小鼠体外受精及其胚胎体外培养的比较研究

目的 通过比较不同品系小鼠体外受精情况以及不同培养液对C57BL/6J小鼠胚胎体外培养效果的实验,进一步完善小鼠体外受精和早期胚胎体外培养体系.方法 对C57BL/6J、DBA/2、FVB/NJ、BALB/c、KM、ICR及BARR Ⅱ小鼠进行超排和体外受精,并对C57BL/6J小鼠体外受精后的2-细胞胚胎用HTF、CZB、KSOM、M16、HECM五种培养液在相同条件下进行体外培养到囊胚,计算4-细胞～囊胚的发育率.结果 各品系小鼠平均排卵数为13.0～38.7个(P＜0.01),体外受精率为70.2%～92.8%(P＜0.05).不同培养液至4-细胞的发育率为60.3%～95.8%,其中KSOM的4-细胞发育率为95.8%,最适合2-细胞向4-细胞的发育.8-细胞发育率为52.8%～91.1%,桑椹胚发育率为40.6%～87.5%,囊胚发育率为5.1%～75.4%,各阶段胚胎发育率均差异显著.其中适合于金黄仓鼠桑椹胚、囊胚发育的HECM-2并不支持C57BL/6J囊胚的发育,其囊胚发育率只有5.1%,CZB最适合其囊胚的发育.结论 遗传背景是影响小鼠超排及体外受精效果的主要因素之一.葡萄糖的存在不利于克服2-细胞发育阻断,胚胎在8-细胞期以前,主要能源物质不是葡萄糖,直到桑椹胚后期,葡萄糖才是主要的能量物质.磷酸盐可引起胚胎发育阻断.氨基酸和EDTA有利于克服胚胎发育阻滞.     

小鼠早期胚胎几种不同培养方法的比较

目的探讨小鼠胚胎体外发育中的最佳培养方案。方法将从超排的ICR雌鼠输卵管内收集的1-细胞放入无糖CZB中培养,分别于2-细胞、4-细胞、桑椹胚阶段更换入含3.0 mmol/L葡萄糖(最适浓度)的CZB中,以及胚胎培养全程均在含糖CZB中更换1次培养液、胚胎培养全程均在含糖CZB中不更换培养液,对照组胚胎培养全程均在无糖CZB中,观察记录胚胎的发育情况。结果2-细胞、4-细胞阶段换入含糖CZB中的序贯培养及培养全程在含糖CZB中单一培养,囊胚率均高于对照组(P0.05);桑椹胚阶段换入含糖CZB中的序贯培养,囊胚率与对照组差异无统计学意义(P0.05);2-细胞、4-细胞阶段换入含糖CZB中的序贯培养与全程在含糖CZB中的两步法单一培养及一步法单一培养,囊胚率分别为46.5%、38.4%、41.7%、56.6%,其差异无统计学意义(P0.05)。结论在小鼠早期胚胎体外发育中,2-细胞至桑椹胚前对葡萄糖存在依赖性;尽管序贯培养是有效的,但并不一定优于一步单一培养。     

KSOM培养基营养成分调整对小鼠植入前期胚体外发育的影响

目的囊胚发育率低和发育迟缓是继““2-细胞阻滞““解决后小鼠胚胎体外培养中面临的两大问题.本实验通过对 KSOM培养基营养成分的调整,观察对胚胎发育的影响,优化培养基的构成.方法采用微滴培养法培养昆明小鼠单细胞胚胎,以胚胎发育到囊胚的比例、孵出比例以及注射hCG后120 h囊胚全细胞数作为判断培养效果的标准,比较 KSOM在葡萄糖、牛血清白蛋白、氨基酸3种营养物质不同浓度下对小鼠植入前胚体外培养的效果.结果在未加氨基酸时葡萄糖、牛血清白蛋白的变化对注射hCG后120 h囊胚形成率、囊胚全细胞数影响不大,添加氨基酸后,囊胚发育速度提高,部分孵出和全部孵出比例提高,囊胚全细胞数增大明显,且葡萄糖、牛血清白蛋白与氨基酸对囊胚的发育有共同促进的作用.结论通过添加适量的氨基酸、葡萄糖、BSA改良KSOM培养基能很好的促进小鼠植入前胚体外发育.     

KSOM培养基营养成分调整对小鼠植入前期胚体外发育的影响

目的 囊胚发育率低和发育迟缓是继“2-细胞阻滞”解决后小鼠胚胎体外培养中面临的两大问题。本实验通过对KSOM培养基营养成分的调整,观察对胚胎发育的影响,优化培养基的构成。方法 采用微滴培养法培养昆明小鼠单细胞胚胎,以胚胎发育到囊胚的比例、孵出比例以及注射hCG后120h囊胚全细胞数作为判断培养效果的标准,比较KSOM在葡萄糖、牛血清白蛋白、氨基酸3种营养物质不同浓度下对小鼠植入前胚体外培养的效果。结果 在未加氨基酸时葡萄糖、牛血清白蛋白的变化对注射hCG后120h囊胚形成率、囊胚全细胞数影响不大,添加氨基酸后,囊胚发育速度提高,部分孵出和全部孵出比例提高,囊胚全细胞数增大明显,且葡萄糖、牛血清白蛋白与氨基酸对囊胚的发育有共同促进的作用。结论 通过添加适量的氨基酸、葡萄糖、BSA改良KSOM培养基能很好的促进小鼠植入前胚体外发育。     

昆明小鼠卵子的体外受精及其新培养系统的建立

本研究首次将CZB培养液应用于昆明小鼠早期胚胎的培养，建立了一个可行的胚胎体外培养的新方法，采用昆明种成熟雄鼠附睾尾部精子与常规超排法得到的卵子在TYH培养液中进行体外受精后，将卵子分别移入WM和CZB培养液中进行发育培养。WM中的胚胎发生阻滞而未能继续发育；CZB培养液中的胚胎有79%发育至4细胞期，81%的胚胎发育至桑椹胚阶段，突破了胚胎培养中存在的“2细胞阻滞”现象。而于胚胎培养的不同阶段向培养液中添加葡萄糖也未表现出明显的作用。表明在昆明小鼠胚胎培养的早期阶段，葡萄糖并非一种重要的营养物质。     

氨基酸浓度对昆明小鼠胚胎体外发育的影响

目的探讨培养液中氨基酸成分对植入前昆明小白鼠胚胎发育的影响,摸索植入前胚胎体外培养氨基酸的最佳浓度.方法从超排昆明小鼠输卵管中取出的630枚受精卵均分为7组,分别在经添加不同浓度Eagle‘s氨基酸的去牛血清白蛋白KSOM培养液(mKSOM、mKSOM 1/16AA、mKSOM 1/8AA、mKSOM 1/4AA、mKSOM 1/2AA、mKSOM AA、mKSOM 2AA)中培养,对比观察各组胚胎体外发育的过程.用卡方检验分析添加各浓度氨基酸的培养液培养效率的差别,并将8细胞发育率和囊胚发育率分别与相应的氨基酸浓度进行曲线拟合分析.结果与未添加氨基酸组对比,添加氨基酸组胚胎发育率高,8细胞胚和囊胚的形成率与培养液中氨基酸的浓度关系均符合三次模型,在氨基酸为 1/2浓度时8细胞胚和囊胚的形成率均达到最高.结论氨基酸对胚胎的体外发育有促进作用,但含有高浓度氨基酸的培养液培养效果反而有所下降,可能是由于高浓度的氨基酸影响胚胎的代谢和渗透压的改变,且氨基酸分解及胚胎代谢所产生的铵对胚胎有毒性作用.     

氨基酸浓度对昆明小鼠胚胎体外发育的影响

目的探讨培养液中氨基酸成分对植入前昆明小白鼠胚胎发育的影响,摸索植入前胚胎体外培养氨基酸的最佳浓度。方法从超排昆明小鼠输卵管中取出的630枚受精卵均分为7组,分别在经添加不同浓度Eagle's氨基酸的去牛血清白蛋白KSOM培养液(mKSOM、mKSOM 1/16AA、mKSOM 1/8AA、mKSOM 1/4AA、mKSOM 1/2AA、mKSOM AA、mKSOM 2AA)中培养,对比观察各组胚胎体外发育的过程。用卡方检验分析添加各浓度氨基酸的培养液培养效率的差别,并将8细胞发育率和囊胚发育率分别与相应的氨基酸浓度进行曲线拟合分析。结果与未添加氨基酸组对比,添加氨基酸组胚胎发育率高,8细胞胚和囊胚的形成率与培养液中氨基酸的浓度关系均符合三次模型,在氨基酸为1/2浓度时8细胞胚和囊胚的形成率均达到最高。结论氨基酸对胚胎的体外发育有促进作用,但含有高浓度氨基酸的培养液培养效果反而有所下降,可能是由于高浓度的氨基酸影响胚胎的代谢和渗透压的改变,且氨基酸分解及胚胎代谢所产生的铵对胚胎有毒性作用。     

小鼠早期胚胎的体外培养研究

目的 寻求一种体外稳定培养早期胚胎的方法。方法 比较了不同培养基(M16、G1、CZB)从受精卵到囊胚的培养效果，并对CZB做了加糖与不加糖、加BSA与15％FBS的比较研究。对体外形成的囊胚做细胞记数以评估胚胎的质量。结果 CZB无论加糖还是不加糖，均能有效克服2-细胞阻滞(70．0％～84．6％)，加糖CZB囊胚形成率(46．1％～50．0％)更高。受精卵一直在无糖CZB中培养与第3d后转入加糖CZB培养的桑椹胚和囊胚形成率无显著性差异。CZB中加BSA和15％FBS的培养效果相当。体外培养形成的囊胚较体内发育有迟滞现象，但是细胞记数无显著性差异。结论 对于昆明小鼠早期胚胎的体外培养，CZB是较M16、G1更适合的培养基，且CZB中从一开始就应该加糖。CZB中加BSA足可取代FBS，其培养的胚胎无明显异常。     

小鼠早胚体外培养成分确定培养基的实验研究

目的:建立小鼠早胚体外培养成分确定培养基,并与传统培养基对小鼠早胚发育的效果进行比较?方法:用添加不同浓度聚乙烯醇(polyvinyl alcoho,PVA)和不同浓度氨基酸的CZB培养基和添加输卵管细胞?胎牛血清(fetal cattle serum, FCS)或牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)培养基培养小鼠早胚,观察它们对囊胚发育的影响?结果:含0.05 mg/ml PVA?0.5×必需氨基酸(essential amino acids solution, EAA)和0.5×非必需氨基酸(non-essential amino acids solution, NEAA)的CZB培养基可有效防止胚胎粘连,其总囊胚和扩张囊胚发育率显著高于其余各氨基酸添加组和对照组?尽管该培养基的总体发育效果低于输卵管细胞添加组,但其总囊胚发育率与BSA添加组差异无统计学意义,而且明显高于胎牛血清添加组?其扩张囊胚发育率与胎牛血清添加组差异无统计学意义?结论:小鼠早胚在含0.05 mg/ml PVA和0.5×EAA及0.5×NEAA的成分确定的CZB培养基中具有与在BSA添加培养基中相同的囊胚发育能力,且具有与在血清添加培养基中相同的扩张囊胚发育能力?     

ERα特异性抑制剂对KM小鼠植入前胚体外发育的影响

目的探讨ERα在KM小鼠植入前胚体外发育中的作用。方法以空白M16培养液为对照组,观察不同浓度的ER抑制剂(ICI182780)、ERα特异性抑制剂(MPP)、ERβ特异性抑制剂(PHTPP)和ERα特异性抗体对KM小鼠1-细胞胚体外发育至4-细胞胚和囊胚的影响。结果与M16对照组比较,0.5和1μmol/L的ICI182780、10μmol/L的MPP明显降低4-细胞胚的发育率,导致囊胚发育失败(P<0.01);25和50μmol/L的MPP、1μg/m L的ERα特异性抗体将1-细胞胚阻滞在2-细胞阶段,并且50μmol/L的MPP对细胞有毒性作用(P<0.01);0.5μg/m L的ERα特异性抗体使细胞丧失发育至囊胚的能力(P<0.01);各浓度的PHTPP均未被观察到有上述作用(P>0.05)。结论 ER抑制剂、ERα特异性抑制剂和ERα特异性抗体均能抑制小鼠1-细胞胚的体外发育。     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。     

改进的EBSS培养液与常用商品化试剂对鼠胚体外发育的影响

目的：利用改进后的EBSS(SIGMA)培养液和常用商品化培养液G1/G2（Vitrolife）,Quinn's1026/Quinn's1029（SAGE）对昆明系小白鼠胚胎进行体外培养,以对新建IVF实验室进行评估。方法对简单培养液EBSS进行改进,分别制得卵裂培养液和囊胚培养液以构成序贯培养系统。卵裂培养液：EBSS中加入适当浓度的丙酮酸钠,乳酸钠以及5种非必须氨基酸;囊胚培养液：EBSS中加入适当浓度的5种非必须氨基酸及6种必须氨基酸。将胚胎分成4组,A组使用EBSS（Earle's Bal-anced Salt Solution）培养液,B组使用改进后的EBSS培养液,C组使用G1和G2培养液,D组使用Quinn's1026和Quinn's1029培养液,四种培养液均添加10%人血清白蛋白。结果72 h后,鼠胚总体囊胚形成率为70.57%（614/870）,其中A组的囊胚形成率为26.21%（27/103）,B组为72.22%（143/198）,C组为73.81%（155/210）,D组为80.50%（289/359）B,C,D 3组的囊胚形成率显著高于A组（P<0.001)。结论通过鼠胚体外培养,对新建试管婴儿实验室进行了较好的质控检测,经改进后的EBSS培养液在鼠胚囊胚形成率上与商品化序贯培养液G1/G2,Quinn's1026/Quinn's1029相近,均远高于简单培养液EBSS,但前者成本较之常用商品化试剂有大幅度的降低,说明改进的EBSS培养液在鼠胚体外培养上具有较好的实用价值。     

胰岛素对小鼠胚胎发育及其组织中IGF-1表达的影响

目的观察胰岛素对小鼠早期胚胎发育以及胚胎组织中IGF-1表达的影响。方法将ICR小鼠2-细胞胚胎在体外通过KSOM培养液培养36 h,并在培养液中添加0.25μg/ml胰岛素。将添加和没有添加胰岛素体外培养到囊胚的胚胎分别转入受体母鼠继续发育,等F1代小鼠出生后比较两组间的体重差异,并对出生F1代小鼠三种组织(肝、肌、脑)中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的mRNA表达量进行半定量RT-PCR检测。结果添加胰岛素培养的小鼠胚胎其囊胚发育率平均比对照组高9.7%(P<0.01)。而且实验组F1代小鼠出生体重平均较对照组高17.8%(P<0.01)。半定量检测发现F1代的出生小鼠肌肉中,IGF-1表达水平高于对照组。而肝脏和脑中表达没有差异。结论适量的胰岛素环境具有加快胚胎发育和刺激出生小鼠肌肉中IGF-1表达的作用。     

胰岛素对不同时期ICR小鼠胚胎体外发育的影响

目的研究胰岛素对不同时期小鼠胚胎体外发育的影响.方法收集1-细胞、2-细胞、4-细胞及桑椹胚期鼠胚,分别在含0（对照组）、0.005、0.05、0.5、5、10μg/mL胰岛素的KSOM中培养.结果在1-细胞及2-细胞阶段添加系列浓度时,0.005μg/mL及0.05μg/mL胰岛素组不仅提高囊胚率、孵化率,而且提高囊胚细胞数.4-细胞阶段添加系列浓度时0.05μg/ml胰岛素组能够提高囊胚率、孵化率以及囊胚细胞数;而至桑椹胚阶段再添加系列浓度胰岛素时,囊胚率、孵化率以及囊胚细胞数均无统计学意义（P〉0.05）.结论在ICR小鼠胚胎体外培养时适宜的胰岛素浓度为0.05μg/mL;桑椹胚之前添加胰岛素对小鼠胚胎发育是必要的.在一定发育阶段内,随着胚胎的生长对胰岛素的需求也相应增加.     

表皮生长因子对小鼠早期胚胎体外发育影响的研究

目的：探讨表皮生长因子对小鼠植入前胚胎体外发育的影响。方法：用添加不同浓度EGF(epidermal growth factor)的CZB培养液对小鼠早胚进行体外培养，观察囊胚发育率和胚胎细胞数的变化。结果：HCG(human chorionic gonadotropin)注射后138h，0．1ng／ml EGF添加组扩张囊胚率、孵化囊胚率显著高于其他各组。100．0ng／ml EGF添加组扩张囊胚率和孵化囊胚率显著低于其余各组，且囊胚细胞死亡较多。结论：EGF通过刺激囊胚期细胞分化而促进胚胎体外发育。但高浓度EGF抑制胚胎体外发育并使早期胚胎受损。     

不同浓度表皮生长因子对小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响

目的:研究不同浓度表皮生长因子(ep iderm al growth factor,EGF)对ICR小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响。方法:在mKSOM培养液中添加不同浓度(0.1,1.0,10和100 ng/m l)的EGF对小鼠2-细胞胚胎进行体外培养72 h、96 h,观察囊胚发育率、孵化率和胚胎细胞数的变化。结果:实验组加入四种不同浓度EGF胚胎培养72 h后,其囊胚率分别为93.8%、92.4%、91.8%、91.2%;96 h后其孵出率分别为61.1%、61.8%、63.0%、60.1%,均显著高于对照组(79.9%、43.1%,P<0.05),囊胚细胞数分别为73.1±13.4、73.8±7.0、74.3±12.2、77.6±8.2,与对照组(72.1±6.9)比较,差异无显著性(P>0.05);四个实验组间差异亦无显著性(P>0.05)。结论:EGF浓度在0.1,1.0,10和100 ng/m l范围内可提高体外培养鼠胚的囊胚率与孵出率;胚囊细胞数无变化;不同浓度EGF对早期鼠胚未见有毒性作用。     

小鼠嵌合体制作技术的研究

本文着重探索了能够使同品系或不同品系小鼠间8细胞胚胎聚合为一体并发育为桑椹胚、囊胚的有效方法和培养条件。方法是将采自昆明白和C_(57)品系小鼠的8细胞胚胎,在含有0.5%链霉蛋白酶的PBS溶液中进行去透明带处理后,用植物血球凝集素P(PHAP)为接合剂,以1 1的组合在V型塑料多孔板的孔底达到聚合。聚合胚培养于液体石蜡油覆盖下的培养液微小滴中,在37℃、5%CO_2的培养箱内培养20～24h,以桑椹胚或囊胚的发育率为指标,比较三种不同的培养基即PBS FCS。BWW和BMOC-Ⅲ对嵌合胚发育的影响。其结果是,在昆明白←→C_(57)聚合胚中分别有88.1%(59/67),95.0%(115/121)和94.8%(73/77),在昆明白←→昆明白中分别有93.3%(28/30),87.7%(121/138)和86.7%(52/62)的嵌     

乙醇对小鼠胚胎体外发育影响的研究

用含不同浓度乙醇的 Whitten氏培养液对小鼠 2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎分别进行体外培养 ,研究乙醇对小鼠不同发育时期胚胎体外发育的影响。首先利用含 0 .0 1%、0 .5 %、1.0 %、1.5 %、2 .0 %、3.0 %、5 .0 %、10 .0 %乙醇的 Whitten氏培养液对 2细胞胚胎进行培养 ,观察研究小鼠 2细胞胚胎对培养液中乙醇浓度的耐受极限。然后再用含 1%和 3%乙醇的 Whit-ten氏培养液分别对小鼠 2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎进行培养。结果 :含低浓度乙醇 (1%以下 )的培养液对外细胞胚胎和桑椹胚的囊胚形成有促进作用 ,而在 2细胞和 4细胞胚胎…     

瘦素对小鼠着床前胚胎发育影响的体外研究

目的　探讨瘦素在体外对小鼠着床前胚胎发育的影响。方法　 1收集小鼠 2 -细胞胚胎 ,在不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎发育情况 ,并进行胚胎移植 ,观察着床率 ;2收集小鼠 2 -细胞胚胎在空白 CZB培养液中体外培养至桑葚胚期 ,再分别置入不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎进一步发育情况。结果　瘦素能提高 2 -细胞胚胎体外发育的质量、发育率和胚胎着床率。当瘦素剂量为 10 ng/ ml时平均胚胎形态学评分 (AES)为 16 .0 8± 0 .37,剂量为 5 0 ng/ ml时 AES为 17.5 7± 0 .4 2 ,两者间差别有统计学意义(P<0 .0 5 )。但剂量进一步增加 ,促进作用不再递增。瘦素对桑葚胚体外进一步发育无显著影响。结论　瘦素参与了小鼠着床前胚胎的发育 ,能提高胚胎发育质量、发育率 ,有利于胚胎的进一步着床。     

人早孕绒毛膜匀浆和脐静脉内皮细胞对早期鼠胚体外发育的影响

目的:观察人早孕绒毛膜匀浆(UPHC)和人脐静脉内皮细胞(ECHUV)对早期鼠胚体外发育的影响。方法:观察早期鼠胚在UPHC培养液及ECHUV联合培养液中的发育情况;用ELISA法检测两培养系统上清液中表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果:在UPHC培养系统和ECHUV联合培养系统中,早期鼠胚的桑葚胚形成率分别为79.5%和81.2%,囊胚形成率分别为60.2%和61.2%,囊胚孵出率分别为41.0%和42.1%,均明显高于对照组(P<0.05)。早期鼠胚A和B级桑葚胚形成率,在UPHC培养系统中分别为45.2%和32.3%,在ECHUV培养系统中分别为44.6%和27.7%,均显著高于对照组(P<0.05)。UPHC培养系统和ECHUV联合培养系统中,EGF的浓度分别为(52.65±7.37)pg/ml和(58.14±3.03)pg/ml;GM-CSF的浓度分别为(11.81±3.76)pg/ml和(9.20±2.59)pg/ml;VEGF的浓度分别为(61.43±11.38)pg/ml和(256.54±9.15)pg/ml,均显著高于对照组(P<0.05);ECHUV培养系统的VEGF浓度又显著高于UPHC培养系统(P<0.01)。结论:UPHC和ECHUV培养系统促进早期鼠胚体外发育,提高桑葚胚和囊胚形成率、囊胚孵出率和胚胎质量,其作用与EGF、GM-CSF及VEGF有关。