小RNA干扰对高表达RegIα基因胃癌细胞株增殖的影响

目的:探讨小RNA干扰(small interfering RNA,RNAi)对胃癌细胞株RegIα基因表达的抑制作用及对细胞增殖和凋亡的影响。方法:RT-PCR检测6株胃癌细胞的RegIα基因mRNA表达水平;体外构建RegIα基因小RNA干扰的重组质粒,分别稳定转染RegIα高表达细胞株MKN45和AGS,并设空载体作为对照组;应用RT-PCR和Western blot测定转染后细胞RegIα基因及其蛋白的表达水平;应用MTT法和流式细胞仪检测RegIα小RNA干扰对细胞增殖抑制率和凋亡的影响。结果:RT-PCR显示:与空载体组相比,转染RegIα小RNA干扰质粒后,MKN45和AGS细胞的RegIαmRNA明显被抑制;Western blot结果显示:MKN45和AGS细胞的RegIα蛋白表达水平分别降低至空载体组的(44±4)%和(25±4)%;MTT结果显示:RegIα小RNA干扰后MKN45和AGS细胞增殖均受到抑制,凋亡率分别为(12.96±0.50)%和(11.59±1.10)%,与空载体组比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:小RNA干扰可有效抑制胃癌细胞株中RegIα基因的表达,具有抑...     

siRNA干扰Pokemon基因影响A549细胞增殖的实验研究

目的 研究siRNA干扰Pokemon基因对肺腺癌A549细胞增殖抑制效应的变化.方法 专业设计合成3条针对Pokemon的siRNA,分别转染A549细胞后,RT-PCR检测转录水平Pokemon mRNA表达的变化,筛选出其中最高效的1条siRNA;用MTT法检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞增殖的抑制作用;流式细胞技术检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞凋亡的影响.结果 3条siRNA均成功转染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞呈圆绿色.RT-PCR结果显示有2条siRNA使细胞中Pokemon的mRNA表达降低(P＜0.05).MTT法结果显示siRNA干扰Pokemon后对A549细胞增殖有抑制作用(P＜0.05),其中48 h抑制效率达(24.14±1.39)％.流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰Pokemon可增加A549细胞的凋亡,凋亡率为14.05％.结论 应用RNA干扰Pokemon基因能够抑制A549细胞的增殖,促进A549细胞的凋亡.Pokemon基因有可能成为肺癌治疗中的一个新靶点.     

Dnmt1基因对胃癌细胞株AGS细胞增殖凋亡的影响

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以Dnmt1(DNA methyltransferase 1)为靶基因,设计构建重组体pshRNA-Dnmt1,研究其对胃癌AGS细胞增殖凋亡的影响.方法:设计shRNA的寡核苷酸片断,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体pshRNA-Dnmt1,转染胃癌细胞株AGS,用Western Blot检测DNMT1蛋白水平变化,用RT-PCR法评估mRNA水平,MTT法动态监测活细胞数,AO/EB法、电镜和TUNEL观察其促凋亡作用.结果:成功构建重组质粒pshRNA-Dnmt1 后,进行序列分析得到确证. RT-PCR检测结果证实: 重组质粒pshRNA-Dnmt1 对胃癌AGS细胞中Dnmt1基因的转录有着明显抑制作用,转染后24 h抑制率在21.63%左右;48 h为52.97%;72 h为72.06%. Western Blot检测结果表明:pshRNA-Dnmt1 转染AGS细胞后24 h出现DNMT1蛋白表达量减少,抑制率为28.24%;48 h为68.54%;72 h为81.47%. MTT结果提示: 转染后24, 48和72 h细胞数存活率为对照组的79.49%, 51.63%和39.16%. AO/EB法、电镜和TUNEL都看见大量典型的凋亡和坏死细胞,转染后48 h的细胞凋亡率由对照组的5%上升为35%左右.结论:重组质粒pshRNA-Dnmt1 能特异有效地抑制胃癌细胞株AGS内Dnmt1基因的表达,能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,从而为肿瘤的基因治疗开辟了新途径.     

RNAi技术沉默Bmi-1基因对人胃癌AGS细胞株的作用

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bmi-1基因表达对人胃癌细胞株AGS增殖和侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL-GFP,构建针对Bmi-1基因shRNA序列的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1,转染AGS细胞,采用Western blot检测重组质粒对Bmi-1蛋白表达的影响,MTT法检测重组质粒对AGS细胞体外生长的抑制作用,PI单染法流式细胞术检测转染重组质粒后细胞凋亡与细胞周期的变化,小室侵袭实验检测AGS细胞侵袭能力变化。结果:成功构建了vshRNA-Bmi-1重组质粒,并成功转染AGS细胞抑制Bmi-1蛋白的表达。转染重组质粒后,AGS细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加,S期比例上升,细胞侵袭能力弱于非特异性转染组。结论:vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1蛋白在AGS胃癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭,促进其凋亡。     

沉默孕激素膜受体I基因抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa增殖的研究

目的 通过siRNA抑制子宫内膜癌细胞株Ishikawa孕激素膜受体1(progesterone receptor membrane component-1，PGRMC1)表达，抑制子宫内膜癌细胞增殖。方法 应用Ambion公司siRNA设计工具设计以PGRMC1为靶标的siRNA并用该公司试剂盒化学合成。MTT法检测转染siRNA后细胞增殖抑制率，RT-PCR检测转染siRNA后PGRMC1基因mRNA水平变化，WB检测蛋白表达变化。流式细胞仪检测转染组与对照组细胞周期变化；Annexin V阳性细胞百分比，对比细胞凋亡率；双氢二氯荧光黄染色阳性率判定细胞内ROS水平。结果 si－PGRMC1可显著抑制该基因mRNA及蛋白表达，使细胞增殖受抑，G2期细胞比例明显增加，凋亡细胞比率明显增加，细胞内ROS水平也随之升高。 结论 PGRMC1参与了调控子宫内膜癌细胞增殖。     

SiRNA干扰DLL4表达对A549细胞周期和凋亡的影响

目的 筛选DLL4基因的特异性小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),探讨DLL4对A549 细胞增殖、周期、凋亡的影响.方法 设计、合成并筛选针对DLL4的siRNA,转染A549细胞后,以RT-PCR和Western blot检测DLL4 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖,激光扫描共聚焦显微镜检测细胞凋亡变化,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 DLL4 siRNA能够明显下调A549细胞中DLL4 mRNA和蛋白的表达.并能抑制细胞的增殖(抑制率为43.85％);促进细胞凋亡(P＜0.05),G2/M期细胞比例明显增加(P＜0.05).结论 DLL4在肺癌细胞中也有表达,下调其表达后,能够抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡.     

沉默孕激素膜受体1基因抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa增殖的研究

目的 通过siRNA抑制子宫内膜癌细胞株Ishikawa孕激素膜受体1(progesterone receptor membrane component-1,PGRMC1)表达,探讨抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用.方法 应用Ambion公司siRNA设计工具设计以PGRMC1为靶标的siRNA并用该公司试剂盒化学合成.MTT法检测转染siRNA后细胞增殖抑制率,RT-PCR检测转染siRNA后PGRMC1基因mRNA水平变化,Western blot检测蛋白表达变化.流式细胞仪检测转染组与对照组细胞周期变化;Annexin V阳性细胞百分比,对比细胞凋亡率;双氢二氯荧光黄染色阳性率判定细胞内ROS水平.结果 si-PGRMC1可显著抑制该基因mRNA及蛋白的表达,使细胞增殖受抑,G2期细胞比例明显增加,凋亡细胞比率明显增加,细胞内ROS水平也随之升高.结论 PGRMC1参与了调控子宫内膜癌细胞增殖.     

COX-2 siRNA诱导人肝癌Hep3B细胞凋亡实验研究

目的:观察COX-2在人肝癌细胞Hep3B中的表达及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默COX-2基因对COX-2 mRNA和蛋白表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:将siRNA-COX-2质粒载体转染Hep3B细胞,WST-8法检测细胞增殖抑制情况,透射电镜观察凋亡小体出现情况;筛选单克隆细胞株Hep3B-sh,采用RT-PCR和Western blotting检测COX-2 mRNA和蛋白情况。结果:siRNA-COX-2能抑制Hep3B细胞的增殖,稳定转染pshRNA-COX-2可使Hep3B细胞中COX-2 mRNA及蛋白的表达明显减弱(P<0.01);透射电镜下可见凋亡小体出现,发生凋亡细胞数增加。结论:COX-2siRNA能有效抑制肝癌Hep3B细胞中COX-2的表达和细胞的增殖,促进凋亡发生,为肝细胞癌基因治疗提供实验依据和治疗靶点。     

MACC1基因对人小细胞肺癌细胞株SBC-5细胞生物学特性的影响

目的:采用RNA干扰(RNAi)技术探讨MACC1基因对人小细胞肺癌细胞株SBC-5细胞生物学特性的影响。方法:将siRNA-MACC1转染SBC-5细胞;利用Western blot法检测转染后MACC1蛋白的表达;利用MTT法测定细胞增殖;利用Hoechst法检测转染细胞的凋亡。结果:SBC-5细胞,转染基因特异性的siRNA后MACC1蛋白表达明显降低,凋亡明显增加,细胞增殖活力明显降低。结论:MACC1基因特异性的siRNA可抑制蛋白表达,促进SBC-5细胞凋亡并抑制细胞增殖。     

下调VEGF—C基因对乳癌细胞增殖和凋亡影响

目的 应用经过化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体外抑制血管内皮生长因子C(VEF-C)基因的表达, 探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术对乳癌基因治疗的可行性和特异性.方法 设计针对VEF-C基因的siRNA,选用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000作为转染试剂,以脂质体转染法将双链siRNA导入人乳癌细胞株MCF-7细胞,设立空白对照组(只加无血清无抗生素培养基)、脂质体组(每孔只加LipofectamineTM 2000 0.5 μL)、3个siRNA浓度梯度组(50、100、200 nmol/L)及siRNA SCR组(100 nmol/L),用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测siRNA对 MCF-7细胞增殖的影响,通过Hoechst 33258 染色观察MCF-7细胞的凋亡,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测转染前后VEF-C基因和p53基因的 mRNA及蛋白表达变化.结果 转染VEF-C siRNA 8 h后MCF-7细胞生长受到抑制,Hoechst 33258荧光染色显示转染siRNA 72 h后细胞内可见凋亡小体.VEF-C基因和p53基因 mRNA和蛋白水平表达明显降低(F=30.7～11.11,q=5.7～20.75,P<0.01),空白对照组、脂质体组和siRNA SCR组各指标差异无显著性(P>0.05).结论 化学修饰的siRNA介导的RNA干扰能下调靶基因VEF-C的表达和抑制MCF-7细胞增殖,乳癌中p53与VEF-C表达有关,提示突变型p53可能参与VEF-C表达的调控.     

凝溶胶蛋白对胃癌细胞凋亡及细胞中活性氧水平的影响研究

目的探讨凝溶胶蛋白（GSN）对胃癌细胞凋亡及细胞中活性氧（ROS）水平的影响。方法免疫印迹法（Western blot）检测胃癌细胞SGC7901、AGS、BGC823 及胃黏膜上皮细胞GES-1 中GSN的表达水平。细胞转染GSN siRNA（GSN siRNA 组）和siRNA 对照（siRNA control 组）,同时以只加入转染试剂的细胞为对照组,培养48 h 后,噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,激光扫描共聚焦显微镜法检测ROS水平,Western blot检测细胞中GSN、Notch1 胞内段受体（NICD1）、Notch2 胞内段受体（NICD2）、DNA 结合蛋白1（HES1）多克隆抗体及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）水平。结果GSN在 胃癌细胞SGC7901、AGS 及BGC823 中的表达水平高于胃黏膜上皮细胞GES-1（p <0.05）,且在AGS 细胞中的表达水平最高,后期选用胃癌细胞AGS 为研究对象。siRNA control 组细胞增殖、凋亡及细胞中ROS 水平、GSN、NICD1、NICD2、HES1 及Cleaved Caspase-3 水平与对照组相比均差异无统计学意义（p >0.05）。GSN siRNA 组细胞增殖能力及细胞中GSN、NICD1、NICD2 及HES1 水平低于对照组（p <0.05）,而细胞凋亡能力及细胞中ROS 水平、Cleaved Caspase-3 水平均高于对照组（p <0.05）。结论干扰GSN 表达后,胃癌细胞增殖能力减弱,凋亡增加,作用机制可能与细胞中ROS 水平及NOTCH信号通路有关。     

Effects of broth culture filtrate protein of VacA+ Helicobacter pylori on the proliferation and apoptosis of gastric epithelial cells

Background Infection with Helicobacterpylori (H.pylori) may lead to chronic inflammation of the stomach epithelium,mucosal atrophy,imbalance of proliferation and apoptosis of epithelial cells; resultin...     

siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用

目的 研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子（VEGF）基因表达的影响。方法 利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段，转录针对VE F mRNA的siRNA．通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC7901细胞，设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照．用MTT法检测细胞抑制率，流式细胞仪检测细胞周期的改变，RT—PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化．ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化。结果 所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长，并使细胞周期阻滞于G0／G1期；VEGF mRNA的表达也受到有效抑制，明显减少；同时，对应的VEGF蛋白水平也显著降低，作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化。结论 体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901细胞VEGF基因的表达。     

Enhanced Chemotherapy Sensitivity of Human Colon Cancer Cells to 5-Fluorouracil by siRNA Recombinant Expression Vector Targeting Survivin Gene

Objective To investigate the effects of small interfering RNA （siRNA） recombinant expression vector targeting survivin gene on chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells to 5-fluorouracil. Methods siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed and transfected into human colon cancer cell lines LOVO. After 48 hours of transfection, cells were harvested for analysis of survivin mRNA and protein expressions using RT-PCR and Western blot. In addition, after human colon cancer cell lines were treated with Survivin siRNA and/or 5-fluorouracil, MTT assay and flow cytometry were used to analyze cell proliferation and apoptosis. Results Restriction endonuclease analysis confirmed that siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was successfully constructed. Inhibitory ratios of survivin mRNA and protein expressions by Survivin siRNA were 36.33% and 44.65%, respectively. Survivin siRNA combined with 5-fluorouracil significantly increased the cell proliferation inhibitory ratio and apoptosis ratio compared with 5-fluorouracil treatin~ alone （P〈0.05）. Conclusion The siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene can inhibit the expression of survivin gene, and enhance chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells to 5- fluorouracil.     

Abl相互作用蛋白1过表达对胃癌细胞系AGS体外增殖的影响

目的 明确Abl相互作用蛋白1(ABI1)在正常胃黏膜细胞系GES-1和胃癌细胞系AGS中的表达模式,并探讨ABI1过表达对AGS细胞体外增殖的影响.方法 首先用免疫组化、免疫荧光、逆转录(RT)-PCR、实时定量PCR及Western印迹法明确ABI1在GES-1及AGS细胞中的表达模式;其次用脂质体转染方法分别将基因重组表达载体鼠干细胞病毒(MSCV)-绿色荧光蛋白(GFP)-ABI1质粒和对照载体MSCV-GFP质粒导入AGS细胞,用嘌呤霉素筛选稳定表达MSCV-GFP-ABI1和MSCV-GFP的细胞系,用实时定量PCR和Western印迹法鉴定是否成功构建了ABI1过表达的细胞模型;最后用细胞活力检测试剂盒[八肽胆囊收缩素(CCK-8)]检测ABI1过表达对细胞增殖的影响.结果 ABI1在正常胃黏膜细胞系GES-1及胃癌细胞系AGS中均有表达;与GES-1细胞相比,ABI1在AGS细胞中的表达从mRNA水平到蛋白质水平均下调;成功构建稳定表达MSCV-GFP-ABI1的AGS-MSCV-GFP-ABI1细胞模型,AGS-MSCV-GFP-ABI1细胞中ABI1的表达无论mRNA水平还是蛋白质水平均明显高于AGS细胞(均P=0.002);CCK-8法检测显示,AGS-MSCV-GFP-ABI1细胞在24、48、72、96 h 4个时间点增殖率分别为1.46±0.31、4.75±0.12、6.62±0.32、8.96±0.27,均明显低于AGS细胞及AGS-MSCV-GFP细胞(均P<0.01).结论 ABI1在胃癌细胞中表达下调,其过表达可以抑制人胃癌细胞系AGS的增殖,提示ABI1表达下调可能参与了胃癌的发生发展过程,而影响胃癌细胞的增殖可能是其发挥作用的重要途径之一.     

Smo siRNA对LoVO细胞Smo基因表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的 研究Smoothened (Smo)小干扰RNA(siRNA)对结直肠癌LoVo细胞Smo基因表达,以及LoVo细胞增殖与凋亡的影响.方法 设计针对目标基因的siRNA.阳性脂质体介导转染LoVo细胞,半定量RT-PCR检测转染后LoVo细胞的Smo mRNA水平,MTT法和流式细胞术检测转染后LoVo细胞的增殖水平及细胞凋亡率.结果 siRNA-1、siRNA-2均能抑制LoVo细胞Smo基因的表达,siRNA-1抑制作用最明显,达63.56%,siRNA-2抑制作用为46.54%,两组与隐性对照组相比.差异均具有显著性.siRNA-1转染LoVo细胞后,细胞增殖水平较隐性对照组显著降低(P＜0.05);转染48 h后,细胞凋亡率较隐性对照组显著升高(P＜0.05).结论 Smo siRNA能有效地抑制结直肠癌LoVo细胞Smo基因表达,可以降低LoVo细胞的增殖水平,诱导细胞的凋亡.     

IEX-1蛋白在胃癌中的表达及其意义

目的揭示即刻早期反应X-1（IEX-1）蛋白在胃癌组织及细胞系中的表达,探讨其对人胃癌细胞凋亡和增殖的影响。方法采用免疫组织化学法检测100 例胃镜活检标本中IEX-1 蛋白的表达,用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot 检测人正常胃黏膜细胞GES-1 和胃癌细胞MKN28 中-1 基因和蛋白的表达,同时转染IEX-1 的过表达质粒pcDNA3-FLAG-IEX-1 和干扰质粒pLL3.7-si-IEX-1,分别采用流式细胞术及四甲基偶氮唑盐比色法检测IEX-1 对细胞周期、凋亡及增殖的影响。结果胃癌组织中IEX-1 蛋白表达水平高于正常胃组织和慢性胃炎组织（p <0.05）,且随着病情进展,IEX-1 表达水平有逐渐升高的趋势。相对于人正常胃黏膜细胞GES-1,胃癌细胞MKN28 中-1 基因和蛋白表达更高（p <0.05）。与对照组相比,IEX-1 蛋白表达增高后S 期细胞比例升高,G2期细胞比例降低,细胞增殖率升高,凋亡减少（p <0.05）,而干扰IEX-1 蛋白表达后,G1期细胞升高,G2期细胞比例下降,细胞增殖率下降,细胞凋亡增加（p <0.05）。结论IEX-1 蛋白在胃癌组织中呈高表达,在人胃癌细胞中上调IEX-1 蛋白能促进细胞增殖,发挥抗凋亡能力,干扰IEX-1 蛋白表达能阻滞细胞周期进程,并诱导凋亡。     

靶向survivin的siRNA诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 采用RNA干扰技术（siRNA）阻断survivin基因的表达，观察其抑制胰腺癌细胞增殖及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。方法 构建靶向survivin的siRNA质粒表达载体，采用Lipofectamine^TM2000转染胰腺癌细胞PC-2，采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞survivin基因表达的变化；采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制作用：采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡的作用。结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以高效地抑制PC-2细胞survivin基因表达，在mRNA水平其表达抑制率为81．25％，在蛋白质水平其表达抑制率为74．24％。转染靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以显著抑制PC-2细胞的增殖，细胞接种24、48h后其增殖抑制率分别为28．00％和33.38％：转染后24、48h可以诱导8．46％、7．53％的细胞凋亡。结论 所构建的靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以有效地阻断PC-2细胞survivin基因表达。阻断survivin基因表达可以显著地抑制PC-2细胞的增殖并在一定程度上诱导其凋亡，靶向survivin的siRNA在胰腺癌的基因治疗中具有一定的价值。