食品和水源微小隐孢子虫18S rRNA鉴定方法研究

目的了解生蔬食品及相关水源微小隐孢子虫污染情况,并研究其卵囊分离及18S rRNA鉴定的方法. 方法采用分步离心富集法从78份生蔬食品和相关水源中分离出微小隐孢子虫卵囊并提取DNA模板,利用微小隐孢子虫18S rRNA 的基因序列设计特异性引物（446bp）进行多聚酶链反应扩增,扩增产物经回收克隆后进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列同源性分析. 结果从78 份样品中检出4份特异性条带样品.限性样品的重组克隆经PCR鉴定可重现446bp的特异性条带,其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同.重组菌液的测序结果与Geabank数据库中微小隐孢子虫18S rRNA基因序列的同源性为99%. 结论建立了一种监测生蔬食品及相关水源中微小隐孢子虫污染的基因检测方法.     

隐孢子虫PCR检测体系的建立及其应用

目的建立快速检测隐孢子虫卵囊的PCR检测体系,以期在人群和食品及其饮用水腹泻原虫监测中推广应用。方法以隐孢子虫小亚基SSU r RNA和卵囊壁蛋白(COWP)为靶基因,设计巢式PCR和荧光PCR的引物和探针;以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,分别进行两种检测方法的敏感性和特异性试验;再用某水牛养殖场采集的58份牛粪样考核检测体系的应用价值。结果设计的巢式PCR引物和荧光PCR引物探针特异性都很高,巢式PCR对隐孢子虫DNA的检测最低OD阈值为2 pg隐孢子虫DNA;实时荧光PCR显示最低检测阈值为200 fg隐孢子虫DNA,灵敏性都比较高,实时荧光PCR的灵敏性比巢式PCR高1个数量级(10倍);58份检测样本中,有一份为阳性样本,PCR产物经序列分析显示为微小隐孢子虫。结论巢式PCR和实时荧光PCR检测隐孢子虫的特异性和灵敏性均高,操作简便,能为隐孢子虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段和方法依据。奶牛感染人兽共患微小隐孢子虫基因亚型,具有人兽共患传播的可能性。     

应用巢式PCR方法诊断微小隐孢子虫感染的实验研究

目的应用巢式PCR扩增方法诊断微小隐孢子虫感染。方法用昆明种小鼠通过免疫抑制方法建立动物模型，通过不连续蔗糖密度梯度离心法分离、纯化隐孢子虫卵囊。抽提DNA后，用巢式PCR扩增隐孢子虫的18S核糖体DNA，电泳、割胶回收后测序。结果成功建立隐孢子虫的小鼠免疫抑制动物模型，纯化后的隐孢子虫卵囊形状均一，呈圆形或椭圆形，大小在3-6um左右。经巢式PCR扩增，在840bp左右有一条特异性条带。通过测序和生物信息学分析，证实该基因序列与微小隐孢子虫18S具有高度同源性。结论巢式PCR方法扩增18S基因是诊断微小隐孢子虫感染的敏感方法。     

安氏隐孢子虫卵囊分离纯化方法研究

目的 建立获取纯净的安氏隐孢子虫卵囊外培养模型。方法研究改进分离纯化安氏隐孢子虫卵囊的方法,采用蒸馏水稀释Sheather’s蔗糖溶液配制不同密度的蔗糖溶液,比较不同稀释比的Sheather’s蔗糖溶液漂浮卵囊的效果,并首次比较了蒸馏水和PBS稀释的Sheather’s蔗糖溶液分离纯化卵囊的活性,将两种方法分离纯化的卵囊37℃水浴1h进行脱囊率比较。结果2：1蔗糖溶液（2体积Sheather’s蔗糖溶液与1体积的蒸馏水）分离奶牛粪样中卵囊效果最好。漂浮三次即可获得大量卵囊,回收率为83．70％,三次漂浮的卵囊总数较Sheather’s蔗糖溶液高57．53％。蔗糖溶液多梯度密度纯化法纯化后的卵囊杂质较少,回收率为47．52％。蒸馏水稀释的蔗糖溶液分离纯化卵囊脱囊率为87．87％,PBS稀释的蔗糖溶液分离纯化卵囊的脱囊率为84．71％,差异无统计学意义P〉0.05）。结论2：1蔗糖溶液适用于分离安氏隐孢子虫卵囊,且用蒸馏水代替PBS稀释Sheather’s蔗糖溶分离纯化隐孢子虫卵囊其活性不受影响。可用于体外培养研究。     

青岛地区哺乳动物隐孢子虫感染调查

目的 了解青岛地区哺乳动物隐孢子虫感染状况及最佳检测方法.方法 收集青岛地区某些县(市)的猪、狗、猫及青岛大学医学院寄生虫学教研室实验用小鼠、大鼠、兔粪便388份,分别应用改良抗酸染色、金胺-酚染色、金胺-酚串联改良抗酸染色法检测隐孢子虫,并在生理盐水、饱和盐水及碘液中对隐孢子虫卵囊进行形态学观察.用腹泻儿童粪便中分离隐孢子虫卵囊感染2只幼犬,对其进行病原学和病理学观察.结果 哺乳动物隐孢子虫检出率为15.98%(62/388),其中家养动物猪、狗和猫隐孢子虫检出率分别为4.71%(8/170)、22.22%(10/45)和0(0/15),实验动物小鼠、大鼠和兔隐孢子虫检出率分别为31.03%(9/29)、40.00%(24/60)和15.94%(11/69).实验动物隐孢子虫检出率(27.85%)明显高于家养动物(7.86%)(χ2=27.965,P<0.01).人隐孢子虫卵囊感染幼犬后产生明显腹泻症状,粪便中查到隐孢子虫卵囊,大小形态与人株相似,肠壁病变明显.结论 在青岛地区哺乳动物中查出隐孢子虫感染,金胺-酚串联改良抗酸染色法效果最好.对甲醛液保存时间较长的粪便标本,金胺-酚染色法染色后,用体积分数0.03盐酸-乙醇脱色5 min,再用改良抗酸法染色,可提高卵囊检出率.隐孢子虫人株对狗无宿主特异性,并且具有明显致病性.     

抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素原核表达载体的构建及其对虫体的杀灭作用

目的构建抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素原核表达载体并测定表达产物对隐孢子虫的杀灭作用。方法利用基因工程原理,以含抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素的菌株为模板,利用设计合成的一对引物扩增出ScFv-PE,利用pMAL-p2X载体构建重组毒素pMAL-ScFv-PE,并将其导入大肠杆菌中进行表达,产物进行SDS-PAGE和Western-blot,纯化后治疗感染隐孢子虫的小鼠。结果重组质粒经酶切鉴定正确,IPTG诱导后可看到明显的条带。凝胶薄层扫描分析目的蛋白表达量占菌体蛋白总量的21%。纯化后的表达产物治疗感染隐孢子虫的小鼠治疗组比对照组肠滞留物中卵囊计数（P〈0.05）与肠道平均累计感染积分明显减少（P〈0.01）。结论利用原核表达载体成功构建了可溶性形式表达的pMAL-ScFv-PE重组质粒,重组毒素对隐孢子虫具有明显的杀灭作用。     

HIV感染者合并隐孢子虫的基因分型调查

目的了解河池市HIV感染者的隐孢子虫感染情况。方法收集258例HIV感染者的粪便样本,采用基于18S rRNA基因的巢式PCR方法进行检测。对巢氏PCR产物进行测序,同源性比对,明确基因型。结果河池市HIV感染者合并隐孢子虫的感染率为2.33%(6/258),伴有慢性腹泻的HIV感染者合并隐孢子虫的感染率为6.98%(6/86),虫株基因鉴定为安氏隐孢子虫和人隐孢子虫。结论河池市HIV感染者存在隐孢子虫合并感染,需明确其流行特点,有待进一步调查。     

两种肠道腺病毒基因型分型方法的比较

目的研究简便快速肠道腺病毒基因型分型方法。方法采集137例非腹泻人群的粪便样本,在A549细胞中培养,提取病变细胞的基因组DNA进行PCR扩增或直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,对PCR阳性者进行克隆、测序以及基因型分型。结果137份样本中,两种方法均有17份样本检出腺病毒,阳性率为12．4％（17／137）。序列分析显示,两种方法检出的腺病毒型别一致。这17份样本分别属于人腺病毒5型（5份）、7型（3份）、12型（3份）及48型（6份）。结论两种方法的敏感性、特异性一样,但方法二是直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,无需方法一需进行3次体外细胞感染实验后从病变细胞中提取基因组DNA进行PCR扩增,节省实验的时间及成本,特别是避免体外细胞感染过程中可能出现的污染,值得推荐。     

儿童腹泻患者隐孢子虫感染的研究

收集门诊腹泻患者粪便标本１０２份。用快速改良抗酸二步法检查粪便中隐孢子虫卵囊，其阳性率为４．９０％；男女性别阳性率差异无显著性（Ｐ＞０．０５）；１月、５岁和１０岁年龄组阳性率分别为４．０５％，７．１４％和７．１４％。提示在不同性别和年龄组腹泻患儿中均有不同程度的隐孢子虫感染     

儿童腹泻患者隐孢子虫感染的研究

收集门诊腹泻患者粪便标本１０２份。用快速改良抗酸二步法检查粪便中隐孢子虫卵囊，其阳性率为４．９０％；男女性别阳性率差异无显著性（Ｐ〉０．０５）；１月、５岁和１０岁年龄组阳性率分别为４．０５％，７．１４％和７．１４％。提示在不同性别和年龄组腹泻患儿中均有不同程度的隐孢子虫感染。     

不同测序方法在病原微生物鉴定中应用的研究进展

快速准确的微生物鉴定有利于指导临床治疗用药和控制传染病流行。传统病原微生物鉴定耗时且应用范围有限,越来越多测序方法被用于病原微生物研究。现从16S rRNA测序在细菌鉴定分析中的应用、18S rRNA和转录间隔区序列（internally transcribed spacer sequences, ITSs）在真菌或寄生虫等真核微生物鉴定分析中的应用、全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）在可分离培养的单个微生物鉴定中的应用、宏基因组测序（metagenomic sequencing,MGS）在未知感染的微生物检测中的应用进行综述,以期为病原微生物的鉴定方法提供参考。     

成都市某三甲医院腹泻儿童轮状病毒和隐孢子虫感染调查

目的了解成都市腹泻儿童轮状病毒和隐孢子虫的感染情况。方法收集成都市某三甲妇幼医院腹泻儿童粪便样本297份,采用快速诊断试剂盒(胶体金法)进行轮状病毒抗原检测,同时分别用改良抗酸染色法检查隐孢子虫卵囊,用ELISA检测试剂盒检测隐孢子虫卵囊抗原。结果共检出轮状病毒阳性31例,男童与女童阳性率分别为12. 43%和7. 50%,差异无统计学意义(P>0. 05);两种隐孢子虫检测方法均未发现阳性病例。结论轮状病毒是成都市儿童腹泻的主要原因之一,感染以6个月至2岁患儿为主;成都市儿童腹泻患者的隐孢子虫感染率低于预期,此结果需要更大样本量的调查进行确认。     

广州市哨点医院腹泻儿童隐孢子虫感染的分子流行病学研究

目的了解广州某哨点医院门诊腹泻儿童隐孢子虫感染现状和分子流行病学特征。方法收集2012年6月至2013年5月广州市某哨点医院门诊腹泻儿童的人口资料学和粪便标本,采用巢氏聚合酶链反应(Nested PCR)方法检测粪便标本中的隐孢子虫卵囊。结果348份粪便标本中隐孢子虫的检出率为3.45%(12/348),发病年龄以3岁以内为主(n=10),检出率在患者的性别、年龄、月份间差异均无统计学意义,时间分布有2个高峰,分别为3-4月和11-12月。检出的12株隐孢子虫经测序分型,8株为C.hominis,4株为C.parvum,其中Ia亚型6株,Ib亚型2株,IIa亚型3株,IId亚型1株。结论广州某哨点医院腹泻儿童存在隐孢子虫感染,高发于春季和冬季,以3岁以内婴幼儿为主,主要流行C.hominis。     

白假丝酵母菌最优化RNA提取策略的探索

目的 探索白假丝酵母菌总RNA简单、快捷、高效的提取方法。方法 选取昆明医科大学第一附属医院妇产科门诊2011年7月-2013年3月有临床症状且阴道分泌物镜检阳性的外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）患者的白假丝酵母菌40株,选用不同时间与温度组合下的4种溶壁酶（Lyticase）破壁方案（A方案：37 ℃、12 h,B方案：25 ℃、12 h,C方案：37 ℃、24 h,D方案：25 ℃、24 h）进行RNA提取,将所得RNA进行荧光定量PCR（qPCR）反应验证RNA的浓度及纯度,并进行管家基因18S rRNA的检测。结果 D方案提取获得的RNA浓度高于A、B、C方案（P＜0.05）|B方案提取获得的RNA浓度高于A、C方案（P＜0.05）|而A、C两方案提取获得的RNA浓度比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。B、D方案获得的RNA纯度高于A、C方案（P＜0.05）|但A、C方案获得的RNA纯度比较,差异无统计学意义（P＞0.05）|B方案提取获得的RNA纯度高于D方案（P＜0.05）。A、B、C、D方案提取的RNA扩增产物Ct转化值比较,差异有统计学意义（P＜0.05）|其中B、D方案qPCR扩增产物Ct转化值高于A、C方案（P＜0.05）|但B、D方案及A、C方案之间的qPCR扩增产物Ct转化值比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。管家基因18S rRNA的引物扩增出的产物片段大小为150 bp。结论 以Lyticase破壁提取白假丝酵母菌具有简单易行及RNA产量高、纯度好的优点,值得临床推广应用。     

改良盐析法提取全血基因组DNA的影响因素研究

目的 观察红细胞裂解时间、DNA纯化方式以及DNA干燥时间对改良盐析法提取全血基因组DNA的影响.方法 改良盐析法提取全血基因组DNA时,分别采用不同的红细胞裂解时间、DNA纯化方式以及DNA干燥时间.使用流式细胞术检测红细胞裂解后的细胞总数及死细胞比例,紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物.结果 红细胞裂解时间从10 min延长至120 min,死细胞比例随时间延长而增加,但细胞总数、DNA产量与纯度无明显变化;采用异丙醇沉淀法纯化DNA得到的DNA产量与纯度均显著高于使用DNA分离柱纯化的DNA; DNA干燥时间从120 min缩短至30 min,既不影响DNA的产量与纯度,也不影响后续PCR扩增实验.结论 改良盐析法提取全血基因组DNA时,红细胞裂解时间可延长至120 min,DNA干燥时间可缩短至30 min,异丙醇沉淀法优于DNA分离柱纯化的DNA.     

云南大理在校大学生3种肠道原虫分子流行病学调查

目的 了解云南大理在校大学生蓝氏贾第鞭毛虫、人芽囊原虫、毕氏微孢子虫的感染情况,为青少年肠道寄生原虫病的防治工作提供参考依据。方法 采集426份云南大理在校大学生粪便样本,提取DNA,根据设计的引物序列进行PCR扩增,通过测序和序列比对,确定其基因型并构建遗传进化树。应用软件SPSS 19.0进行统计学分析。结果 426份在校大学生粪便样本中PCR扩增出25份阳性样本,3种原虫感染率分别为：蓝氏贾第鞭毛虫4.23%（18/426）、人芽囊原虫1.41%（6/426）、毕氏微孢子虫0.23%（1/426）;蓝氏贾第鞭毛虫感染率在不同性别、民族之间差异均无统计学意义（P>0.05）,来自农村的学生感染率5.57%显著高于城镇学生0.83%（P<0.05）;人芽囊原虫感染率在不同性别之间差异无统计学意义（P>0.05）,少数民族感染率1.99%略高于汉族感染率0.57%,但不同民族、生源地之间差异均无统计学意义（P>0.05）。经鉴定蓝氏贾第鞭毛虫、人芽囊原虫、毕氏微孢子虫的基因型分别为AⅠ亚型、ST1型、EbpC型,且均为人兽共患基因型。结论 大理在校大学生存在蓝氏贾第鞭毛虫、人芽囊原虫、毕氏微孢子虫感染,具备潜在的传播风险。学校应加强对青少年学生的卫生宣传教育,培养学生养成良好卫生习惯,提高学生自我保健能力。     

赤水丹霞来源抗白色念珠菌放线菌分离及进化分析

目的 分离、筛选抗白色念珠菌放线菌菌株,为开发微生物来源的抗白色念珠菌感染药物提供菌株资源.方法 采集赤水丹霞山区土壤样品,利用不同的放线菌选择培养基分离、纯化单菌落.提取分离菌株基因组DNA,以细菌16S rRNA通用引物PCR扩增16S rRNA基因,产物测序并比对分析以确定分离菌株的分类地位.小量发酵产物进行抗白色念珠菌活性测试.结果 筛选得到7株具有抗白色念珠菌活性的放线菌,其中6株为链霉菌,1株为地中海拟无枝酸菌.结论 从赤水丹霞山区分离得到多株具有抗白色念珠菌活性的放线菌,可为开发微生物来源的抗白色链珠菌药物提供菌株来源.     

经典酚/氯仿抽提法和纯化试剂盒法提取全血基因组DNA的比较

目的 比较经典酚/氯仿法和纯化试剂盒法抽提全血基因组DNA的差异.方法 分别对两种方法抽提的全血DNA产物进行紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳和体外聚合酶链锁反应（PCR）扩增.结果 两种方法DNA的提取效率相似,TaKaBa试剂盒法提取的纯度[光密度（OD）260nm/280nm]较常规酚/氯仿法明显提高.结论 TaKaBa试剂盒法较传统酚/氯仿提取基因组DNA法快速、简便、经济,可用于PCR模板DNA的制备.     

实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价 

目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法,为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细
菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区,依据双歧杆菌的16SrRNA序列共设计3条引物,以常规PCR扩增出的16SrRNA部分基因片段制作标准品,应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品及待测样本进行分析,建立绝对定量的标准曲线,同时计算出待测样本双歧杆菌浓度;根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度;分析PCR产物熔解曲线评价反应特异性;重复检测梯度稀释的标准品,用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp,测序结果正确,成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品;生成的标准曲线R2=0.999,最低检测限度为每个反应1.48×102个拷贝;实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量PCR检测,各组间每微升1.48×103~1.48×107个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94%、3.39%、3.54%、3.08%和3.34%。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数?g-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量PCR法敏感性高、特异性强,且重复性好,适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。     

囊胚细胞WGA结合短片段Gap-PCR的α-地贫SEA突变快速植入前遗传学诊断

目的建立一种基于囊胚细胞全基因组扩增（WGA）结合目的序列短片段Gap-PCR基因分型技术的α-地中海贫血东南亚 型（SEA）缺失突变快速植入前遗传学诊断新方法。方法以多重置换扩增（MDA）WGA技术为基础,建立以管家基因GAPDH 和β-actin为目的序列的WGA产物双重荧光PCR质检体系,以及突变和正常序列短片段Gap-PCR的α-地中海贫血SEA缺失基 因分型体系,通过对不同细胞数SEA携带者淋巴细胞样本的检测进行灵敏度与准确性评价,对12例囊胚活检样本的检测进行 应用评价。结果应用本研究建立的方法,不同淋巴细胞数样本的结果显示3细胞时即未出现等位基因脱扣,4细胞时目标模板 的WGA产物量趋于稳定;10例WGA成功的囊胚活检样本的基因分型结果分别为--SEA/αα（5例）和αα/αα（5例）,与验证基因型相 符。结论本研究建立的方法为一个完整检测流程,即以4~6个囊胚活检细胞为检材,对MDA产物进行WGA质检及相对浓度 评估后,以短片段Gap-PCR体系而实现α-地贫SEA缺失的PGD快速基因分型;此方法简单快速、结果准确、检测成本低而适合 临床常规应用。