RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系的构建

 【摘要】　目的　利用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术,建立RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系。方法　设计针对RYBP基因的5条短发夹状RNA（shRNA）序列,构建RYBP shRNA慢病毒重组载体,分别包装成慢病毒颗粒,直接感染HL-60细胞,同时设空载体和阴性对照shRNA慢病毒对照组。通过观察绿色荧光蛋白表达以监测感染效率,经嘌呤霉素（终质量浓度8 μg／ml）筛选出稳定感染细胞。Western blot实验初步鉴定出蛋白水平最低的RYBP shRNA组,用实时定量聚合酶链反应（PCR）进一步检测该组细胞mRNA表达水平。结果　慢病毒感染的HL-60细胞经嘌呤霉素筛选成功,与对照组比较,5条RYBP shRNA组细胞RYBP表达均有不同程度减低（P＜0.01）,其中以shRNA2沉默效果最佳,且shRNA2组的RYBP基因mRNA水平降低了95 %以上（P＜0.05）。结论　慢病毒介导的shRNA2能高效、稳定地沉默RYBP基因的表达,成功构建了RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系。     

构建COX2基因慢病毒载体对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响#br#

目的 构建环氧化酶2（COX2）基因慢病毒表达载体并观察其对非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响。方法 针对COX2基因的不同片段设计3对shRNA的寡核苷酸片段并克隆至慢病毒载体GV248中,构建并筛选最佳抑制效率的靶向COX2基因的慢病毒载体COX2 shRNA。选取对数生长期A549细胞进行慢病毒转染,其中靶向COX2基因的shRNA载体转染A549细胞为shRNA组,以空载体质粒转染作为阴性对照组（NC）及不转染质粒的A549细胞为空白对照组（CON）,采用实时荧光定量PCR和Western blotting测定COX2基因和蛋白的表达。分别采用MTT法和流式细胞仪检测干扰COX2表达对A549细胞增殖、凋亡能力的影响。结果 成功构建靶向COX2基因的慢病毒载体;稳定转染A549细胞后,COX2基因表达下降,其中以COX2 shRNA1干扰效率最为显著;shRNA组中shRNA1转染的A549细胞COX2 mRNA水平为0.17±0.06,低于NC组的081±011和CON组的109±0.07,差异有统计学意义（P＜0.05）。shRNA组细胞增殖活性低于NC组和CON组,shRNA组转染5 d的吸光值为0.976±0.016,低于NC组的1.557±0.015和CON组的1880±0034,差异有统计学意义（P＜0.05）。shRNA组细胞凋亡率为（6.28±0.31）％,高于NC组的（3.08±0.05）％和CON组的（3.01±0.31）％,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建靶向COX2基因的慢病毒表达载体,干扰COX2表达可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖并促进细胞凋亡。     

表达对胰腺癌CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,靶向沉默人胰腺癌CFPAC-1细胞中的EphB2基因的表达,观察EphB2对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建靶向EphB2基因的siRNA干扰质粒,通过Lipofectamine^TM2000将干扰质粒转染进293T细胞,筛选出能有效抑制EphB2蛋白表达的干扰序列。构建含有效序列的慢病毒载体pLentiGFP-EphB2,感染CFPAC-1细胞,筛选出稳定干扰EphB2蛋白表达的CFPAC-1细胞系。定量PCR、Western blotting检测CFPAC-1细胞中EphB2mRNA和蛋白的表达,CCK8法和流式细胞术检测EphB2下调对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响。结果:成功构建了EphB2慢病毒干扰载体pLentiGFP-EphB2,获得稳定转染pLentiGFP-EphB2的CFPAC-1细胞（CFPAC-1 EphB2 RNAi）。CFPAC-1EphB2 RNAi细胞中EphB2 mRNA和蛋白表达较空载体组显著降低,EphB2 mRNA的沉默效率为63%。与空载体组和未转染组相比,pLentiGFP-EphB2感染显著促进CFPAC-1细胞的增殖（1.89±0.17vs1.63±0.13、1.71±0.22,P<0.05）,抑制细胞的凋亡[（7.02±1.27）%vs（13.37±1.89）%、（15.71±2.35）%,P<0.05]。结论:pLentiGFP-EphB2可有效下调胰腺癌CFPAC-1细胞中EphB2的表达,促进CFPAC-1细胞增殖和抑制其凋亡。     

CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的： 应用分子克隆技术,构建CYP2E1基因过表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定,为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法：根据GenBank提供的CYP2E1 基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果：测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致,荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍,Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论：成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株,可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制 研究。     

干扰PRMT5表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定

目的探讨干扰蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定。方法针对PRMT5设计出该基因的有效短发夹RNA(shRNA)片段,选择合适慢病毒载体,通过基因工程技术,构建出PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体,并通过PCR以及测序检测构建序列的正确性。将重组病毒载体在病毒包装细胞中大量生产后,用病毒原液感染PRMT5表达量相对较高的SMMC-7721、BEL-7402细胞,2 d后,用最低杀死浓度的嘌呤霉素进行筛选,得到克隆样生长的细胞,扩大培养后分别提取蛋白和RNA,Western印迹和q PCR检测PRMT5的表达。结果成功构建出由人源性PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体p LKO.1-sh-PRMT5,PCR及测序均证明构建序列的正确。Western印迹法和q PCR检测,p LKO.1-sh-PRMT5干扰组的PRMT5蛋白及mRNA水平明显低于p LKO.1-sh-GFP组(P0.05),p LKO.1-sh-PRMT5载体具有良好的干扰效果。结论运用慢病毒感染并筛选出稳转细胞株,在干扰效率及经济角度均优越于瞬时转染,为今后研究PRMT5在肝癌细胞中作用功能提供了良好的科研工具。     

siRNA沉默EphB2表达对胰腺癌CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,靶向沉默人胰腺癌CFPAC-1细胞中的EphB2基因的表达,观察EphB2对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响.方法:构建靶向EphB2基因的siRNA干扰质粒,通过LipofectamineTM2000将干扰质粒转染进293T细胞,筛选出能有效抑制EphB2蛋白表达的干扰序列.构建含有效序列的慢病毒载体pLentiGFP-EphB2,感染CFPAC-1细胞,筛选出稳定干扰EphB2蛋白表达的CFPAC-1细胞系.定量PCR、Western blotting检测CFPAC-1细胞中EphB2mRNA和蛋白的表达,CCK8法和流式细胞术检测EphB2下调对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响.结果:成功构建了EphB2慢病毒干扰载体pLentiGFP-EphB2,获得稳定转染pLentiGFP-EphB2的CFPAC-1细胞(CFPAC-1 EphB2 RNAi).CFPAC-1EphB2 RNAi细胞中EphB2 mRNA和蛋白表达较空载体组显著降低,EphB2 mRNA的沉默效率为63％.与空载体组和未转染组相比,pLentiGFP-EphB2感染显著促进CFPAC-1细胞的增殖(1.89±0.17 vs l.63 ±0.13、1.71 ±0.22,P＜0.05),抑制细胞的凋亡[(7.02±1.27)％vs(13.37±1.89)％、(15.71±2.35)％,P＜0.05].结论:pLentiGFP-EphB2可有效下调胰腺癌CFPAC-1细胞中EphB2的表达,促进CFPAC-1细胞增殖和抑制其凋亡.     

过表达FAF1基因慢病毒构建及对人胃癌细胞凋亡影响

目的：构建过表达FAs相关因子1（fas-associatedfactorl,FAF1）基因的慢病毒载体,探讨其对胃癌细胞凋亡的影响。方法：RT-PCR法扩增FAF1cDNA,亚克隆至GV218质粒中,经酶切及DNA测序鉴定正确以后,把含有FAF1基因的重组质粒与pHelper1．0和pHelper2．0载体质粒转染至293T细胞包装慢病毒。用包装好的慢病毒感染人胃癌细胞HGD27,RealtimePCR和蛋白质印迹法检测转染前后FAF1基因和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡的改变。结果：FAF1基因扩增产物长度为1996bp,酶切及测序结果鉴定GV218-FAF1质粒构建正确,成功包装的慢病毒滴度为2×10^8TU／mL。HGC-27细胞转染FAF1过表达慢病毒48h后,细胞形态由长梭形变得不规则。过表达FAF1慢病毒转染组FAF1基因mRNA表达水平2．436±0．538,是阴性对照组1．086±0．226的2．24倍,P〈0．001;是空载转染组1．182±0．381的2．06倍,P〈0．001。过表达FAF1慢病毒转染组FAF1蛋白相对表达水平1.515±0．377,显著高于阴性对照组的0,P〈0．001;也显著高于空载转染组的0,P〈0．001。过表达FAF1慢病毒转染组凋亡率（84．66±5．92）％显著高于阴性对照组的（4．60±3．80）％,P〈0．001;也显著高于空载转染组的（7．32±3．82）％,P〈0．001。结论：成功构建并鉴定FAF1基因过表达慢病毒载体,FAF1基因表达上调使胃癌细胞凋亡增加。     

慢病毒载体过表达SATB1蛋白对乳腺癌细胞侵袭性的影响

目的构建SATB1基因过表达的慢病毒载体,检测其在MCF-7乳腺癌细胞中的表达及对癌细胞侵袭性的影响。方法应用DNA重组技术,将SATB1基因插入到含有绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体质粒GV287中,获得重组载体,经测序鉴定后转染293T细胞产生慢病毒载体GV287-SATB1,用GV287-SATB1转染人乳腺癌MCF-7,Western blot分析转染前后SATB1表达情况,穿膜实验检测MCF-7细胞的侵袭性。结果成功构建人MCF-7细胞SATB1基因过表达慢病毒载体,MCF-7细胞转染慢病毒载体后SATB1蛋白表达水平显著上调,细胞的侵袭性显著增强。结论 SATB1基因过表达的慢病毒载体,可在MCF-7乳腺癌细胞中过表达SATB1蛋白,并显著增强MCF-7细胞的侵袭性。     

TAGLN基因过表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 研究TAGLN基因过表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力和侵袭能力的影响及其分子机制.方法 对MDA-MB-231细胞采用慢病毒表达系统构建TAGLN基因稳定过表达细胞株,将MDA-MB-231细胞正常培养设为空白对照组,空载体慢病毒包装感染MDA-MB-231细胞后获得的稳定转染细胞株设为空载体对照组.Real time PCR和Western blot检测TAGLN mRNA和蛋白表达,划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测TAGLN基因过表达后基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9蛋白表达变化.结果 MDA-MB-231细胞感染TAGLN基因过表达慢病毒载体后,细胞中TAGLN mRNA表达和蛋白表达升高(均P＜0.01),成功构建TAGLN基因过表达稳定细胞株(231-TAGLN).231-TAGLN细胞的体外迁移能力和侵袭能力下降,与空载体对照组和空白对照组细胞比较,差异均具有统计学意义(均P＜0.01),同时伴有MMP-2和MMP-9表达水平降低(均P＜0.01).结论 TAGLN基因过表达可以抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭,MMP-2和MMP-9基因表达下降可能参与这一过程.     

cIAP1基因的RNA干扰载体的构建及其对卵巢癌细胞的生物学影响

目的 构建针对cIAP1基因的慢病毒shRNA表达载体并稳定转染人卵巢癌Skov3细胞,观察该基因对卵巢癌细胞的影响。方法 设计合成针对cIAP1的shRNA重组质粒表达载体,并筛选出最有效的干扰序列,获取pGPU6-cIAP1-shRNA稳定表达细胞株。RT-PCR及Western blot检测转染组Skov3细胞cIAP1基因mRNA及蛋白表达的水平,MTT法检测细胞生长,绘制生长曲线。结果 测序验证针对cIAP1的shRNA重组质粒构建成功,并筛选cIAP1-2534为最佳干扰序列;流式细胞术分析cIAP1 shRNA载体的转染效率可达74.7%,RT-PCR及Western blot检测干扰组Skov3细胞的cIAP1基因mRNA及蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。MTT实验结果显示干扰组细胞的OD值显著低于正常组细胞(P＜0.05),干扰组细胞的生长速度明显慢于正常组(P＜0.05)。结论 针对cIAP1基因的慢病毒shRNA表达载体可以有效抑制Skov3细胞中该基因的表达,cIAP1基因表达下调能在一定程度上抑制卵巢癌Skov3细胞的体外增殖能力及细胞侵袭能力。     

肺腺癌细胞S100A6基因siRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的:构建肺腺癌细胞S100A6基因siRNA慢病毒载体并鉴定。方法:慢病毒载体（pLenR-GPH）构建靶向S100A6基因的RNA干扰重组体,用以建立S100A6基因稳定沉默的肺腺癌A549细胞株。结果:PCR鉴定结果显示3个扩增的阳性片段均已插入pLenR-GPH载体,测序结果证实三个重组慢病毒载体SH1、SH2、SH3的插入序列完全正确,重组慢病毒载体转染到293T细胞中包装成病毒颗粒,将其感染肺癌A549细胞后,RT-PCR和Western blot检测结果均证实三组重组体感染的细胞内S100A6 mRNA和蛋白的表达受到不同程度的抑制,沉默效率分别为98.29%、84.05%及78.24%。结论:成功构建了S100A6基因RNAi慢病毒重组载体,并建立了其稳定表达的肺腺癌A549细胞株,为探讨S100A6基因对肺腺癌生物学行为的影响提供了可靠的细胞模型。     

miR - 21 慢病毒表达载体的构建及稳定转染 U266 细胞系

目的：构建miR-21慢病毒表达载体,感染多发性骨髓瘤（MM）细胞U266,建立稳定表达miR一21的U266细胞系。方法：以has—miR-21前体序列pre—miR-21为模板,设计并合成引物,进行PCR扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒LV—anti中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,所构建载体命名为LV—anti—miR-21-MOI。再进行miR-21基因慢病毒LV—anti—miR-21的包装及病毒滴度测定,将慢病毒颗粒以最适滴度感染MM细胞株U266,通过Aldefluor流式分选出带有目的基因和空载病毒的细胞,用real—timePCR检测感染效率。结果：目的基因与慢病毒载体连接成功。慢病毒LV—anti—miR-21浓缩后的病毒滴度约为1．0×108TU／ml。慢病毒成功感染目标细胞U266,转染效率达90％以上。real—timePCR检测,U266／LV—anti—miR-21慢病毒MOI20组和MOI40组miR-21表达量分别为0．69±0．03和0．51±0．05较U266／un组（1．08±0．05）下降了38．9％和54．9％,差异有显著统计学意义（P〈0．05）。结论：成功构建了miR-21慢病毒表达载体,并建立U266-miR-21稳定转染细胞系。为进一步研究miR-21的功能及作用机制奠定了基础。     

跨膜接头蛋白PAG1过表达对皮肤鳞癌细胞A431运动能力的影响

目的 研究跨膜接头蛋白PAG1过表达对人皮肤鳞状细胞癌A431运动能力的影响。方法 构建PAG1-EGFP融合蛋白的慢病毒表达载体,采用反转录病毒转染的方法建立PAG1过表达的A431细胞株,实验分为3组：亲本细胞组（未进行基因转染的A431细胞）、对照组（A431细胞转染仅含EGFP阴性对照病毒）、实验组（A431细胞转染PAG1-EGFP病毒）。流式细胞术检测细胞转染率,实时荧光定量PCR及Western blot检测转染后PAG1 mRNA及其蛋白表达,进一步验证细胞转染成功与否;利用划痕修复实验、Transwell迁移实验、侵袭实验三种不同的方法检测PAG1基因的过表达是否会对皮肤鳞癌细胞的生长、迁移和侵袭能力产生影响。 结果 实验组和对照组目的基因病毒的转染表达率分别为（94.97±0.15）%、（94.60±0.35）%;实验组细胞中PAG1基因mRNA的表达量约为亲本细胞组的1.6倍（P=0.000）,转染后实验组中PAG1蛋白的相对表达水平明显增加（P=0.000）,建立了稳定过表达PAG1的A431细胞系;PAG1过表达明显降低A431细胞愈合率（P=0.000）;实验组A431细胞迁移、侵袭能力明显降低（P=0.001, P=0.000）。结论 PAG1的过表达能抑制人皮肤鳞癌细胞运动能力,影响肿瘤的浸润及远处转移。     

MicroRNA-194过表达与抑制表达慢病毒载体的构建及对骨肉瘤细胞转染与筛选的方法学研究

目的：构建针对人microRNA—194过表达及抑制表达的慢病毒表达载体,寻找与探讨感染人骨肉瘤细胞系SO-SP-9607和U2-os的最佳步骤和方法。方法：利用PcR方法调取相应目的基因进行酶切,经电泳回收后与目的基因进行连接,产物转化细菌感受态细胞,对克隆进行PcR鉴定和测序对比分析后,构建相应microRNA—194过表达及抑制表达慢病毒表达载体;在人骨肉瘤细胞系SO-SP-9607和U2—os转染及筛选过程中,根据不同阶段及浓度设定相应实验组,并设相应对照组。倒置显微镜观察转染效率,筛选情况,进行比较。结果：PCR及测序结果证实重组慢病毒表达质粒构建正确。过表达及抑制表达重组慢病毒的滴度分别为15×10^8TU／ml及4×10^8TU／ml。感染复数（multiply of infection,MOI）值测定,实验组及对照组转染效率无明显差异,获得MOI值及感染时间数据。通过新的综合设计,经筛选后获得转染效率满意的目的克隆细胞。结论：成功构建了microRNA—194过表达及抑制表达慢病毒表达载体,并通过新的综合考虑设计,对人骨肉瘤细胞系SO-SP-9607和U2-os进行转染和筛选后,可较快和较高效率获得满意目的细胞。     

慢病毒介导的RNA干扰技术构建hOGG1和hMTH1基因缺陷细胞模型

目的：分别建立8-羟基鸟嘌呤糖苷酶1（human 8-hydroxyguanine glycosylase,hOGG1）基因和8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶（human Mut T homlogue,hMTH1）基因缺陷细胞模型,为进一步研究两个基因的相互关系提供理想的研究平台。方法：利用慢病毒载体介导的小发夹状RNA（small hairpin RNA,shRNA）转入人胚胎肾细胞（293FT）包装慢病毒,用所得到的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞（HFL）,杀稻瘟菌素筛选稳定表达的细胞株,荧光显微镜下观察慢病毒的包装效率和感染效率,Real-time RT-PCR鉴定基因干扰效果。结果：得到了滴度较高的慢病毒,感染靶细胞后得到hOGG1基因和hMTH1基因缺陷细胞模型,hOGG1 mRNA和hMTH1mRNA表达水平分别比正常HFL细胞下降了90%和60%。结论：通过慢病毒包装技术,成功构建hOGG1基因和hMTH1基因缺陷细胞模型。     

小分子蛋白慢病毒表达系统的构建

目的构建趋化因子蛋白慢病毒表达系统，建立稳定表达GFP的卵巢癌细胞系，为研究趋化因子蛋白的功能及作用机制打下基础。方法趋化因子CCL18、IL-8、CXCL1基因克隆质粒经PCR扩增、酶切，与慢病毒载体PWPI连接，构建的重组慢病毒质粒按比例与包膜质粒PCMV—dR8．74及包装质粒PMD2．G混合，LipofectinTM2000共转染293T细胞系包装病毒颗粒，病毒液感染卵巢癌SKOV3细胞后，采用流式细胞仪分选出GFP表达的细胞作为转染成功的细胞。实时荧光定量PCR验证转染后目的基因的表达，Westernblot验证目的蛋白的表达。结果重组慢病毒基因能高效地转导入靶细胞，转导效率达95％以上，并稳定表达；实时荧光定量PCR检测结果显示：细胞和组织中转染目的基因组与对照组比较，均见目的基因的表达显著：噌高（P〈0．05）；Westernblot验证转染目的基因组小分子蛋白成功表达。结论本实验成功构建了小分子蛋白慢病毒表达系统，为进一步研究小分子蛋白在人体的功能及作用机制建立了实验基础。     

CDK2AP1 基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建CDK2AP1基因慢病毒过表达载体,感染人口腔鳞癌细胞系SCC-25细胞系中,为CDK2API基闲体内外实验研究奠定实验基础。方法：将pCDH—CMV—GFP慢病毒载体sall和XbaI酶切位点插入CDK2APl基因序列,构建pCDH—GFP—CDK2API慢病毒质粒。经PCR鉴定、测序验证CDK2API基因后,将其和慢病毒包装质粒混合物共同转染病毒包装细胞293TN,转染24小时后产生藿组病毒GFP—CDK2API慢病毒颗粒。经病毒浓缩纯化后,感染SCC-25口腔鳞痛细胞系并测定感染效率。结果：GFP—CDK2AP1病毒中携有转染正确的CDK2API璀因,感染人SCC-25细胞系后能稳定表达。结论：成功地在舌鳞癌细胞系SCC-25中构建了CDK2APl基因的重组慢病毒过表达载体,为研究其住头颈鳞癌的生物学功能奠定基础。     

Wilms瘤基因1低表达和过表达乳腺癌细胞模型的建立

目的 应用RNA干扰（RNAi）和RNA激活（RNAa）技术,分别构建小干扰RNA（siRNA）和双链RNA（dsRNA）,建立Wilms瘤基因1（WT1）低表达和过表达的乳腺癌细胞模型.方法 以国外学者提供的3条序列（siRNA-516 、siRNA-803、siRNA-1029）构建WT1 siRNA干扰表达WT1,以研究已证实可上调WT1表达的序列（dsRNA-319）构建dsRNA过表达WT1,通过脂质体（LipofectamineTM2000）分别将siRNA和dsRNA转入MDA-MB-321和MCF-7细胞.WT1有效siRNA筛选实验分为6组：WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029、阴性对照、脂质体组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后24、48、72 h.WT1 dsRNA的筛选实验分为3组：WT1 dsRNA-319、阴性对照组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后48、72、96 h.通过实时定量PCR（qRT-PCR）和Westem Blotting筛选作用效果最明显的siRNA和dsRNA.使用单因素方差分析进行统计学分析.结果 成功构建WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803和WT1 siRNA-1029共3个siRNA,并转染到MDA-MB-231细胞中,转染效率达90％以上.上述3个WT1 siRNA均能够抑制WT1 mRNA和蛋白的表达,以转染后48 h WT1 siRNA-1029的效果最为显著[WT1 siRNA-1029组WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著降低（0.49±0.02比1.00±0.08,P=0.00）,其蛋白表达水平也明显降低].成功将WT1 dsRNA-319转染到MCF-7细胞中,转染效率达90％以上.50 μmol/L的WT1 dsRNA-319转染后96 h,MCF-7细胞的WT1过表达最为显著[WT1 dsRNA-319组的WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著升高（319.06±14.84比1.00±0.07,P=0.00）,其蛋白表达水平也明显升高].结论 成功建立低表达WT1的MDA-MB-231细胞和过表达WT1的MCF-7细胞模型,为后续进一步研究WT1在乳腺癌中的生物学行为奠定了基础.