

目的：观察血管内皮生长因子（VEGF）蛋白在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠视网膜中的表达情况，以探讨其在早期糖尿病视网膜病变（DR）中的作用。方法：选择健康成年Wistar大鼠40只，随机分成正常对照组（CON）、糖尿病1个月组（DM1）、糖尿病3个月组（DM3）及糖尿病6个月（DM6）组，每组10只。大鼠腹腔内注射STZ诱发大鼠糖尿病。制备大鼠视网膜石蜡切片行免疫组化ABC法染色，光镜观察。结果：VEGF于CON和DM1组只表达于内核层及节细胞层部分细胞；病程3个月时，尚可见视网膜血管的阳性反应；6个月时，阳性反应范围又扩大至视杆内节和色素上皮细胞。结论：随病程进展，VEGF在视网膜中的表达呈逐渐增强的趋势，提示它在早期DR的发生、发展中起重要作用。     

糖尿病大鼠视网膜中内质网应激蛋白的表达及意义

目的 检测内质网应激蛋白(bip)在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达情况,探讨内质网应激在糖尿病视网膜病变(DR)中的作用和机制.方法 Wistar大鼠随机分为4组:链脲佐菌素(STZ)致糖尿病大鼠3、6、9个月模型组及正常对照组,每组10只.采用腹腔注射STZ 60 mg/kg,制备大鼠糖尿病模型;分批处死,每只大鼠左眼免疫组织化学法检测视网膜组织中bip的表达,右眼半定量RT桺CR方法 检测bip mRNA的表达.结果 bip在正常大鼠视网膜组织中少量表达,主要分布于视网膜内核层和神经节细胞层,糖尿病3个月组bip在各层的表达量升高,6个月组表达最高.结论 bip参与了DR的发病机制,在早期糖尿病大鼠视网膜组织中,细胞的应激能力随糖尿病病程延长而增强.     

塞来昔布对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子表达的影响

目的 观察塞来昔布对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 将36只大鼠用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射制成糖尿病大鼠模型，随机分成糖尿病组(n=18)和塞来昔布灌胃组(n=18)。塞来昔布灌胃组大鼠经口灌胃塞来昔布50 mg/kg；糖尿病组经口灌胃等体积生理盐水。另18只正常大鼠为正常对照组。3个月后处死全部大鼠，应用免疫组织化学技术检测视网膜VEGF蛋白表达，逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）方法检测视网膜VEGF-mRNA和环氧化酶(COX)-2-mRNA的表达。 结果 正常对照组视网膜VEGF-mRNA和COX-2-mRNA表达量少，VEGF免疫组织化学反应弱阳性，VEGF蛋白表达量低；糖尿病组较正常对照组视网膜VEGF-mRNA和COX-2-mRNA表达均上调(P＜0.05)，VEGF免疫组织化学反应呈强阳性，VEGF蛋白表达增高(P＜0.01)；塞来昔布灌胃组较糖尿病组视网膜VEGF mRNA表达显著下降(P＜0.05)，COX-2- mRNA的表达无显著降低(P>0.05)，VEGF免疫组织化学反应阳性减弱，VEGF蛋白表达降低(P＜0.01)。 结论 塞来昔布可通过抑制COX-2的活性进一步抑制STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜VEGF-mRNA及蛋白表达。(中华眼底病杂志,2007,23:265-268)     

糖尿病视网膜Mǖller细胞病理改变的体内外研究

目的研究糖尿病视网膜M櫣ller细胞的病理改变。方法用链脲菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠糖尿病模型,3个月后观察视网膜M櫣ller细胞超微结构的变化。行免疫组织化学染色,在激光共聚焦显微镜下观察视网膜M櫣ller细胞GFAP、VEGF表达的改变;纯化培养出生5～7d(SD)乳鼠的M櫣ller细胞,在其中加入糖基化终末产物(AGEs)2500μg/mL,培养24h后,用MTT方法检测细胞活性。结果3个月后电镜观察发现糖尿病鼠视网膜M櫣ller细胞突起有损伤表现,微血管内皮细胞、周细胞未见病理改变;正常鼠视网膜VEGF染色阴性,视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP染色;糖尿病鼠除视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP染色外,其余各层也可见丝条状贯穿于内外界膜之间的GFAP染色,在上述部位有VEGF及GFAP的共表达。培养24h后,2500μg/mL质量浓度的AGEs对M櫣ller细胞活性有显著促进作用。结论反应性胶质化增生可能是糖尿病早期M櫣ller细胞的主要病理改变,它所引起的M櫣ller细胞结构和功能改变应在糖尿病视网膜病变(DR)的发生发展中起重要作用。AGEs可能是DR中视网膜M櫣ller细胞反应性胶质化增生的重要致病因素。     

链尿佐菌素诱导的糖尿病鼠视网膜N-钙蛋白的表达

目的 观察链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病鼠视网膜N-钙粘蛋白(N-cadherin)的表达。 方法 20只Sprague Dawley(SD)大鼠腹腔一次性注射65 mg/kg STZ建立糖尿病模型，另20只SD大鼠腹腔一次性注射等体积枸橼酸盐缓冲液作为对照。伊文思蓝检测视大鼠网膜血管的渗透性；免疫组织化学、Western blotting方法检测对照组及糖尿病组大鼠视网膜及用胰蛋白酶消化的视网膜微血管N-钙粘蛋白表达情况。 结果糖尿病诱导4、8、12 周后视网膜血管渗透性分别增加68%、91%、125%(P<0.005)。对照组视网膜N-钙粘蛋白主要表达在视网膜外网状层、内网状层、内核层、神经节细胞层、内界膜及视网膜微血管内皮细胞和周细胞之间。STZ诱导糖尿病鼠12周后视网膜及视网膜微血管N-钙粘蛋白表达显著下降。Western blotting分析结果显示随着糖尿病视网膜病变的发展，视网膜N-钙粘蛋白表达显著减少。 结论 STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜N-钙粘蛋白的表达降低，提示反应性N-钙粘蛋白可能参与早期糖尿病视网膜病变的发生。(中华眼底病杂志,2007,23:269-272)      

CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的抑制作用

目的　探讨CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的影响。方法　雄性SD大鼠30只，随机分成对照组、糖尿病组、治疗组(CDK抑制剂SCH727965)，每组各10只。后两组大鼠采用单次腹腔注射55 mg·kg^-1链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法诱导糖尿病模型。模型诱导成功后，治疗组玻璃体内注射SCH727965 8 μL(3 nmol·L^-1)。12周后，免疫荧光检测三组大鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达，免疫组织化学检测视网膜色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)表达，Western blot检测GFAP、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、PEDF蛋白相对表达量。结果　与对照组GFAP (100.00±0.00)%、VEGF(100.00±0.00)%、PEDF(38.26±0.52)%、PCNA(9.34±0.47)%表达相比，糖尿病组GFAP(168.24±2.72)%、VEGF(156.79±1.75)%、PCNA(16.11±0.34)%表达均明显增加，PEDF(23.72±0.71)%表达明显降低(均为P<0.01)；而与糖尿病组相比，治疗组GFAP(124.37±3.01)%、VEGF(118.36±1.98)%、PCNA(12.05±0.67)%表达均明显降低，PEDF(8.22±0.36)%表达明显增加(均为P<0.05)。结论　SCH727965可下调大鼠糖尿病状态下视网膜GFAP、VEGF、PCNA表达，上调PEDF表达，进而抑制Müller细胞增殖及新生血管形成。     

长链非编码RNA 母系表达基因3调控miR-34a对糖尿病视网膜病变Müller细胞活化及炎症因子分泌的影响

目的　探讨母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）对糖尿病视网膜病变（DR）Müller细胞的活化及炎症因子分泌的影响及机制。方法　高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射构建小鼠DR体内模型。高糖刺激人视网膜Müller细胞株MIO-M1构建DR体外模型。免疫荧光化学染色及Western blot检测小鼠视网膜及Müller细胞中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。Western blot及酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达。ELISA检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中IL-1β蛋白的表达。分别或同时向Müller细胞中转染pcDNA-MEG3及miR-34a mimic对其表达进行干预。qRT-PCR检测MEG3 mRNA及miR-34a表达。结果　与正常对照组小鼠比较,DR组小鼠视网膜中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均增多（均为P<0.05）,MEG3 mRNA表达降低(P<0.01)。与对照组比较,高糖组Müller细胞中MEG3 mRNA表达降低(P<0.01),而GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）。与高糖组比较,高糖+pcDNA-MEG3组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均降低（均为P<0.05）。与正常对照组比较,DR组小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中miR-34a表达均升高(均为P<0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-MEG3组中miR-34a表达减少(P<0.01)。与pcDNA+NC mimic组比较,pcDNA+miR-34a mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）,而pcDNA-MEG3+NC mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均减少（均为P<0.05）。与pcDNA-MEG3+miR-34a mimic组比较,GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达水平均升高（均为P<0.05）。结论　MEG3在DR小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中表达均降低,其可通过负向调控miR-34a抑制Müller细胞活化及炎症因子的分泌。过表达MEG3可能成为DR治疗的新靶点。     

葛花总黄酮对糖尿病小鼠视网膜形态学改变及 VEGF表达的影响

目的：探讨葛花总黄酮（ TFF）对糖尿病小鼠视网膜形态学改变及血管内皮生长因子（ VEGF）表达的影响。方法40只C57BL／6J小鼠随机分为5组：正常对照组、糖尿病模型组、葛花总黄酮小剂量组（ TFFⅠ）、中剂量组（ TFFⅡ）和大剂量组（ TFFⅢ）。糖尿病模型组和药物干预组小鼠腹腔注射链脲霉素（ STZ）建立I型糖尿病模型。 STZ诱导后第5周开始给药,第15周处死小鼠取眼球,采用苏木素-伊红（ HE）染色观察小鼠视网膜组织的形态学改变;免疫组织化学染色法检测视网膜VEGF的表达。结果葛花总黄酮小、中剂量组视网膜厚度稍变薄,毛细血管基底膜增厚不明显,神经节细胞稍减少,神经纤维层可见少量空泡样变性,内核层与外核层细胞排列基本整齐;葛花总黄酮大剂量组各层细胞排列整齐,视网膜厚度基本正常,神经节细胞稍减少,神经纤维层未见空泡样变性,内、外核层细胞排列整齐。给予葛花总黄酮治疗组VEGF免疫阳性产物表达较模型组减弱。葛花总黄酮小、中、大剂量组VEGF免疫组化阳性产物平均光密度值（分别为：35．53±3．12、25．42±3．60、16．43±4．89）与糖尿病模型组（55．54±8．87）比较差异有统计学意义（ P ＜0.01）。结论 VEGF在糖尿病视网膜病变的发生发展中起重要作用,葛花总黄酮可改善糖尿病视网膜病变小鼠视网膜的病理形态,并可通过下调VEGF的表达,发挥对糖尿病视网膜病变的保护作用。     

Upregulated expression of vascular endothelial growth factor in proliferative diabetic retinopathy.

AIMS/BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a hypoxia induced angiogenic factor. Recent studies have shown that high levels of VEGF accumulate in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR). The purpose of the present study was to identify the retinal cells that upregulate VEGF expression in human PDR patients representing progressive stages of retina deterioration. METHODS: Thirteen formalin fixed and paraffin embedded enucleated eyes with PDR were used (eyes were enucleated because of being blind and painful as a result of neovascular glaucoma). Thin retina sections were hybridised in situ with a VEGF specific probe, to identify cells producing VEGF mRNA. RESULTS: All eyes with PDR showed upregulated expression of VEGF mRNA, specifically in the cells of the neurosensory retina. VEGF expression was upregulated in all three nuclear layers--namely, the ganglion cell layer, the inner nuclear layer, and the outer nuclear layer. However, in each patient, VEGF producing cells were mostly distributed in a different layer, or even confined to a specific region in that layer. For example, expression by the outer nuclear layer was mostly detected in detached (presumably hypoxic) regions of the retina. CONCLUSIONS: Progression of PDR is distinguished by a sustained, upregulated expression of VEGF by the neurosensory retina. Cells in all retina layers can potentially contribute to augmented VEGF production. The restricted population of VEGF producing cells in each case is likely to represent cells residing in ischaemic regions of the retina. Thus, VEGF may function as a linking factor between retinal ischaemia and PDR associated neovascularisation.     

STZ诱导糖尿病视网膜FOXO1A的表达

目的探讨链脲霉素（streptozotocin,STZ）诱导糖尿病视网膜FOXO1A的表达及与糖尿病视网膜病变可能的相关性。方法建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型,用免疫组织化学、Western blot方法检测对照组和糖尿病大鼠视网膜以及胰蛋白酶消化的视网膜微血管FOXO1A蛋白表达。结果免疫组化发现STZ诱导的糖尿病大鼠12周后视网膜及视网膜微血管FOXO1A免疫反应显著增加,主要分布在视网膜外网状层、内核层、内网状层、神经节细胞层及视网膜微血管壁。Western blot分析表明在糖尿病鼠8周和12周视网膜FOXO1A活性和表达较对照组显著增加,然而在糖尿病鼠4周,视网膜FOXO1A活性和表达较对照组减少。结论STZ诱导的大鼠慢性高血糖影响视网膜FOXO1A活性和表达,这可能与早期糖尿病视网膜神经细胞和微血管细胞的损伤有关。     

Peroxiredoxin6在糖尿病大鼠视网膜中的表达

背景研究表明氧化损伤在糖尿病并发症的发生发展中发挥着重要的作用,Peroxiredoxin6（Prx6）是双功能的蛋白质,其清除磷脂氢过氧化物的活性非常重要,因为细胞质中普遍存在的谷胱甘肽过氧化物酶（GPxl）无此功能。目的观察Prx6在实验性糖尿病大鼠视网膜中的表达,分析随着糖尿病病程的延长其在视网膜的表达情况。方法Wistar大鼠60只,随机分为正常对照组12只和糖尿病组48只。糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素（STZ）65mg／kg诱发糖尿病,将造模成功的大鼠随机分为糖尿病1、2、3个月组,每组16只。于各时间点处死大鼠,采用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫组织化学法分析Prx6在不同时间点糖尿病组大鼠视网膜中的表达,应用Image—ProPlus6．0图像分析软件测定阳性反应强度,即平均吸光度（A）值。结果免疫组织化学染色结果显示,正常对照组大鼠视网膜内外颗粒层及视网膜、脉络膜血管均有Prx6蛋白的表达,视网膜神经节细胞（RGCs）层有少量Prx6蛋白的表达,表达于细胞质;糖尿病1个月组大鼠视网膜内外颗粒层棕黄色阳性染色细胞增多;2个月组、3个月组大鼠视网膜各层Prx6蛋白的表达均为阴性,各组问总体比较差异均有统计学意义（F=22967．63,P〈0．05）。RT—PCR结果显示,正常对照组大鼠视网膜有Prx6mRNA的表达;糖尿病1个月组视网膜Prx6mRNA表达增高;2个月组Prx6mRNA表达量明显降低,仅有少量表达;3个月组表达阴性,各组问总体比较差异均有统计学意义（F=942．84,P〈0．05）。结论Prx6作为一种抗氧化蛋白存在于视网膜中,可保护组织细胞免受活性氧簇、氧自由基等的损害,随着糖尿病病程的延长,Prx6在视网膜组织和细胞中的表达量逐渐降低,直至消失。     

糖尿病大鼠视网膜神经细胞损伤机制的研究

目的 观察糖尿病大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体（GLAST）、谷氨酰胺合成酶（GS）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的变化、视网膜神经细胞凋亡的检测以及神经营养因子NT-3的表达,探讨糖尿病（DM）对视网膜神经细胞损伤的机制。设计 实验研究。研究对象 Sprague-Dawley（SD）大鼠82只。 方法 大鼠随机分为正常对照组12只,糖尿病模型组70只。链脲佐菌素诱导实验性DM大鼠模型。RT-PCR法检测视网膜GFAP mRNA表达水平;TUNEL法检测视网膜神经节细胞（RGC）及内核层细胞的凋亡并计数凋亡细胞数量;免疫组织化学技术LSAB法检测GFAP、GLAST、GS、NT-3在视网膜的表达,观察DM大鼠视网膜RGC及内核层细胞功能的改变,用图像分析仪测量免疫组化的显色强度。主要指标 GFAP、GLAST、GS和NT-3的表达量,视网膜内核层和RGC细胞凋亡数。结果 （1）与正常组（1.00±0.02）相比,模型组GFAP阳性表达量（5.22±1.34）明显增加（P=0.000）, GLAST、GS、NT-3阳性表达明显降低。（2）大鼠视网膜凋亡阳性细胞仅见于RGC层和内核层,模型组视网膜内核层细胞及RGC凋亡数量（36.00±6.02,11.48±2.08）比正常组（16.33±2.34,5.34±0.52）显著增加（P均=0.000）。（3）DM大鼠视网膜GFAP mRNA表达（7.00±0.37）比正常组（0.29±0.08）明显增加（P=0.000）。（4）GFAP阳性表达与内核层细胞及RGC凋亡数呈正相关（r=0.88、0.85,P=0.021、0.028 ）;GLAST阳性表达与内核层细胞及RGC凋亡数呈负相关（r=-0.91、-0.89, P=0.014、0.020）,GS阳性表达与内核层细胞及RGC凋亡数呈负相关（r=-0.93、-0.90, P=0.007、0.009）;NT-3阳性表达与内核层细胞及RGC凋亡数呈负相关（r=-0.74、-0.71, P=0.036、0.041）。结论  糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡增加与Müller细胞的过度反应性增生及神经营养因子的缺失有关,高浓度谷氨酸的兴奋性毒性作用以及神经营养因子NT-3的缺失是其视网膜神经细胞损伤的重要机制。     

Inducible nitric oxide synthase and vascular endothelial growth factor are colocalized in the retinas of human subjects with diabetes

PURPOSE: Nitric oxide (NO) mediates vascular endothelial growth factor (VEGF)-induced angiogenesis and vascular hyperpermeability. This study was undertaken to study the cellular distribution of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and VEGF in the retinas from human subjects with diabetes mellitus. In addition, glial reactivity and peroxynitrite generation were detected by immunolocalization of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and nitrotyrosine, respectively. METHODS: Eight post-mortem eyes from four consecutive subjects with diabetes mellitus and eight eyes from four subjects without diabetes and without known ocular disease were prospectively collected and examined. We used immunohistochemical techniques and antibodies directed against iNOS, VEGF, GFAP, and nitrotyrosine. RESULTS: In retinas from all subjects without diabetes, weak GFAP immunoreactivity was confined to nerve fibre and ganglion cell layers. There was no immunoreactivity for iNOS, nitrotyrosine, and VEGF. All diabetic retinas showed GFAP induction in Müller cells and GFAP upregulation in nerve fibre and ganglion cell layers. All diabetic retinas showed cytoplasmic immunoreactivity for iNOS, and VEGF in ganglion cells, cells in the inner nuclear layer, and glial cells. In serial sections, ganglion cells and cells in the inner nuclear layer expressing VEGF were localized in the same area of iNOS-expressing ganglion cells and cells in the inner nuclear layer. Six retinas from three subjects with diabetes showed immunoreactivity for nitrotyrosine in vascular endothelial cells in inner retinal layer. CONCLUSIONS: iNOS and VEGF are colocalized in diabetic retinas. Increased GFAP immunoreactivity is a pathological event in the retina during diabetes.     

玻璃体内注射色素上皮源性因子对大鼠早期糖尿病视网膜病变的保护作用

目的　观察玻璃体内注射色素上皮源性因子（ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ-ｄｅｒｉｖｅｄｆａｃｔｏｒ,ＰＥＤＦ）对ＳＤ糖尿病大鼠视网膜ＰＥＤＦ、血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）、炎性相关因子细胞间黏附分子-１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅ-ｃｕｌｅ-１,ＩＣＡＭ-１）和单核细胞趋化蛋白-１（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ-１,ＭＣＰ-１）以及细胞通透性相关因子紧密连接蛋白-１（ｚｏｎｕ-ｌａｏｃｃｌｕｄｅｎｓ-１,ＺＯ-１）和蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢ,ＰＫＢ,又称Ａｋｔ）表达的影响,探讨ＰＥＤＦ对早期糖尿病视网膜病变的保护作用。方法　选取６～８周龄ＳＤ大鼠６０只,随机分为４组:正常对照组（ＣＯＮ组）、糖尿病组（ＤＭ组）、糖尿病生理盐水注射组（ＤＭ＋ＮＳ组）和糖尿病ＰＥＤＦ注射组（ＤＭ＋ＰＥＤＦ组）。链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型后第１周、２周、３周时,ＤＭ＋ＰＥＤＦ组大鼠玻璃体内注射ＰＥＤＦ,而ＤＭ＋ＮＳ组注射同样体积的生理盐水。第４周时处死大鼠,摘出眼球,进行视网膜组织病理学及电镜观察。并采用免疫组织化学方法检测视网膜ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１以及ＺＯ-１、Ａｋｔ的表达情况。结果　糖尿病大鼠均造模成功。４周糖尿病病程尚不能导致明显的视网膜新生血管形成。在透射电镜下,ＤＭ组大鼠视网膜可见神经节细胞水肿,线粒体肿胀变大,基质肿胀明显,可见大部分或全部的嵴消失,部分双侧膜融合,粗面内质网扩张,而玻璃体内ＰＥＤＦ注射可以明显地改善这一病理改变。ＤＭ组大鼠ＰＥＤＦ主要表达于视网膜神经纤维层、神经节细胞层以及内丛状层、光感受器基质以及色素上皮层、脉络膜等部位;ＶＥＧＦ主要表达于神经节细胞层,ＩＣＡＭ-１主要表达在光感受器层,ＭＣＰ-１主要表达在视网膜内层细胞,包括节细胞层和内核层,ＺＯ-１蛋白主要表达于内核层的细胞以及神经节细胞,Ａｋｔ主要表达于内丛状层以及脉络膜的细胞浆中。同ＣＯＮ组相比,ＤＭ组、ＤＭ＋ＮＳ组视网膜中ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ表达差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,而ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１表达增加,ＺＯ-１、Ａｋｔ表达减少,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。ＤＭ＋ＰＥＤＦ组大鼠视网膜中ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ的表达较ＤＭ组和ＤＭ＋ＮＳ组差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,但ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１表达减少,ＺＯ-１、Ａｋｔ表达增多,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。结论　ＰＥＤＦ可以明显地改善糖尿病视网膜病变早期视网膜神经节细胞的损害,通过减少炎性因子和增加细胞连接蛋白而减轻血-视网膜屏障的破坏,从而对早期糖尿病视网膜病变起一定的防治作用。     

Expression and effect of proline hydroxylase domain 2 in retina of diabetic rats

AIM: To observe the expression of proline hydroxylase domain 2 (PHD2) in the retina of diabetic rats and investigate the relationship between PHD2 and relevant intraocular vascular proliferation factors. METHODS: Sixty male specific pathogen free (SPF) Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into two groups: the diabetic group and the control group. The rats in the diabetic group were intraperitoneally injected with 60 mg/kg (0.60 mL/100g) of streptozotocin to induce a diabetic rat model. The rats in the control group were injected with an equal volume of sodium citrate buffer solution by the same method. Hematoxylin-eosin (HE) staining and immumofluorescence (IF) method were adopted to observe the pathological changes of retinal tissues and the expression of PHD2, glial fibrillary acidic protein (GFAP), vascular endothelial growth factor (VEGF) by 8wk. RT-PCR method was applied to detect the expressions of mRNA of PHD2, VEGF and GFAP. The relationship between PHD2 and other vascular proliferation factors was analyzed. RESULTS: HE staining showed that there was the retinal tissue edema in the diabetic group, and the arrangement was in disorder, and proliferation could be seen. IF staining: in the retina of normal rats, PHD2 was not expressed, GFAP and VEGF were mainly expressed in astrocytes; while in the diabetic rats, PHD2, GFAP and VEGF staining showed strong positivity in all retinal layers, mainly in neurogliocytes. PHD2 was co-expressed with VEGF and GFAP. The mRNA expression levels of PHD2, GFAP and VEGF in the diabetic group were obviously higher than that in the control group,respectively 1.83 times, 1.75 times and 2.08 times. The difference had statistical significance (P<0.01). CONCLUSION: The high expression of PHD2 in the retina of early-stage diabetic rats might result from secretion of neurogliocytes induced by local high-concentration blood glucose, thus promoting the expression of VEGF and GFAP. PHD2 plays an important role during the occurrence of diabetic retinopathy.