OCT4基因在胃癌细胞系中的表达及其意义

【摘要】 目的 检测八聚体结合蛋白-4（octamer-binding protein-4,OCT4）基因在不同分化程度的胃癌细胞株（MKN-28、SGC-7901、BGC-823）及正常胃黏膜细胞株GES-1中的表达情况,研究OCT4基因表达水平与胃癌细胞分化程度和侵袭力的相关性。方法 RT-PCR确定GES-1、MKN-28、SGC-7901、BGC-823中OCT4基因的表达水平,OCT4 siRNA转染BGC-823细胞,分别通过荧光定量PCR和Western blot检测干扰OCT4基因表达的效果,并利用Transwell小室法研究OCT4在BGC-823细胞侵袭力中的作用。结果 正常人胃黏膜细胞中未检测到OCT4的表达,人胃癌细胞系分化程度越低,OCT4基因表达量越高,低分化人胃癌细胞系BGC-823中OCT4基因表达最高,转染OCT4 siRNA的BGC-823细胞内的OCT4 mRNA和OCT4蛋白表达量明显下降（P＜0．05）。干扰胃癌细胞BG-823中OCT4基因的表达,穿膜细胞数量减少（P＜0．05）,侵袭力下降。结论 OCT4基因表达量与胃癌细胞的分化程度有关,OCT4基因可能在胃癌细胞的分化中起重要作用,影响胃癌细胞的侵袭能力,其表达程度有望成为胃癌患者恶性度预测的参考指标之一。     

抑制组织蛋白酶B表达对胃癌BGC-823细胞黏附、增殖和侵袭的影响

目的 探讨抑制组织蛋白酶B表达对胃癌BGC-823细胞黏附、增殖和侵袭的影响.方法 构建针对CB的siRNA表达载体,脂质体LipofectAmineTM2000转染胃癌细胞株BGC-823.荧光定量RT-PCR和免疫印迹检测CB在各组胃癌细胞中的表达水平;细胞黏附实验检测各组胃癌细胞的黏附能力;细胞侵袭性实验检测各组胃癌细胞的侵袭能力;细胞增殖实验检测各组胃癌细胞的增殖能力.结果 与空白对照组和无关siRNA对照组相比,沉默1组和沉默2组细胞中,CB mRNA的相对表达量显著降低(P ＜0.01);CB蛋白表达被显著抑制;纤维粘连蛋白和基质胶黏附的胃癌细胞数目以及穿透基质胶的胃癌细胞数显著降低(P＜0.05);并且在2d、3d、4d及5d细胞孔内的吸光度值亦显著减少,差异有显著性(P＜0.05).而在无关siRNA对照组和空白对照组之间,CB mRNA的相对表达量、两组的黏附细胞数目以及两组穿透基质胶的细胞数都无显著性差异(P＞0.05).结论 设计针对CB基因的siRNA片段构建的siRNA载体能够有效干扰胃癌BGC-823细胞中CB mRNA和蛋白的表达.抑制胃癌BGC-823细胞CB基因表达,可以降低胃癌细胞的生长速度、降低胃癌细胞与基质黏附能力、降低胃癌细胞侵袭和转移的能力.     

RNA干扰下调midkine基因表达对人乳腺癌细胞粘附和侵袭力的影响

目的探讨中期因子（midkine,MK）基因siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA—MB-231、MDA—MB-435、MDA—MB-468及ZR75—1细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测MK基因mRNA表达;筛选出MK表达最高者。采用MK siRNA转染乳腺癌细胞株,分别以荧光实时定量RT—PCR和免疫荧光方法观察MK基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝（MTT）比色法检测细胞粘附性,以Boyden小室方法检测癌细胞侵袭能力。结果7株乳腺癌细胞中,MK均有不同程度的表达,以MCF-7细胞最高;以MKsiRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞MK基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;siRNA转染组细胞粘附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降,均呈浓度依赖性（P〈0．01;P〈0．01）。结论MK基因在乳腺癌细胞粘附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞粘附和侵袭能力。     

HES1对胃癌细胞株增殖､凋亡及迁移能力的影响

目的:探讨siRNA靶向HES1对胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901增殖?凋亡及迁移能力的影响?方法:采用荧光实时定量PCR(qPCR)法检测胃癌组织及胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901的HES1水平,采用脂质体法将2条靶向HES1的siRNA片段(siHES1-1和siHES1-2)高效转染至BGC-823和SGC-7901细胞,经qPCR法检测后选取抑制效率最高的siRNA进行后续功能学研究;分别采用MTT?流式细胞术及Transwell法检测转染后BGC-823和SGC-7901细胞的增殖?凋亡及迁移能力的改变?结果:71例胃癌组织的HES1 mRNA水平高于59例癌旁组织,BGC-823和SGC-7901细胞的HES1 mRNA水平明显高于正常胃黏膜细胞株GES-1(P < 0.05);转染HES1 siRNA可降低BGC-823和SGC-7901细胞的HES1水平,此外,较转染对照组细胞,其存活率及穿膜细胞数目明显降低,凋亡率明显升高(P < 0.05)?结论:胃癌组织及细胞株中的HES1高表达,靶向沉默HES1可抑制胃癌细胞增殖及迁移并诱导细胞凋亡?     

RNA干扰沉默STAT3基因对胃癌细胞侵袭力的影响

目的观察瞬时转染信号传导与转录激活因子3（STAT3）小干扰RNA（siRNA）后对人胃癌细胞SGC-7901侵袭力的影响,探讨干扰STAT3后降低胃癌细胞侵袭力的机制。方法以人胃癌细胞系SGC-7901为研究对象,培养瞬时转染特异性siRNA的SGC-7901细胞系,通过RT-PCR、免疫细胞化学、Transwell体外侵袭实验等检测该siRNA对SGC-7901细胞STAT3及MMP-9基因表达和对细胞侵袭转移能力的影响。结果STAT3 siRNA转染SGC-7901细胞48 h后,STAT3 mRNA水平下降了73.04%,MMP-9 mRNA水平下降了57.2%;Transwell体外侵袭实验显示,STAT3 siRNA组能显著抑制SGC-7901的侵袭力（P〈0.01）。结论应用siRNA技术能有效抑制SGC-7901STAT3基因的表达,进而可能通过抑制MMP-9基因的表达,降低细胞的侵袭力,为以STAT3为靶向的胃癌基因治疗提供了新的思路和方法。     

COL1A1-shRNA表达载体的构建及对胃癌细胞增殖迁移的影响

目的:构建COL1A1特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外评价其对胃癌细胞BGC-823增殖迁移的影响.方法:根据文献获得3个COL1A1的siRNA靶序列,设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencerTM 4.1- CMV neo线性质粒载体连接,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选获得重组质粒;经DNA测序鉴定重组体DNA序列正确后转染胃癌BGC-823细胞,利用G418筛选稳定表达COL1A1-shRNA的BGC-823细胞株.通过实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后细胞COL1A1在mRNA及蛋白质水平的表达;MTT法及Transwell法检测COL1A1干扰后胃癌细胞增殖及迁移能力的变化.结果:序列测定表明成功构建3个COL1A1-shRNA表达载体.实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测显示,COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞的COL1A1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);MTT试验及Transwell迁移试验显示,转染后细胞增殖及迁移能力明显降低(P<0.05).结论:COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞能有效抑制细胞COL1A1的表达及癌细胞的增殖迁移.     

低氧环境下转染血管内皮生长因子165对人胃癌细胞体外侵袭转移的影响

目的:探讨低氧环境下血管内皮生长因子165(VEGF-165)对人胃癌细胞侵袭转移的影响及可能的机制。方法:实验分为4组:以利用腺病毒作为载体并已构建成功含VEGF-165基因的重组腺病毒(Ad-VEGF-165)进行瞬时转染,同时用低氧诱导剂氯化钴进行低氧干预的人胃癌细胞株BGC-823为低氧转染(D)组;单纯用低氧诱导剂氯化钴进行低氧干预的人胃癌细胞株BGC-823为单纯低氧干预(B)组;以利用腺病毒作为载体并已构建成功含VEGF-165基因的重组腺病毒(Ad-VEGF-165)进行瞬时转染的人胃癌细胞株BGC-823为单纯转染(C)组;以未转染未行低氧干预的正常细胞作为空白对照(A)组。应用Transwell小室分析低氧环境下VEGF165转染前后胃癌细胞迁移能力的变化;利用半定量RT-PCR方法对4组细胞中尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、基质金属蛋白质酶2(MMP-2)的mRNA表达水平进行分析。结果:D组胃癌细胞的侵袭能力及uPA、MMP-2的mRNA表达明显高于A、B、C组(P<0.05)。结论:低氧环境和VEGF-165因子共同作用能够明显提高人胃癌细胞BGC-823的侵袭能力及细胞中uPA、MMP-2的mRNA的表达,表明低氧环境下VEGF-165促进肿瘤细胞的侵袭转移。     

去甲基化药物对胃癌细胞中K A I1基因表达水平影响初探

目的 分别检测正常胃黏膜、低分化胃癌细胞株BGC-823及使用去甲基化药物后胃癌细胞株BGC-823中KAI1基因的表达情况,对胃癌细胞中KAI1基因甲基化对KAI1基因mRNA表达水平的影响做一个初步的探讨.方法 首先采用BSP法分别检测了正常胃黏膜与去甲基化药物使用前后胃癌细胞株BGC-823中KAI1基因甲基化的水平.其次,采用RT-PCR法分别检测正常胃黏膜与去甲基化药物使用前后胃癌细胞株BGC-823中KAI1基因mRNA量的变化.结果 BSP法检测结果显示BGC-823细胞中KAI1基因出现明显甲基化,正常胃黏膜组织中KAI1基因则未见甲基化;RT-PCR结果显示正常胃黏膜中KAI1基因mRNA表达量达66.68%,而未使用去甲基化药物的BGC-823细胞中KAI1基因mRNA表达量与使用去甲基化药物的胃癌细胞株BGC-823组比较提高了3倍.结论 KAI1基因在胃癌细胞中表现出明显去甲基化,使用去甲基化药物可使胃癌细胞中KAI1的mRNA表达水平明显提高.     

RNA干扰对胃癌细胞Cullin1基因表达及细胞黏附的抑制作用

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）对胃癌BGC823和MGC803细胞中Cullin1（Cul1）基因表达及细胞黏附力的影响.方法 体外化学合成Cul1 siRNA（si-Cul1）序列,同时合成Control siRNA（si-Ctrl）作为对照,在siLentFect Lipid Reagent介导下转染胃癌BGC823和MGC803细胞,Western blot检测Cul1蛋白及Src和FAK蛋白表达水平,用fibronectin包被96孔板行细胞黏附分析.结果 Cul1 干涉后胃癌BGC823和MGC803细胞株中Cul1、Src和FAK蛋白的表达均下降,同时胃癌细胞黏附于fibronectin包被板的能力降低.结论 Cul1 siRNA可以有效干涉胃癌BGC823和MGC803细胞中Cul1基因的表达,Cul1干涉后可能通过下调Src和FAK的表达水平进而降低胃癌细胞的黏附能力.     

RNA干扰沉默中期因子基因表达诱导肝癌细胞凋亡

目的:探讨RNA干扰(RNA interference)沉默中期因子(midkine,MK)基因表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响.方法:根据中期因子基因mRNA序列特点,设计合成中期因子基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染肝癌SMMC 7721细胞后,分别以实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中期因子表达情况,分别通过检测caspase-3活性和琼脂糖凝胶电泳方法了解肝癌细胞凋亡,以软琼脂集落培养试验检测对各组细胞增殖的影响.结果:中期因子siRNA可有效抑制肝癌细胞中期因子 mRNA和蛋白水平.转染组肝癌细胞caspase-3活性增高,呈浓度和时间依赖性;转染组出现明显的DNA条带.中期因子转染组细胞增殖受到明显抑制,且呈浓度依赖性.结论:采用RNA干扰沉默肝癌细胞中期因子基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导凋亡.     

体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响。方法应用实时定量PCR方法检测七株胃癌细胞株中REG4基因的mRNA表达。针对REG4基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3),瞬时转染高表达胃癌细胞株。用RT-PCR方法检测转染后REG4基因的mRNA表达水平、MTT法检测细胞增殖能力、AnnexinV-PI法检测细胞凋亡水平。结果以永生化正常胃粘膜细胞株GES-1作为参照。MKN-45和AGS胃癌细胞株中REG4表达水平升高200倍以上,遂选用AGS细胞进行RNA干扰。RT-PCR结果证实siRNA2、siRNA3均有干扰效果,尤以siRNA3效果明显。选用siRNA3干扰AGS细胞株,MTT实验结果证实干扰AGS后,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。AnnexinV-PI实验结果显示细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论干扰REG4基因具有抑制胃癌细胞增殖、促进凋亡的作用,REG4基因可能成为胃癌基因靶向治疗的新靶点。     

鸟苷酰环化酶C小干扰RNA对胃癌细胞生长的影响

目的：研究靶向鸟苷酰环化酶C（Guanylyl cyclaseC,GC-C）的小干扰RNA（siRNA）对人胃癌SGC-7901细胞体外生长能力的影响。方法：利用pSilencer TM4.1-CMVneo通过siRNA表达载体法制备GC-CsiRNA。将GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光观察转染前后胃癌细胞GC-C基因的表达变化,黏附实验观察转染前后胃癌细胞黏附能力。结果：构建的GC-CsiRNA测序鉴定与设计完全相符。GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,明显抑制GC-C基因的表达。转染后,GC-CmRNA和蛋白表达分别抑制了66.7%和75.8%,细胞黏附能力较对照组减弱（P〈0.05）。结论：靶向GC-C的siRNA可明显下调靶基因GC-C的表达,在体外抑制胃癌SGC-7901细胞的黏附,提示GC-C基因与胃癌的发生、发展有密切的关系。     

生长抑素2型受体mRNA在人胃上皮永生细胞及肿瘤细胞株？…

目的 了解多种癌细胞上是否较广泛表达生长抑素２型受体,同时了解ｐ５３０突变与否对生长抑素２型受体的表达有无影响。方法 用ＲＴ－ＰＣＲ和克隆的人生长抑素２型受体ｃＤＮＡ为探针检测人胃上皮永生细胞、人胃癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞共１０株细胞上该受体ｍＲＮＡ的表达。结果 发现除１株胰腺癌细胞外,其余９个细胞株均表达生长抑素２型受体。一株胃癌细胞分别转染了野生型和突变型的ｐ５３基因,也同样     

Inhibition of the proliferation of human gastric cancer cells SGC-7901 in vitro and in vivo using Bcl-2 siRNA

Background Bcl-2, the anti-apoptotic protein is overexpressed in the majority of gastric cancers and associated with its pathogenesis. To better understanding of the role of Bcl-2, RNA interference （RNAi） was used to inhibit Bcl-2 expression in the human gastric cancer cells in vitro and in vivo. Methods Bcl-2 small interfering RNA （siRNA） was transfected into human gastric cancer cells $GC-7901, and Bcl-2 expression was monitored by real-time polymerase chain reaction （PCR） and Western blot. Cell proliferation, apoptosis, and telomerase activity were examined by MTT, flow cytometry, and TRAP assay, respectively. Gastric cancer cells treated with 100 nmol/L Bcl-2 siRNA were subcutaneously transplanted into nude mice and tumor growth was assessed. Results Bcl-2 siRNA significantly inhibited the expression of Bcl-2 in human gastric cancer cells at both mRNA and protein levels in a time- and dose-dependent manner. Bcl-2 siRNA also decreased telomerase activity （by 78.76%） and increased the rate of apoptosis （by 37.47%）. SGC-7901 cell growth was also significantly suppressed in vivo and in vitro. Conclusions Bcl-2 expression knockdown suppressed the growth of gastric cancer cells. Thus, Bcl-2 may play a very important role in carcinogenesis of gastric cancer and its knockdown may offer a new potential gene therapy approach for human gastric cancer in future.     

白介素32在胃癌细胞中的表达及意义

目的观察白介素32(IL-32)在胃癌细胞株中的表达情况,探讨其在胃癌发生、发展中的意义。方法采用逆转录PCR、real-time PCR及Western blot法分别从基因和蛋白水平上检测IL-32在正常胃上皮细胞GES-1以及胃癌细胞株MKN-45、KATO中的表达情况。结果逆转录PCR及real-time PCR结果均显示胃癌细胞IL-32 mRNA表达水平明显高于正常胃上皮细胞,逆转录PCR灰度比值(目的 /内参)为:GES-1(0.34±0.09)、MKN-45(0.79±0.11)、KATO(0.90±0.17),差异有统计学意义(P<0.05)。real-time PCR Ct值显示:MKN-45的IL-32基因表达量是GES-1的(5.34±1.09)倍,KATO是GES-1的(4.07±1.69)倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示IL-32在蛋白表达水平的结果与前一致,灰度比值(目的 /内参)为:GES-1(0.30±0.10)、MKN-45(0.92±0.32)、KATO(0.86±0.15),差异有统计学意义(P<0.05)。结论IL-32在胃癌细胞株中呈高表达,推测其可能在胃癌的发生、发展中起一定作用。     

Inhibition of cell proliferation by siRNA targeting hPRLR in breast cancer MCF-7 cell line

Objective： To study the inhibition of proliferation of breast cancer by small interfering RNA（siRNA） targeting human prolactin （hPRLR） and the underlying mechanisms. Methods：The siRNA targeting hPRLR was chemically synthesized and transfected into MCF-7 cells, the expression of hPRLR was analyzed by real-time quantitive PCR, cell growth inhibition was measured with MTT assay, cell cycle of the transfected cells was examined by flow cytometry, meanwhile, expression of cyclin D1 was tested by semi-quantitative RT-PCR, Results：24 h after transfection with 100 nmol/L siRNA-PRLR, the expression of hPRLR mRNA was suppressed by 65%, cells in G1 phase increased, but cells in S phase decreased. Down regulated hPRLR expression exhibited significant inhibition in cell proliferation. And the expression of cyclin D 1 was down regulated. Conclusion：The results indicate that siRNA-hPRLR is a useful tool for silencing hPRLR expression and inhibiting cell proliferation in breast cancer MCF-7 cell line, and it may be a possible new approach for breast cancer gene therapy.     

榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响

目的：观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶（hTERT）表达及其启动子的影响，以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法：以榄香烯乳处理胃癌细胞，分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中，2h后加入不同浓度的榄香烯乳，孵育48h后，分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果：榄香烯乳处理后，胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降，且呈浓度依赖性。结论：榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性，抑制hTERT表达，从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。     

沉默人肺癌A 549细胞中期因子基因表达对细胞凋亡的影响

目的：研究RNA干扰（RNAi）人肺癌A549细胞中期因子（MK）基因表达及对肿瘤细胞凋亡的影响。方法构建含MK siRNA真核表达载体,将其转染到人肺癌A549细胞株中（实验组）,另有阴性对照组（转染阴性对照质粒）和空白对照组。应用RT‐PCR的方法检测各组细胞中MK mRNA的表达情况;采用Western blot法检测MK蛋白的表达情况;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果实验组MK蛋白和mRNA表达都下降,分别下降了89．3％和83．3％。转染实验组A549细胞有自发性凋亡的发生,早期凋亡比阴性对照组和空白组分别提高了15．5倍和9．34倍。实验组caspase‐3活性明显高于阴性对照组和空白对照组（P＜0．05）。结论 RNAi下调人肺癌A549细胞株MK的表达,可诱导肿瘤细胞的自身凋亡。