Cortactin过表达对结肠癌细胞转移能力的影响

目的:通过诱导皮层肌动蛋白(cortactin)的过表达分析其在结肠癌细胞侵袭迁移以及肝转移过程中的作用。方法:构建含CTTN基因和绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体,转染293T细胞。取含CTTN基因和绿色荧光蛋白的病毒上清液转染结肠癌细胞株SW1116使cortactin稳定表达。蛋白印迹实验检测cortactin的表达,通过Transwell实验评估结肠癌细胞侵袭迁移能力的改变。利用SW1116细胞株使裸鼠皮下成瘤,取肿瘤组织种植新一批裸鼠结肠壁并观察结肠癌肝转移的情况。结果:成功构建cortactin过表达的SW1116细胞。侵袭和迁移实验中,过表达组穿膜细胞数分别为(147±12)个、(286±17)个,而阴性对照组为(83±10)个、(112±11)个,空白对照组为(75±7)个、(103±9)个,后两组与过表达组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:上调cortactin的表达能显著促进结肠癌细胞的侵袭迁移和肝转移能力,提示cortactin在结肠癌的转移过程中发挥重要作用。     

钙黏蛋白12在结肠癌细胞株与结肠直肠癌组织中的表达及其影响

目的：研究钙黏蛋白12（cadherin-12,CDH-12）在结肠癌细胞株与结肠直肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞株增殖、侵袭、迁移的影响。方法：应用实时PCR和Western印迹法在7株结肠癌细胞株中筛选CDH-12高表达细胞株;shRNA瞬转干扰高表达细胞株SW1116,Western印迹法验证干扰效果;CCK-8检测癌细胞增殖活性变化;transwell实验验证癌细胞迁移、侵袭能力的变化;组织芯片免疫组织化学技术检测CDH-12在结肠直肠癌组织中的表达。结果：实时PCR和Western印迹结果显示CDH-12在细胞株中表达,SW1116和LoVo两个细胞株高表达CDH-12,在成功下调SW1116细胞中CDH-12表达之后,SW1116结肠癌细胞株的增殖、迁移、侵袭能力较对照组明显下降;免疫组化染色结果显示,CDH-12在结肠直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织中的表达。结论：CDH-12在结肠直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,证实了CDH-12为癌基因的可能性;下调CDH-12在结肠癌细胞株SW1116的表达可明显抑制细胞的增殖、迁移、侵袭能力,显示其在肿瘤细胞生长和转移中的重要作用。     

TXNDC9在结肠直肠癌组织中的表达及其影响

目的:探讨TXNDC9基因在结肠直肠癌组织和细胞中的表达,以及沉默TXNDC9高表达后对细胞株SW1116增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法:分别应用免疫组织化学技术、免疫印迹法观察TXNDC9在结肠直肠癌组织和细胞中的表达水平:应用小干扰RNA瞬时转染TXNDC9高表达的结肠癌细胞株SW1116,用实时PCR筛选最高效率的干扰片段,并用Western印迹法检测基因沉默效果:最后研究瞬时转染后SW1116细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果:结肠直肠癌组织中TXNDC9的表达明显高于对照的癌旁正常组织(P<0.01),细胞迁移和侵袭能力亦有明显下降(P<0.01)。结论:TXNDC9在结肠直肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常黏膜上皮,并与肿瘤的大小和浸润深度相关,SW1116是TXNDC9基因高表达的细胞株之一,下调TXNDC9表达能显著抑制该细胞的增殖能力、细胞迁移和侵袭能力。TXNDC9基因对维持肿瘤细胞的增殖和运动能力有重要作用,并可能成为抑制肿瘤生长和转移的有效途径。     

沉默MAD2基因对结肠癌细胞的影响

目的:研究沉默MAD2基因对结肠癌细胞的影响。方法 :采用RT-PCR和Western印迹法筛选MAD2基因在7种结肠癌细胞中的高表达细胞株,并用siRNA瞬时转染以降低MAD2表达,随后采用CCK-8法检测结肠癌细胞增殖能力。流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,transwell实验评估转染后结肠癌细胞迁移能力的改变。结果:SW1116细胞在mRNA和蛋白水平均呈现高表达MAD2,转染靶向MAD2的siRNA可显著降低MAD2在SW1116细胞中的表达。下调MAD2后,SW1116细胞的增殖能力较对照组有明显下降(P<0.05)。干扰siRNA组细胞凋亡比例较对照组增加,而细胞周期未见统计学差异。transwell实验中,siRNA干扰组穿膜细胞数为(45±2)个,显著低于阴性对照组[(185±5)个]和空白对照组[(195±5)个](P<0.01)。结论:SW1116高表达MAD2基因,沉默MAD2基因显著降低肠癌细胞增殖,诱导凋亡,并抑制细胞迁移。MAD2基因很可能成为新的预防结肠癌转移的目的基因。     

血管生成素样蛋白2在结肠直肠癌的表达及其对结肠癌细胞迁移侵袭能力的影响

目的:探讨ANGPTL2基因在结肠直肠癌组织和细胞中的表达,以及沉默ANGPTL2后对结肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法:分别应用实时定量RT-PCR、ELISA观察ANGPTL2在结肠直肠癌组织和细胞中的表达水平;siRNA瞬时转染SW1116细胞株后,半定量RT-PCR筛选干扰效率最高的片段,并用ELISA检测基因沉默效果;transwell小室检测ANGPTL2基因表达下调后对细胞迁移、侵袭能力的影响。结果:45例病人中,癌组织中ANGPTL2蛋白浓度显著高于相应癌旁正常黏膜组织[(36.9±19.3)ng/mL比(5.8±4.2)ng/mL,P<0.001];癌组织中ANGPTL2mRNA的表达量亦高于正常黏膜组织(1.7±1.1比0.7±0.6,P<0.001)。ANGPTL2在SW1116细胞中表达最高。SW1116细胞ANGPTL2基因表达下调后,与空白对照组、阴性对照组相比,干扰组细胞迁移、侵袭至下室的SW1116细胞数目减少(P<0.001)。结论:ANGPTL2在结肠直肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常黏膜上皮,并与结肠直肠癌的分期、淋巴结转移相关;沉默ANGPTL2基因能显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。     

沉默Polo样激酶1基因的表达对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 研究PLK1在结直肠癌细胞迁移和侵袭过程中的作用.方法 常规培养9株结直肠癌细胞,采用PCR和Western-blot法筛选PLK1高表达细胞株.设计3种RNA干扰片段,转染高表达PLK1的结直肠癌细胞株,利用实时定量PCR和western-blot法验证并干扰效果.选择高干扰效果的干扰片段,通过Transwe1l实验来评估转染后结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的变化.结果 SW1116细胞中PLK1 mRNA及蛋白都呈现高表达 3种干扰片段转染SW1116细胞后,PLK1表达量均有不同程度下降,以片段1干扰效果最为明显.在迁移实验中,PLK1干扰组穿膜细胞数为（44±14）个,低于阴性对照组[（242±40）个]和空白对照组[（240±38）个] 在侵袭实验中,PLK1干扰组穿膜细胞数为（62±3）个,低于阴性对照组[（207±12）个]和空白对照组[（211±15）个] 上述差异均有统计学意义（P＜0.01）.结论 干扰PLK1能显著抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭能力,提示PLK1可能在结直肠癌浸润和转移中具有一定作用.     

微小核糖核酸-221通过调节Brahma相关基因-1促进结肠癌细胞侵袭转移的研究

目的探讨微小核糖核酸(RNA)-221(miR-221)对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响及其分子机制。方法以人结肠癌SW48细胞作为研究对象, 设置高表达对照组(miR-NC组), 高表达miR-221组(miR-221组), 低表达对照组(lnh-NC组), 低表达miR-221组(lnh-221组), 通过增加或降低miR-221表达, 采用细胞迁移及侵袭试验(Transwell实验), 检测miR-221对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响;通过使用蛋白质印迹法(Western blot)检测miR-221对Brahma相关基因-1(BRG1)表达的影响。通过荧光素酶报告基因(Luciferase)实验, 检测miR-221在SW48细胞中对BRG1转录活性的影响。通过在miR-221高表达的SW48细胞中高表达BRG1, 检测BRG1在miR-221调控结肠癌细胞侵袭转移中的作用。组间比较采用t检验。结果在SW48细胞中, 迁移和侵袭实验结果显示, miR-221组细胞的迁移和侵袭能力高于miR-NC组(迁移, miR-NC 110.30±7.79比miR-221 193.00±4.7...     

小干扰RNA沉默血管内皮生长因子对ACHN肾癌细胞黏附、侵袭及迁移的影响

目的 观察小干扰RNA (siRNA)沉默血管内皮生长因子(VEGF)对ACHN肾细胞癌细胞生物学行为的影响.方法 化学合成针对VEGF的小干扰RNA,实验分4组,转染后收集细胞,通过蛋白印迹方法检测VEGF的表达,噻唑蓝(MTT)比色法、细胞黏附实验、划痕实验及Transwell法测定细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭能力.结果 siRNA 1～2组VEGF表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组;在24、48、72 h,siRNA 1～2的增殖抑制率均高于空白对照组及阴性对照组(P＜0.05),其中以siRNA2组最为显著;与空白对照组比较,siRNA 1～2组的细胞黏附数量明显下降[(81.5±3.1)％比(40.5±2.6)％、P＜0.05,(81.5±3.1)％比(22.5±2.4)％、P＜0.05],其中以siRNA2组最为明显;siRNA1～2组的细胞迁移数量明显下降(162±9比81±5,P＜0.05;162±9比38±4,P＜0.05);siRNA1～2组细胞侵袭能力明显下降(P＜0.05),且siRNA 2组的细胞侵袭能力明显低于siRNA 1组(P＜0.05).结论 VEGF基因在肾细胞癌细胞黏附、迁移和侵袭中发挥着重要作用;以靶向VEGF的siRNA转染肾细胞癌细胞,可抑制肾细胞癌细胞黏附、迁移和侵袭能力.     

T-box3基因对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的探讨T-box3基因(TBX3)对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响, 并初步探讨其机制。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白印迹(Western blot)方法检测结肠癌患者及结肠癌细胞株TBX3的mRNA和蛋白表达。培养结肠癌SW620细胞株并进行干预, 分为小干扰RNA(siRNA)-TBX3转染组、siRNA-对照组转染组、空白组。转染48 h后噻唑蓝(MTT)实验检测SW620细胞活性, 流式细胞术检测细胞凋亡。RT-qPCR和Western blot检测各组细胞增殖、凋亡相关基因、蛋白表达。结果结肠癌患者肿瘤组织TBX3 mRNA和蛋白相对表达水平显著高于癌旁组织(3.77±0.92、0.66±0.14比0.90±0.22、0.18±0.03, t=25.02、28.21, P<0.01);结肠癌SW620细胞株TBX3 mRNA和蛋白相对表达水平显著高于HIEC(3.01±0.44、0.92±0.06比1.15±0.17、0.24±0.03), 差异均有统计学意义(t=9.68、24.08, P<0.01)。siRNA-TBX3转染组SW620...     

γ-synuclein基因真核表达载体的构建及其对结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能的影响

目的构建针对γ-synuclein基因的真核表达载体并观察其对结肠癌细胞sw1116体外侵袭及与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）黏附能力的影响。方法从结肠癌细胞系HT29提取总RNA,经RT．PCR获得γ-synucleincDNA全长片段,经过酶切连接等反应定向克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,以脂质体转染的方法将重组质粒转染至结肠癌细胞系SW1116,经G418筛选出稳定转染的细胞株。采用Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力。将细胞接种于铺有HUVEC的96孔板中,酶标仪读取荧光强度来表示黏附细胞的相对数。结果成功构建pEGFP-γ-synuclein真核表达载体,经过筛选后可在SW1116细胞中稳定表达,且能在体外翻译出GFP-γ-synuclein融合蛋白质。转染γ-synuclein后,穿过Matrigel胶及Transwell小室膜的细胞数明显增加（198．4±20．7比98．8±13．2,P〈0．05）,与HUVEC黏附的细胞数（荧光强度）亦显著增加（3．08±0．36比1．22±0．21,P〈0．05）。结论γ-synuclein可显著增强结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能。     

干扰磷脂爬行酶1基因表达对结直肠癌细胞增殖和粘附的影响

目的 探讨PLSCR1在结直肠癌细胞增殖和粘附过程中的作用.方法 常规培养3株结直肠癌细胞,采用免疫细胞染色和免疫印迹法筛选PLSCR1高表达的细胞株.设计三条RNA干扰片段及一条阴性对照片段,稳定转染高表达PLSCR1的结直肠癌细胞株,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法验证干扰结果,筛选出对PLSCR1蛋白抑制率最高的干扰片段,通过MTT方法来评估转染后结直肠癌细胞增殖能力的变化,采用细胞粘附实验来评估转染后结直肠癌细胞粘附能力的变化.结果 免疫细胞染色提示LoVo细胞株高表达PLSCR1,与免疫印迹法结果相一致;转染siRNA-390后,LoVo细胞株PLSCR1的mRNA抑制效果最为明显,抑制率为88.4％,免疫印迹法检测进一步验证siRNA-390片段抑制PLSCR1蛋白表达最为显著.MTT法、纤连蛋白,粘附和层连蛋白检测显示,siRNA-390干扰下调PLSCR1的表达后,细胞生长变缓,粘附能力下降.结论 干扰PLSCR1能显著抑制肿瘤的增殖和粘附能力,提示PLSCR1可能在结直肠癌浸润和转移中具有一定作用.     

靶向于前列腺癌特异性膜抗原shRNA的筛选与鉴定

目的 获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)表达的shRNA序列.方法 根据PSMA基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA基因cds区的siRNA序列及无意义的对照序列,组建与之对应的4对互补的单链DNA序列,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5'向3'顺序依次为:酶切位点(BamH Ⅰ)、干扰序列(19 bp)、loop环(TrCAAGAGA)、干扰序列的反向互补序列(19 bp)、中止信号(TTTTT)、酶切位点(EcoR Ⅰ).将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-time PCR检测不同序列片段对PSMA的mRNA抑制效果并通过Western blot检测对目的 蛋白PSMA的抑制效果.结果 设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好,目的 序列位于PSMA(NM_004476)的1207到1226,茎环序列为5'-GATCC GTCTCAAAGTGCCCTACAATrcAAGAGA TTGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTT G-3'.其对前列腺癌细胞株中PSMA的mRNA的抑制率为60.0%,对其蛋白表达的抑制率为86%.转染细胞后,细胞可以稳定低表达PSMA.结论 成功获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中PSMA表达的shRNA序列.     

RNA干扰下调midkine基因表达对人乳腺癌细胞粘附和侵袭力的影响

目的 探讨中期因子(midkine,MK)基因siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCCI、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测MK基因mRNA表达;筛选出MK表达最高者.采用MK siRNA...     

microRNA-133b抑制人结直肠癌细胞迁移和侵袭的研究

目的研究microRNA-133b在结直肠癌细胞中的表达及其对细胞迁移和侵袭能力的影响。方法采用实时定量PCR检测microRNA-133b(miR-133b)在不同恶性程度的结直肠癌细胞及正常结肠细胞中的表达差异;构建miR-133b的真核表达载体并稳定转染SW-620细胞,筛选出稳定表达miR-133b及对照质粒的细胞株SW-620-133b和SW-620-HK,实时定量PCR检测转染后miR-133b表达的变化;划痕实验检测miR-133b对SW-620细胞迁移能力的影响;Transwell侵袭实验检测miR-133b对SW-620细胞侵袭能力的影响。结果正常结肠细胞系CCD-18Co中miR-133b的表达显著高于4种结直肠癌细胞(SW-480,HT-29,LoVo,SW-620)(P0.05),且其在结直肠癌细胞中的表达随着肿瘤细胞恶性程度的增加而降低。稳定转染后,SW-620-133b细胞miR-133b表达量较SW-620及SW-620-HK组显著增高(P0.05);miR-133b对SW-620细胞迁移和侵袭能力有显著的抑制作用,抑制率分别为(42.2±2.6)%及(66.3±8.7)%。结论miR-133b在结直肠癌细胞中呈低表达,miR-133b高表达能显著抑制SW-620细胞的迁移和侵袭能力。     

Short interfering RNA-mediated gene silencing of vascular endothelial growth factor: effects on cellular proliferation in colon cancer cells

HYPOTHESIS: By using short interfering RNA (siRNA) to inhibit the in vitro expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) A, we hope to further investigate the presence of an autocrine loop in colon cancer cells. We hypothesize that VEGF inhibition will result in decreased cellular proliferation. DESIGN: Human colon cancer cells were evaluated for the expression of VEGF and VEGF receptor 2 (VEGFR-2). In vitro assessments were then made of the ability of anti-VEGF siRNA to knock down expression of VEGF and the subsequent effect this decreased expression had on colon cancer cell proliferation. SETTING: Surgical oncology research laboratory. INTERVENTIONS: Human colon cancer cells from the RKO cell line were transfected with siRNA targeting the coding region of VEGF. MAIN OUTCOME MEASURES: Enzyme-linked immunosorbent assay, Northern blot analysis, and real-time quantitative polymerase chain reaction were performed to establish the ability of siRNA to decrease VEGF production. Proliferation assays were run on transfected and wild-type cells to establish concomitant decrease in VEGF expression and cellular proliferation. RESULTS: The RKO colon cancer cells expressed both VEGF and VEGFR-2. Those cells transfected with siRNA targeting VEGF showed a 94% knockdown in VEGF expression and a 67% decrease in cellular proliferation. CONCLUSION: Colon cancer cells expressing VEGF and VEGFR-2 may possess an autocrine growth pathway that can be effectively targeted using RNA interference as an antiangiogenic therapy.     

肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因对人乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的 观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA (siRNA)对乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者.采用TROP4基因siRNA转染乳腺癌细胞,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力.结果 人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-35、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株TROP-2 mRNA分别是1.362±0.057、2.207±0.056、2.997±0.052、0.136±0.045、0.122±0.025、0.194±0.028和2.706±0.039,以MCF-7细胞最高;以TROP-2 siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;黏附实验结果显示,5、10、20 nmol/L siRNA组黏附率分别为(52.9±2.5)％、(25.6±2.3)％、(12.8±2.2)％(P＜0.01);Transwell实验结果显示,5、10和20 mol/L siRNA组穿过滤膜的细胞分别为78±17、39±15、19±16,而对照组分别为136±25、139±21(P＜0.01).结论 TROP-2基因在乳腺癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞黏附和侵袭能力.     

高效抑制核因子κ—B的茎环RNA基因序列的获得

目的获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中核因子kappa—B表达的shRNA序列。方法根据核因子kappa—B基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对核因子kappa-B基因cds区的siRNA序列及无意义的对照序列,组建与之对应的4对互补的单链DNA序列,包括siRNA的正义链和反义链：正义链序列按5’向3’顺序依次为：酶切位点（BamH Ⅰ）、干扰序列（19bp）、loop环（TFCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19bp）、中止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoR Ⅰ）。将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real—timePCR检测不同序列片断对核因子kappa—B的mRNA抑制效果。结果设计的3条针对核因子kappa—B的序列中第3条的抑制效果最好,目的序列位于核因子KAPPA—B（NM_021975）的1096到1113,茎环序列为5＇-GATCC GCCCTATCCCTITACGTCA TTCAAGAGA TGACGTAAAGGGATAGGGC TTITT G-3’。其对前列腺癌细胞株中核因子kappa—B的mRNA的干扰效率为59％,对其蛋白表达的抑制率为81％。转染细胞后,细胞可以稳定低表达核因子kappa—B。结论成功获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中核因子kappa—B表达的shRNA序列,为后期研究核因子kappa-B在前列腺癌发病中的作用机理等研究提供了基础。     

microRNA-224在结肠癌细胞中的表达及意义

目的：探讨microRNA-224（miR-224）对结肠癌细胞中的表达及意义。 方法：用real-time PCR检测4种结肠癌细胞株（Caco-2、HCT116、HT-29、LoVo）和正常结肠黏膜组织中miR-224的表达水平;将HCT116细胞分别转染miR-224模拟物和阴性对照组序列,以未处理的HCT116细胞作为空白对照,用real-time PCR法检测各组细胞miR-224的表达水平,用MTT法和平板克隆实验法检测各组细胞的增殖情况,用流式细胞仪检测各组细胞周期情况。 结果：4种结肠癌细胞株miR-224的表达均明显高于正常结肠黏膜组织（均P<0.05）;与空白对照组HCT116细胞比较,miR-224模拟物转染组HCT116细胞miR-224的表达水平明显升高,增殖活力明显增强,细胞克隆数量明显增高（均P<0.05）;细胞周期G1到S期转换的趋势增强（P=0.074）;阴性对照组序列转染组HCT116细胞的各项指标差异均无统计学意义（均P>0.05）。 结论：miR-224在结肠癌细胞中表达上调,miR-224可能通过促进细胞增殖与细胞周期的演进,而在结肠癌发生发展的过程中发挥促癌基因的作用。