自身失活型慢病毒载体介导的鼠基因工程调节性T细胞的制备和特性研究

目的 制备自身失活型慢病毒载体为基础的鼠基因工程调节性T细胞(Treg细胞),检测其表型变化,并观察其增殖能力及免疫抑制能力.方法 构建含鼠Foxp3基因及内部核糖体进入位点序列(IRES)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的双顺反子自身失活型慢病毒载体.采用脂质体转染法将慢病毒载体三质粒转染293T细胞,经共培养法感染免疫磁珠分离的小鼠CD4+CD25-T细胞,流式细胞术(FCM)检测基因转染效率及细胞Foxp3、CD25、GITR、CTLA-4的表达,CCK-8法、ELISA法检测其增殖、免疫抑制能力及细胞因子分泌的变化.结果 成功构建了慢病毒表达质粒pXZ208-IRES-GFP、pXZ208-Foxp3-IRES-GFP,包装的重组慢病毒滴度达106IU/ml.以pXZ208-IRES-GFP为阴性对照组,共培养法感染CD4+CD25-T细胞,实验组细胞Foxp3、CD25、CTLA-4、GITR表达升高.在抗CD3ε单抗、抗原呈递细胞存在条件下,实验组细胞增殖能力及IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的分泌均低于阴性对照组(P<0.01);且该细胞可显著抑制CD+CD25-T细胞的增殖.结论 成功构建了自身失活型慢病毒载体介导的鼠基因工程Treg细胞;基因工程Treg细胞具有与CD4+CD25+Treg细胞相似的表型及低增殖性和免疫抑制性.     

葛根素抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞表达诱导型一氧化氮合酶

目的观察葛根素对脂多糖（LPS）诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的影响。方法用脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,与不同浓度的葛根素进行培养,采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）和免疫蛋白印迹法测定（Western blotting）方法分别检测RAW264.7巨噬细胞iNOS mRNA和蛋白质表达。结果随着葛根素的浓度的增加,RAW264.7细胞iNOS的mRNA及其蛋白质表达逐渐减少(P<0.01)。结论葛根素可以通过调节RAW264.7细胞表达iNOS发挥抗炎的作用。     

转染HSP70基因对过氧化氢所致RAW264.7细胞损伤的影响

[目的]观察HSP70基因过表达是否能减轻过氧化氢所致的RAW264.7巨噬细胞损伤.[方法]用脂质体包裹重组质粒pcDNA3.1-HSP70导入RAW264.7细胞株,经G418筛选阳性克隆,用Western blot方法检测HSP70的表达情况;通过测定细胞存活率、LDH释放率,观察了HSP70基因过表达对过氧化氢所致RAW264.7细胞损伤的影响.[结果]获得了HSP70过表达的RAW264.7细胞系;HSP70过表达组细胞的存活率及LDH释放率与对照组比有明显差异.[结论]转染HSP70基因对过氧化氢所致RAW264.7细胞损伤有明显的保护作用.     

pIRES2-EGFP/cbfa1真核双表达载体的构建及鉴定

目的 构建成骨细胞特异性转录因子Cbfa1双表达载体，以期用于成骨的体内、外研究。 方法 以含有全长cDNA的pCMV/Cbfa1为模板，PCR扩增Cbfa1，T-A克隆，酶切亚克隆到pIRES2-EGFP载体上，酶切、PCR及测序鉴定正确后命名为pIRES2-EGFP，脂质体转染NIH3T3细胞，G418筛选稳定表达后，提取细胞的总蛋白，Westerbblot检测Cbfa1蛋白的表达，以未转染组为对照。结果 酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP/Cbfa1载体序列正确，脂质体法转染NIH3T3细胞后可见绿色荧光蛋白的表达，Western-blotting检测到cbfa1在蛋白水平的表达。结论 pIRES2-EGFP/Cbfa1载体构建成功，为后续研究奠定基础。     

构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3及其在脐血CD34+细胞中的表达

目的构建真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3配体,为研究Flt3配体对急性放射复合伤造血功能恢复作用提供实验物质基础.方法实验于2003-05/09在第三军医大学劳动卫生教研室完成.先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUMVC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列(0.8kb),两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点.然后用NheⅠ和XhoⅠ酶切鉴定;最后用脂质体转染的方法将重组质粒转入脐血CD34+细胞中,经过G418筛选,在荧光显微镜下观察其表达.结果①构建了双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-FLT3.②重组质粒pIRES2-EGFP-FLT3能在脐血CD34+细胞中的表达,凝胶电泳和测序结果证明将FLT3 cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内,荧光显微镜下可见脐血CD34+细胞胞体发出绿色荧光.③转染效率为10.3%.结论①携带标记基因的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3能稳定地转入真核细胞表达载体.②该质粒转染到分离纯化的脐血CD34+细胞中,并获得阳性转染细胞的克隆.     

凝血因子ⅩⅢA基因Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变致凝血因子ⅩⅢ缺陷的分子机制

本研究以凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)基因突变为研究的切入点,从分子水平研究这些突变致病的机制.构建野生型FⅩⅢA重组表达质粒,用定点突变方法获得含有2种突变(Arg77Cys及Arg174stop)的FⅩⅢA重组表达质粒.分别将上述重组质粒通过脂质体介导的基因转移方法转染到COS-7细胞表达;用发色底物法检测转染细胞中FⅩⅢ...     

构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3及其在脐血CD34^＋细胞中的表达

目的：构建真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3配体,为研究Flt3配体对急性放射复合伤造血功能恢复作用提供实验物质基础.方法：实验于2003-05/09在第三军医大学劳动卫生教研室完成.先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUMVC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列（0.8kb）,两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点.然后用NheⅠ和XhoⅠ酶切鉴定;最后用脂质体转染的方法将重组质粒转入脐血CD34^＋细胞中,经过G418筛选,在荧光显微镜下观察其表达.结果：①构建了双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-FLT3.②重组质粒pIRES2-EGFP-FLT3能在脐血CD34^＋细胞中的表达,凝胶电泳和测序结果证明将FLT3 cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内,荧光显微镜下可见脐血CD34^＋细胞胞体发出绿色荧光.③转染效率为10.3%.结论：①携带标记基因的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3能稳定地转入真核细胞表达载体.②该质粒转染到分离纯化的脐血CD34^＋细胞中,并获得阳性转染细胞的克隆.     

卵巢癌患者CD4+T细胞中调节性T细胞相关分子标志物的表达特点及临床意义

目的:探讨卵巢癌患者外周血和肿瘤组织CD4+调节T细胞中性T细胞相关分子标志物(Foxp3、CD25、CD127、CTLA-4及GITR)的表达特点及其临床意义。方法 :流式细胞术检测31例卵巢癌患者,26例卵巢良性肿瘤患者和20例健康对照者的外周血,以及14例卵巢癌组织和12例卵巢良性肿瘤组织CD4+T细胞中Foxp3、CD25、CD127、CTLA-4及GITR的表达水平。结果:卵巢癌组织CD4+T细胞中的Foxp3、CD25、CTLA-4及GITR的表达水平显著高于卵巢良性肿瘤组织(P<0.05);CD127在卵巢癌组织CD4+T细胞中所占的比例显著低于卵巢良性肿瘤组织(P<0.01);卵巢癌患者外周血CD4+T细胞中Foxp3、CD25、CTLA-4及GITR的表达水平均显著高于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.01),CD127的表达水平显著低于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.01);Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌患者外周血CD4+T细胞中Foxp3的表达水平显著高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05);Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌患者外周血CD4+T细胞中CD127的表达水平显著低于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。结论:卵巢癌患者外周血及肿瘤组织中CD4+Treg细胞的表达水平显著高于卵巢良性肿瘤组和健康对照组,Foxp3和CD127的表达水平与肿瘤分期有关,提示这两种标志物可作为判断卵巢癌疾病进展的重要指标。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景:核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。目的:克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。方法:采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经BamHI、XhoⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。结果与结论:经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经BamHI、XhoⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

脓毒症患儿CD4+CD25+调节性T细胞的变化

目的 观察不同免疫状态下脓毒症婴幼儿外周血CD4+CD25+Foxp3high调节性T细胞(Treg细胞)及相关分子的变化,探讨婴幼儿脓毒症免疫功能紊乱的可能机制.方法 分别收集2007年5月至2007年11月深圳市儿童医院重症监护室收治的婴幼儿脓毒症36例血液标本,另选16例健康同龄儿童作为正常对照进行前瞻性研究;排除既往患有自身免疫性疾病、免疫缺陷病、遗传代谢病及肿瘤的患儿,排除近6个月曾使用影响免疫功能的药物.本研究获得深圳市儿童医院伦理委员会的同意.以外周血CD14+单核细胞HLA-DR表达>30%或<30%为阈值,将患儿分为免疫激活组(DR-H组)和免疫抑制组(DR-L组),用流式细胞术检测CD14+单核细胞HLA-DR表达率,CD4+CD25+Foxp3highTreg细胞比例;实时荧光定量PCR(Real time-PCR)检测CD4+T细胞Foxp3、CTLA-4、GITR、IL-10mRNA表达.统计方法采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义.结果 急性期DR-L组CD4+CD25+Foxp3highTreg细胞比例明显高于对照组及DR-H组(P<0.05).DR-L组Foxp3、CTLA-4、IL-10等相关分子基因表达高于对照组及DR-H组(P<0.05),DR-L组GITR基因表达高于DR-H组.结论 CD4+CD25+Foxp3highTreg细胞数量异常增加可能与婴幼儿脓毒症免疫抑制状态有关.     

大黄牡丹汤含药血清对脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞RAW 264.7中TRIF和TRAM表达的影响

目的:研究大黄牡丹汤含药血清对细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的小鼠巨噬细胞株RAW264.7中Toll白介素受体相关调节因子(Toll-interleukin 1 receptor-domain-containing adapter-inducing interferon-b,TRIF)及TRIF相关的接头分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM)表达的影响。方法:20只SD大鼠随机分为4组:对照组以及中药高、中、低浓度组,每组5只。各组大鼠分别相应地以0.9%氯化钠液或高、中、低浓度大黄牡丹汤(13.2、6.6、3.3 g/kg)连续灌胃7 d,末次灌胃给药2 h后行心脏采血并处死,分离血清(即含药血清)。体外培养RAW264.7细胞,随机分为对照组、模型组(LPS处理组)以及中药高、中、低浓度组。除对照组外,其他组均用5μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞24 h,3个中药组同时给予相应浓度大黄牡丹汤含药血清进行干预,分别采用RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中TRIF和TRAM的mRNA和蛋白的表达水平。结果:模型组细胞TRIF和TRAM的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组(P0.01),中药中、高浓度组细胞TRIF和TRAM的mRNA表达水平均显著低于中药低浓度组及模型组(P0.01),中药中、高浓度组TRIF和TRAM的蛋白表达水平也明显低于低浓度组(P0.05)及模型组(P0.01)。结论:大黄牡丹汤含药血清可抑制LPS刺激后RAW264.7细胞中TRIF和TRAM的表达。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞检测及其临床意义

目的：探讨检测原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者外周血 CD4＋ CD25＋ Foxp3＋调节性 T 淋巴细胞的水平与意义。方法采用流式细胞术检测32例 PBC 患者和23例健康体检者外周血 CD4＋ CD25＋ Foxp3＋调节性 T 淋巴细胞亚群比例;采用实时荧光定量聚酶链反应（PCR）技术检测人叉头型基因 p3（Foxp3）mRNA 表达的水平。结果PBC 患者外周血 CD4＋ CD25＋ Foxp3＋调节性 T 淋巴细胞明显低于对照组（P ＜0．05）;Foxp3的 mRNA 水平差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论PBC 患者外周血 CD4＋ CD25＋ Foxp3＋调节性 T 淋巴细胞减少,免疫抑制功能减弱,提示 CD4＋ CD25＋ Foxp3＋调节性 T 淋巴细胞在 PBC 的免疫发病机制中可能起重要作用,对评估 PBC 患者细胞免疫状态和预后有重要价值。     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.