大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建大容量天然人源Fab抗体库,筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:采集15位健康成人的骨髓淋巴细胞,构建天然人源Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了2×109大容量天然人源Fab抗体库,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过6轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取80个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(C12、C19、D1、D2),其中C12经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了大容量天然人源Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体C12,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。     

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选?鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定.方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞.用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库.以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstO I酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定.结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26.DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性.结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子.     

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的筛选和阳性克隆的测序

目的：探索制备抗日本血吸虫循环抗原的单链抗体的新方法。方法：用日本血吸虫成虫代谢抗原对已构建的抗日本血吸虫噬菌体抗体库进行富集，然后用ELISA法从富集的抗体库中筛选阳性克隆，然后借助ELISA、SDS-PAGE和Western blot等方法对阳性克隆表达产物进行了特异性鉴定，最后对阳性克隆插入片段进行了测序和序列分析。结果：从随机挑取的72个克隆中筛选到阳性克隆6个，经交叉筛选和鉴定最终获得特异性抗日本血吸虫阳性克隆2个。测序和序列分析结果也证实：阳性克隆插入片段推导的氨基酸序列具有典型的抗体可变区特征。结论：用固相富集和ELISA筛选法可以从抗体库中有效地筛选到抗日本血吸虫循环抗原的阳性克隆。     

人源性抗核抗体Fab片段的筛选及鉴定

目的:制备人源性抗核抗体Fab片段.方法:通过4轮淘筛,富集已构建的人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab片段噬菌体抗体;提取阳性克隆的噬菌粒DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-Blue,以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段;应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达上清进行鉴定.结果:第4轮洗脱的噬菌体滴度较第1轮增加200条倍,从抗核抗体Fab片段噬菌体库中筛选出2株阳性克隆,切除gⅢ基因后自连的噬菌粒DNA经XhoⅠ单酶切证实连接成功.间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性抗核抗体Fab片段均呈现抗dsDNA阳性,具有抗原特异性;免疫荧光法结果显示:Hep2细胞和猴肝脏组织细胞核显示均质型荧光,绿蝇短膜虫的动基体显示均质型荧光.结论:成功制备具有抗原特异性的可溶性、人源性抗核抗体Fab片段,为高亲和力抗核抗体Fab片段的制备奠定了基础.     

基因工程技术制备和鉴定抗TNF-α蛋白Fab抗体

目的 利用基因工程技术制备人源性抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白的可溶性Fab抗体,并鉴定其抗原结合活性及特异性.方法 用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性.结果 成功筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47 kD的条带;Western blot分析证实表达的蛋白即Fab抗体.ELISA筛选出2株抗体(TA-04,TA-13)具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应.结论 成功表达并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体,构建了一种基因工程抗体的有效制备途径.为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础.     

从人天然抗体库中克隆IgM抗角蛋白抗体

目的：克隆制备人源性抗角蛋白IgM抗体。方法：以人表皮角蛋白为抗原,从人源性天然抗体库中筛选IgM型抗角蛋白人抗体,并用ELISA对所获抗体进行抗原结合活性和特异性等鉴定。结果：通过3轮“亲和吸附－洗脱－扩增”筛选,获得2株IgM型抗角蛋白噬菌体抗体。酶切去掉载体上的噬菌体基因Ⅲ,得到 了可溶性表达的Fab段。经过鉴定,所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。结论：从人源性天然抗体库中成功筛选出2株抗角蛋白IgM抗体,为进一步研究抗角蛋白抗体的特性提供了条件。     

从噬菌体抗体库中筛选D二聚体特异的Fab抗体

目的:从人源性噬菌体抗体库中筛选抗人D二聚体单克隆抗体并进行可溶性表达。方法:以人D二聚体标准品为抗原对所构建的噬菌体抗体库进行两轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,从中筛选出抗人D二聚体的噬菌体Fab抗体,并在大肠杆菌细胞中进行可溶性表达。结果:经4次电转化构建了库容为2. 8×108cfu的抗体库,滴度为4. 1×1014PFU/mL,Fab基因重组率为46%。经过淘筛后携带抗人D二聚体抗体的特异性噬菌体得到了明显的富集。用试剂盒以ELISA法检测对人D二聚体的结合活性,得到抗人D二聚体单克隆抗体。筛选出的阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达筛选出的阳性克隆在大肠杆菌细胞中可溶性表达。结论:人D二聚体标准品对抗体库的淘筛,富集了表面呈现抗人D二聚体的单克隆抗体的噬菌体,成功构建了人源性抗D二聚体噬菌体抗体,并成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达。     

人源抗EB病毒潜伏膜蛋白1特异性基因工程抗体Fab的筛选与特性

目的:应用噬菌体展示技术制备抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latert membrare protern 1,LMP1)特异性?高亲和力的全人抗体Fab片段?方法:利用稳定转染表达LMP1的SUNE-1细胞及原核表达的LMP1胞外区蛋白作为抗原对大容量人源Fab抗体库进行差减筛选及固相筛选,经过5轮细胞筛选和3轮固相筛选,随机挑选30个克隆经酶联免疫吸附法鉴定,阳性克隆进行可溶性表达,用LMP1阳性表达的人鼻咽癌细胞株HNE2/LMP1鉴定抗LMP1抗体Fab的结合活性?结果:Western blot?免疫荧光结果显示,从大容量人源Fab抗体库中筛选出1株抗LMP1抗体Fab,细胞ELISA?荧光激活细胞分类术?免疫荧光分析?免疫组化检测结果显示Fab与人鼻咽癌细胞表面LMP1分子有较好的结合活性?结论:从人源Fab抗体库中筛选的Fab抗体能够与鼻咽癌细胞表面LMP1分子特异性结合,为研制用于EBV相关肿瘤如鼻咽癌生物治疗的靶向药物,提供了候选分子?     

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和初步应用

目的探索大规模制备抗日本血吸虫单克隆抗体的新途径。方法以日本血吸虫感染小鼠的脾细胞为源,构建抗日本血吸虫噬菌体单链抗体库,并对该抗体库进行了富集、筛选和鉴定。同时,用从抗体库制备的可溶性单链抗体对病人血清进行了检测。结果构建的噬菌体抗体库库容为1.07×106cfu。筛选获得2个特异性阳性克隆。这两株克隆表达的单链抗体用于血吸虫病人血清检测的结果为:(1)以其中一株单链抗体检测急性病人的敏感度为60%,检测慢性病人的敏感度为36.7%,特异度为90%。(2)将两株单链抗体混合后检测急性病人的敏感度为75%,检测慢性病人的敏感度为56.7%,特异度为85%。结论首次成功地构建了抗日本血吸虫噬菌体单链抗体库,并从中筛选制备了能有效检测血吸虫病患者血样中的循环抗原的单链抗体。     

抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4人/鼠嵌合Fab抗体片段的制备及功能鉴定

目的:构建日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的人/鼠嵌合Fab(cFab)抗体片段,并对cFab抗体片段结合活性进行鉴定.方法:用抗体框架区的通用引物PCR扩增抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的VH及VL基因,测序分析其核苷酸序列.将测序正确的鼠源VH、VL分别与人IgG1的CH1、CL通过Overlap PCR扩增Fd及全长L,再利用Overlap PCR以Fd和全长L基因为模板扩增cFab基因.将cFab基因片段克隆至载体pComb3XSS中构建表达载体pComb3XSS-Fab,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导进行蛋白可溶性表达.通过Western blot和ELISA方法对cFab抗体片段进行检测.结果:构建出抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab表达载体,Western blot结果证实在大肠杆菌Top10F'中表达出cFab可溶性抗体片段,ELISA结果显示cFab抗体片段与可溶性虫卵抗原(SEA)有较好的结合活性.结论:表达、纯化了抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab抗体片段,cFab抗体片段具有与亲本抗体相同的抗原结合能力,为制备抗日本血吸虫人源化免疫毒素提供了技术贮备.     

抗人肿瘤坏死因子—α单链抗体基因的构建及序列测定

目的：构建鼠抗人肿坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）单链抗体基因。方法：从分泌ｈＴＮＦ－α单抗的小鼠杂交瘤细胞株Ｅ６中获得抗中变区基因的基础上，采用限制性内切酶酶切拼接法，并按ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ的结构将轻，重链可变区基因拼接单链抗体（ＳｃＦｖ）基因，荧光标记测序引物分析其核苷酸序列。结果：构建成长７４７ｂｐ的单链抗体基因。其中连接钛基因长４５ｂｐ，经序列测定和分析表明为拼接正确，完整的抗ｈＴＨＦ０     

抗CD40单链抗体的慢病毒载体的构建和表达

目的克隆大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体（CD40-scFv）,并构建可表达大鼠抗小鼠的抗CD40抗体的单链抗体（CD40-scFv）的重组慢病毒。方法采用RT-PCR法从分泌大鼠抗小鼠抗CD40激活型抗体的杂交瘤细胞株（FGK-115）中克隆VH和V1基因,用重叠延伸PCR法将V。和V。拼接在一起,构建抗CD40抗体的scFv基因,将CD40-scFv基因连接至PEGM-T克隆载体,限制性内切酶酶切及测序鉴定;构建含有大鼠抗小鼠的抗CIM0激活型抗体的单链抗体（CD40-scFv）的慢病毒穿梭质粒,并与其它包装质粒一起通过磷酸钙法感染293T细胞;获得病毒颗粒并感染人慢性髓系白血病细胞MEG-01,检测其感染效率。结果含大鼠抗小鼠的抗CIM0激活型抗体的单链抗体（CD40-scFv）的慢病毒穿梭质粒构建成功;通过磷酸钙感染293T细胞所得病毒上清可成功感染MEG-01细胞,流式细胞术检测阳性率可达96％。结论成功克隆了大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体（CD40-scFv）基因,并建立其重组慢病毒表达系统,为后续的实验及应用研究工作奠定了基础。     

Management of antiphospholipid antibody syndrome: a systematic review

Context  Antiphospholipid antibodies are autoantibodies directed against proteins that bind to phospholipid. Antiphospholipid antibody syndrome (APS) refers to the association between antiphospholipid antibodies and thrombosis risk or pregnancy morbidity. Patients with APS may be at increased risk of recurrent arterial or venous thrombosis or pregnancy loss. Objective  To systematically review the evidence for treatment of thrombosis risk in patients with antiphospholipid antibodies or APS. Evidence Acquisition  Search of MEDLINE (1966 to November 2005) and Cochrane Library electronic databases (2005) and reference lists for randomized trials, meta-analyses of randomized trials, and prospective cohort studies of the treatment of thrombosis risk in patients with antiphospholipid antibodies or APS. Studies were selected on the basis of clinical relevance. Evidence Synthesis  Among patients with antiphospholipid antibodies, the absolute risk of developing new thrombosis is low (<1% per year) in otherwise healthy patients without prior thrombotic events, may be moderately increased (up to 10% per year) in women with recurrent fetal loss without prior thrombosis, and is highest (>10% in the first year) in patients with a history of venous thrombosis who have discontinued anticoagulant drugs within 6 months. Compared with placebo or untreated control, anticoagulation with moderate-intensity warfarin (adjusted to a target international normalized ratio [INR] of 2.0-3.0) reduces the risk of recurrent venous thrombosis by 80% to 90% irrespective of the presence of antiphospholipid antibodies and may be effective for preventing recurrent arterial thrombosis. No evidence exists that high-intensity warfarin (target INR, >3.0) is more effective than moderate-intensity warfarin. For patients with a single positive antiphospholipid antibody test result and prior stroke, aspirin and moderate-intensity warfarin appear equally effective for preventing recurrent stroke. Treatment issues that have not been addressed in clinical trials, or for which the evidence is conflicting, include the role of antithrombotic prophylaxis in patients with antiphospholipid antibodies without prior thrombosis, the optimal treatment of noncerebrovascular arterial thrombosis, recurrent thrombosis despite warfarin therapy, and treatment of women with antiphospholipid antibodies and recurrent fetal loss. Conclusions  In patients with APS, moderate-intensity warfarin is effective for preventing recurrent venous thrombosis and perhaps also arterial thrombosis. Aspirin appears to be as effective as moderate-intensity warfarin for preventing recurrent stroke in patients with prior stroke and a single positive test result for antiphospholipid antibody. The optimal treatment of other thrombotic aspects of APS needs to be addressed in well-designed prospective studies.      

血清抗甲状腺球蛋白抗体和抗甲状腺过氧化物酶抗体测定的临床诊断意义

目的了解血清抗甲状腺球蛋白抗体(anti-TgAb)和抗甲状腺过氧化物酶抗体(anti-TPOAb)测定对甲状腺疾病的临床诊断意义.方法采用化学发光免疫分析(CLIA)法测定389例患有各种甲状腺疾病及其相关疾病(包括经病理证实的桥本甲状腺炎、Graves病、结节性或毒性结节性甲状腺肿、甲状腺滤泡上皮细胞良、恶性肿瘤;临床诊断的亚急性甲状腺炎、其他内分泌疾病和甲状腺功能正常的其他自身免疫性疾病)患者和45例健康对照者的anti-TgAb和anti-TPOAb水平,并计算其阳性率.结果不同疾病患者的血清anti-TgAb和anti-TPOAb水平及阳性率之间差异具有显著性(均P＜0.001),其中桥本甲状腺炎患者的血清anti-TgAb和anti-TPOAb水平和阳性率最高(其中位数分别为373和6 974 U/ml,阳性率分别为84.3%和86.3%),Graves病次之(中位数分别为84和1 369 U/ml,阳性率分别为44.8%和72.4%),亚急性甲状腺炎和其他自身免疫性疾病患者两种抗体的水平显著高于健康对照者(P＜0.01),血清anti-TPOAb水平显著高于anti-TgAb水平,二者之间呈直线相关(r=0.673,P＜0.001).结论血清anti-TgAb和anti-TPOAb水平测定对自身免疫性甲状腺疾病具有临床鉴别诊断意义.     

抗CD3单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴定

The genes encoding antibody heavy and light chain variable regions(VH and VL)were cloned by RT-PCR from OKT3 hybridoma cells,which produced anti-CD3 moleclonal antibody.The VH and VL genes were fused and become a single chain Fv(scFv).The scFv gene was cloned into pCANTAB5E vector and expressed on bacterial phage surface.By three panning rounds,we have obtained two single-chain antibodys that specific for CD3.The antiCD3 scFv wil be a reagent fox diagnosis and therapy of immuno-disorder.     

习惯性流产患者抗精子抗体、抗子宫内膜抗体和抗心磷脂抗体检测

目的 :探讨免疫因素抗精子抗体 (AsAb)、抗子宫内膜抗体 (EmAb)和抗心磷脂抗体 (ACL)在习惯性流产发病中的作用。方法 :采用凝集试验和ELISA方法对 335例习惯性流产患者和 40名正常对照者的血清AsAb、EmAb和ACL进行检测。结果 :习惯性流产组AsAb、EmAb和ACL的总阳性率分别为 9.85 %、40 .59%和2 5 .0 7% ,均高于正常对照组 (分别为 5 .0 % ,5 .0 % ,0 % ) (P <0 .0 5)。结论 :EmAb和ACL在习惯性流产的发病中可能起一定作用 ;AsAb的检出提示习惯性流产患者的免疫功能处于紊乱状态     

乙酰胆碱受体单克隆抗体对大鼠的致病性

[ 目的 ]筛选能引起重症肌无力的抗乙酰胆碱受体自身抗体 ,为探讨抗体的分子结构与致病性的关系准备材料 .[方法 ]将一株抗乙酰胆碱受体上主要免疫区的单克隆抗体A7被动地转移至健康大鼠 ,根据动物发病后的临床体征、体重丧失率和全身肌肉乙酰胆碱受体损失率判定致病性 .[结果 ]大鼠在接受A7注射后 48h即已出现严重的实验性自身免疫性重症肌无力 ,体重丧失率和全身肌肉乙酰胆碱受体损失率分别为 (6 .8± 1.7) %和 (38.4±7.2 ) % .[结论 ]A7是一株致病性很强的抗乙酰胆碱受体自身抗体     

Nanoparticles as a vaccine adjuvant of anti-idiotypic antibody against schistosomiasis

Background The development of new adjuvants for human use has been the focus of attention. This study’s aim is to explore the possibility of using nanoparticle Ca nanoparticles (CA) as a vaccine adjuvant of anti-idiotypic antibody NP30 against schistosomiasis and its protective mechanisms. Methods Nanoparticle CA-NP30 conjugate (CA-NP30) was fabricated. BALB/c mice were immunized actively with CA-NP30 to evaluate its effects of protective immunity on mice. The serum levels of specific IgG, IgG1 and IgG2a antibodies against NP30 and the concentrations of IFN-γ and IL-4 in supernatant of splenocytes were determined via ELISA. Results Nanoparticle CA could enhance significantly the protective immunity of NP30 against infection of Schistosoma japonicum and the worm reduction rose from 36.0% (NP30 alone) to 52.6%. The serum levels of specific IgG, IgG1 and IgG2a antibodies against NP30 increased remarkably, as compared with those of the group immunized with NP30 alone. The concentration of IFN-γ in supernatant of splenocyte was drastically elevated ［the groups immunized with CA-NP30 and NP30 alone were (493.80±400.74) pg/ml and (39.03±39.58) pg/ml, respectively］, but the concentration of IL-4 showed no significant difference from that of NP30 alone ［(27.94±9.84） pg/ml vs （27.28±14.44） pg/ml］. Conclusions Nanoparticle CA could act as a vaccine adjuvant of anti-idiotypic antibody NP30 against schistosomiasis. The mechanism could be that CA-NP30 enhances humoral and cellular immune responses in mice.     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。