人脾贴壁细胞中TNFα转换酶cDNA的克隆以及LPS对其表达的影响

根据TNFα转换酶（TNFα converting enzyme，TACE）cDNA序列和TACE分子结构特征设计并合成引物，采用逆转录PCR(RT-PCR)技术，首次从健康人脾贴壁细胞中扩增出TACE cDNA解整合素结构片段（disintegrin do-main），并用大肠杆菌脂多糖（LPS）刺激人脾贴壁细胞，观察其对TACE mRNA表达的调节作用。结果表明：不同健康人脾贴壁细胞中均存在TACEmRNA的自然表达，并且LPS对该表达具有上调作用，其上调程度与LPS刺激时间呈正比关系。     

miRNA －17－5 p 在免疫细胞炎症反应和自噬中的作用

目的：探讨脂多糖（ LPS）诱导免疫细胞炎症反应和自噬中miRNA－17－5p的调控作用。方法体外培养人白血病单核细胞株（THP－1）,100 ng／mL佛波醇将THP－1细胞诱导24 h分化成为巨噬细胞,设置空白对照组和LPS刺激组,其中LPS刺激组加500 ng／mL的LPS,空白对照组只加灭菌水。刺激THP－1巨噬细胞12 h后采用酶联免疫吸附法（ ELISA ）检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子－α（ TNF－α）、单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）蛋白水平;采用定量PCR反应检测基因miRNA－17－5p、PTEN的表达情况,采用Western blot检测P62蛋白水平。结果与空白对照组比较, LPS 刺激组培养上清液中TNF－α、MCP－1蛋白分泌量显著增加（ P＜0.01）,PTEN表达显著下调（P＜0.01）,细胞内miRNA－17－5p显著上调（P＜0.01）,细胞内P62蛋白表达上调（P＜0.05）。结论 miRNA－17－5p参与LPS诱导的免疫细胞炎症反应和自噬调控。     

丝裂原活化蛋白激酶通路对脂多糖诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α基因表达的协同调节作用

目的 探讨脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因表达过程中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的协同调节作用及其分子机制。方法 用蛋白激酶活性测定分析LPS刺激RAW264．7细胞引起的激酶活性变化;用报告基因技术和反转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法研究LPS诱导的TNF－α基因转录的分子机制。结果 LPS刺激RAW264．7细胞可引起细胞外信号调节激酶1（ERK1）、c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）和p38MAPK的一过性激活,用MAPK上游激酶的活性突变体分别转染RAW264．7均可不同程度地诱导TNF－α启动子转录活性;而且,这些MAPK通路激活诱导的TNF－α启动子转录活性表现出明显的协同效应;三种MPAPK的无活性突变体均显示出对LPS刺激引起的TNF－α启动子转录激活的抑制效应;RT－PCR的结果证实,ERK、JNK和p38MAPK的特异性抑制剂对TNF－αmRNA表达具有不同程度的抑制作用。结论 LPS刺激引起的TNF－α启动子转录活性增加,可能涉及了ERK、p38和JNK三条通路的激活;这些通路通过协同效应共同发挥对TNF－α基因表达的调控。     

胸腺素α原的生物学活性及基因表达谱芯片分析

目的：对一个新的胸腺素α原（human prothymosina,ProTα）进行生物学活性研究及基因表达谱分析，方法：用体外刺激小鼠脾细胞增殖进行实验及ELISA法检测ProTα对IL－2和TNF－α的诱导分泌作用，并用基因芯片技术对其表达谱进行分析，结果：ProTα对小鼠脾细胞有明显的促进增殖作用，对IL－2和TNF－α有明显的诱导分泌作用（P＜0．01），基因芯片研究发现ProTa对蛋白酷氨酸磷酸酶基因，淋巴细胞抗原6复合体，增殖相关基因A等的表达有上调作用。结论：该新型ProTα在体外实验中有免疫调节活性，并诱导一些基因的表达。     

二次打击肺损伤大鼠肺组织中LBP的表达及山莨菪碱的保护作用

目的 探讨机体遭受一次打击后,脂多糖结合蛋白（LBP）对二次打击的增敏效应及山莨菪碱的保护机制。方法 用油酸（OA,0.2ml／kg）和脂多糖（LPS,2mg/kg）两次致伤,复制大鼠急性肺损伤模型。用RT－PCR检测肺组织中LBP、TNFα、IL－10 mRNA的表达,并行病理组织学和动脉血气分析。结果 一次打击可使肺组织中LBP的表达明显增强,在此基础上行二次打击后,肺组织中TNFα和IL－10的表达增高;山莨菪碱干预可抑制LBP的上调,减少TNFα和IL－10的表达,病理改变也有所减轻。结论 第一次打击后LBP的反应性上调是使机体对第二次打击敏感性增加的重要机制,山莨菪可能通过抑制LBP的过度表达,阻断LBP对LPS的增敏作用,从而发挥其对肺损伤的防治作用。     

LPS对BALB/C小鼠肾小管上皮细胞TLR4和TNFα、IL-6表达的影响

目的 探讨TLR4在BALB/C小鼠肾小管上皮细胞(TEC)的表达和内毒素/脂多糖(LPS)刺激后TLR4的变化,以及对产生肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-6(IL-6)的影响.方法 通过RT-PCR方法 检测TLR4 mRNA、TNFα mRNA和IL-6 mRNA在TEC的表达;流式细胞术检测TEC的TLR4膜蛋白水平;ELISA检测培养的TEC上清中TNFα、IL-6的含量.结果 正常TEC有TLR4 mRNA表达,但TNF αmRNA、IL-6 mRNA表达甚弱.经LPS刺激后,TEC中的TLR4 mRNA、TNF αmRNA和IL-6 mRNA表达均显著增强,TLR4膜蛋白以及培养上清中的TNFα、IL-6水平亦相应增加.结论 TLR4在LPS激活的TEC中表达显著增强,同时TEC分泌的炎症因子TNFα、IL-6的水平也相应上调.     

NO对内毒素诱导的肺泡巨噬细胞核因子-κB活化和TNF -α的调节

目的 探讨一氧化氮对内毒素（lipopolysaccharide,LPS）诱导肺泡区噬细胞核因子－κB（NF－κB）活化及肿瘤坏死因子α（TNF－α）基因表达的调节。方法 用支气管肺泡灌洗法收集肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar Macrophages,PAM）进行培养，分正常对照组，LPS组，NO＋LPS组。用凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）法和ELISA法分别检测核提取物中NF－κB活性和细胞培养上清中TNF－α含量。结果 LPS组NF－κB活性和TNF－α含量在刺激24h后明显高于正常对照组（P＜0.01）；NO＋LPS组NF－κB活性和TNF－α含量均显低于LPS组（P＜0.01）。结论 LPS诱导PAM的NF－κ活化，导致TNF－α基因表达增强；NO可抑制NF－κB活化而减少TNF－α的释放。     

人参皂甙对脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子的作用及机制探讨

目的：研究人参皂甙Rg1和Rb1对脂多糖（LPS）诱导小鼠肺泡巨噬细胞（AM）过度分泌肿瘤坏死因子（TNF－α）的影响,并探讨人参皂甙的作用机制。方法;体外培养小鼠AM,分为对照组、LPS组、RG1 LPS组、Rg1组和Rb1 LPS组,Rb1组。分别收集培养细胞及上清液,测定上清TNF－α水平、上清LPS水平以及细胞中1－κB表达情况。结果：LPS可使AM分泌大量TNF－α（P＜0．01）,并使I－κB表达明显减少（P＜0．01）。Rg1 LPS组与LPS组相比,上清TNF－α水平显著下降（P＜0．01）,细胞内I－κB表达明显增加（P＜0．01）。Rgl LPS组上清游离LPS水平明显高于LPS组（P＜0．05）。Rb1的作用结果与Rg1相似。结论：人参皂甙Rg1和Rb1在体外能抑制AM过量分泌TNF－α,其可能作用机制为通过阻断LPS与AM膜的结合,抑制LPS诱导的细胞内I－κB的低表达,从而使TNF－α的分泌水平下降。     

谷氨酰胺对RAW264.7细胞HSP 72表达和TNF-α释放的影响

目的探讨不同条件下谷氨酰胺（Gln）对小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264．7热休克蛋白（HSP）72表达和肿瘤坏死因子（TNF）-α释放的影响。方法将RAW264．7细胞与含Gin（0、0．5和8mmol／L）的培养液分别进行下列处理：①共同培养165min后,加入脂多糖（LPS）刺激0、1、4、12和24h;②共同培养的同时行热应激预处理45min,370C培养2h后加入LPS刺激4h;③共同培养的同时行DON预处理,165min后加入LPS刺激4h;④两者与含LPS的培养液共同培养1h,改用含0．5mmol／L Gln和LPS的培养液继续培养4h。ELISA法检测细胞上清液TNF-α的浓度,Western blotting检测细胞HSP 72蛋白表达。结果①LPS刺激后4h,RAW264．7细胞均有HSP 72表达,经8mmol／L Gln培养者较经0和0．5mmol／L Gln培养者HSP 72表达显著增加（P〈0．01）,而24h时三者HSP 72表达差异无统计学意义（P〉0．05）;Gln促进TNF-α释放,与Gln呈时间和浓度依赖关系。②热应激显著促进Gln诱导的HSP72表达（P〈0．01）,抑制Gln诱导的TNF—α释放,但TNF—α释放仍随Gln浓度增加而增加。③DON预处理不影响HSP 72的表达,但显著抑制TNF—α释放（P〈0．01）。④短时间不同浓度Gln处理,与0．5和8mmol／L Gln共同培养者较与0mmol／L Gln共同培养者HSP72表达显著增加（P〈0．01）;TNF—α的释放随Gln浓度增加有升高趋势,但三者间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论Gln可诱导RAW264．7细胞表达HSP 72,但并不足以抑制其TNF—α释放。除诱导HSP 72表达外,Gln在脓毒症时调节机体炎症反应还可能存在其他机制。     

脂多糖对人工关节磨屑诱导单核细胞分泌功能的影响

目的探讨脂多糖（LPS）促进人工关节松动的可能性。方法采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定在不同剂量LPS作用下超高分子聚乙烯微粒（UHMWPE）诱导人外周血单核细胞（MOs）,培养3,6,12,24,48h肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）的含量变化。结果与空白对照组A组相比LPS组、UHMWPE组、及不同浓度的LPS联合UHMWPE刺激组刺激3h后TNF—α、IL-6显著升高（均P〈0．05）,12h达高峰,TNF-α、IL-6分泌与LPS呈现浓度依赖性,刺激12,24,48hF组TNF—α、IL-6分泌明显高于A、B、C、D、E组（P〈0．05）。结论LPS能有效地促进由于UHMWPE刺激MOs所致的TNF—α、IL-6的分泌,增强了人工关节置换术后由微粒诱导的骨溶解。     

紫外线辐射对小鼠分泌肿瘤坏死因子α的影响

目的：研究紫外线辐射对小鼠血清肿瘤坏死因子α（TNFα）水平和脾细胞TNFα mRNA表达的影响,从而探讨紫外线辐射所致免疫抑制的作用机制。方法：用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中TNFα含量。一步法提取脾细胞RNA,逆转录聚合酶链反应检测其TNFα mRNA表达。结果：一定剂量的紫外线辐射不能使小鼠血清中出现可检测的TNFα（P＞0．05）,但可使诱生的TNFα水平下降（P＜0．01）,辐射剂量与TNFα的浓度呈直线负相关（P＜0．01）。脾细胞TNFαmRNA表达被抑制（Ｐ＜０．００１）２。结论：紫外线辐射可能是通过抑制具有分泌TNFα功能的淋巴细胞和（或）单核巨噬细胞的TNFα mRNA转录,进而抑制TNFα的分泌,调节机体的免疫反应。     

白藜芦醇对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO和炎性因子生成的调控

目的探讨白藜芦醇（Res）对内毒素（LPS）诱导小鼠腹腔巨噬细胞核因子-κB（NF—κB）活化及炎性细胞因子（TNF—α、IL—1β、IL-6）基因表达的调节，为Res的临床运用提供理论依据。方法分别用LPS或Res＋LPS处理体外培养的小鼠巨噬细胞，采用电子顺磁共振（EPR）自旋捕集技术直接检测巨噬细胞产生的NO，电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测细胞中NF—κB活性，逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中TNF—α、IL—1β、IL-6 mRNA和蛋白的表达。结果表明LPS组NO含量、NF—κB活性和TNF—α、IL-1β、IL-6含量在刺激后2—12h明显高于正常对照组（P〈0．01），而Res＋LPS组NO含量、NF—κB活性和TNF—α、IL-1β、IL-6含量均显著低于LPS组（P〈0．01）。结论提示LPS可诱导巨噬细胞NF—KB活化，导致TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达增强，而Res能抑制NF—κB活化而调节TNF—α、IL-1β、IL-6基因的表达。     

人肾脏近曲小管上皮细胞补体C3基因表达及意义

目的 研究体外培养的人肾近曲小管上皮细胞（PTEC）自身及在肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导C3mRNA的表达。方法 体外培养来源于人正常肾组织的PTEC,并以不同浓度和不同时间TNFα进行诱导,采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）方法对其C3mRNA表达进行半定量分析。结果 未经任何刺激的PTEC可表达C3mRNA,并在TNFα诱导后显著增强,呈剂量和时间依赖。结论 致炎细胞因子TNFα能明显上调人肾脏PTEC补体C3mRNA的表达。     

LPS对小鼠巨噬细胞HIF-1α表达的影响

目的观察在体外常氧条件下，LPS的刺激是否影响巨噬细胞HIF-1α的表达及其机制。方法收集Balb／c小鼠的腹腔巨噬细胞并分组进行体外培养，刺激组给予LPS、对照组给予PBS并作用10h后。采用RT-PCR法检测HIF-1α、VEGF基因的表达水平，应用细胞免疫化学染色法检测HIF-1α蛋白的表达水平。结果LPS刺激组HIF-1α基因表达无明显改变，但HIF-1α蛋白表达显著增加且VEGF基因表达上调（均P〈0．01）。结论常氧条件下，LPS刺激下的巨噬细胞可以在转录后水平上调HIF-1α蛋白的表达，并可通过上调靶基因VEGF的表达参与急性炎症反应。     

葛根提取物体外对TNF,IL—1及IL—2产生的影响

体外用LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞（PMψ）分泌TNF及IL-1，用PHA刺激小鼠脾细胞分泌IL－2的方法来观察葛根提取物对这些细胞因子分泌的影响。结果表明葛根提取物在0．08～2μg／mL浓度时，对LPS刺激PMψTNF的分泌无影响，而对LPS刺激PMψ分泌IL-1，PHA刺激脾细胞分泌IL－2有抑制作用。在10μg／mL时，对TNF、IL－1及IL－2的分泌均呈抑制作用。     

TACE在自体髓核移植背根节致根性神经痛中的作用机制研究

目的:探讨TACE在椎间盘突出致坐骨神经痛发病机制中的作用.方法:采用自体髓核移植至L45,神经节,建立根性神经痛的动物模型.应用Von Frey针丝及RTY-I型热痛测仪对神经行为的改变进行检测,采用免疫组化法检测TACE在神经节及神经根中的表达,采用RT-PCR的方法检测TACE和TNF-amRNA表达,并分析其与神经行为改变之间的相关性.结果:自体髓核移植可以导致明显的机械刺激痛觉过敏现象,而无明显的热刺激痛觉过敏,TACE在自体髓核移植术后4 d表达开始增强(P<0.05),术后1周表达最强(P<0.01),术后3周逐渐恢复正常,与TNF-α的表达及TACE的表达之间存在显著相关性.结论:TACE作为释放活性TNF-a的特异性蛋白酶,自体髓核移植至DRG后,其蛋白表达升高,TNF-amRNA、TACEmRNA表达之间存在线性相关,说明TACE可能是抗TNF-α治疗的新靶点,在治疗椎间盘突出引起的根性神经痛中具有重要作用.     

缺氧复氧后肾小管上皮细胞肿瘤坏死因子α的表达及胡黄连提取物对其的作用

目的观察缺氧复氧后肾小管上皮细胞肿瘤坏死因子α（TNFα）的表达及胡黄连提取物对其的影响。方法建立人肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤模型,分别用不同浓度胡黄连提取物（10μg／mL、100μg／mL、1000μg／mL）进行预处理,采用流式细胞术检测不同组细胞内氧化应激水平,ELISA法检测细胞上清TNFα蛋白表达、RT—PCR法测定细胞TNFα mRNA表达。结果缺氧复氧后肾小管上皮细胞内氧化应激水平提高,细胞TNFα蛋白和mRNA表达上调,且随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高,TNFα表达逐渐增强;胡黄连提取物呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平,同时呈剂量关系抑制TNFα表达的上调。结论缺氧复氧导致肾小管上皮细胞内氧化应激增强,进而诱导TNFα表达上调;胡黄连提取物可以通过抑制细胞内氧化应激抑制TNFα的上调。     

脂多糖对THP-1细胞CD14诱导表达的影响

目的探讨脂多糖(LPS)对THP-1细胞CD14诱导表达的影响。方法应用不同质量浓度(0.1~50 mg/L)的LPS刺激培养48 h的THP-1细胞,并测定其CD14mRNA、肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素6(IL-6)表达的变化。结果正常培养条件下,THP-1细胞CD14表达量极低,而LPS对单核巨噬细胞THP-1具有显著的诱导激活作用,在较低质量浓度剂量刺激下即可被活化,表现为CD14mRNA表达量迅速增加,同时,LPS可诱导THP-1细胞产生TNF-α和IL-6,并在一定范围内呈剂量依赖关系。结论LPS可导致THP-1细胞活化,显著上调CD14mRNA的表达,并诱导产生炎症介质TNF-α和IL-6。     

炎性介质脂多糖、γ干扰素活化星形胶质细胞效应

目的研究炎性介质脂多糖（LPS）、γ干扰素（IFN-γ）刺激离体星形胶质细胞的效应。方法LPS、IFN-γ刺激离体培养纯化的小鼠星形胶质细胞,ELISA检测细胞分泌TNF-γ,Griess法测定NO浓度,激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）检测细胞内游离钙浓度（[Ca2＋]i）。结果LPS（500ng／ml）、IFN-γ（100U／ml）刺激星形胶质细胞24h后,NO和TNF—α的分泌显著升高,联合应用有协同作用;延长IFN-γ作用时间,分泌量升高。CLSM检测LPS、IFN-γ刺激24h后的星形胶质细胞[Ca2＋]i的荧光值,显示荧光相对值比正常细胞明显升高;LPS、IFN—γ急性刺激正常培养细胞发现[Ca2＋]i振荡卜升;而作用于IFN-γ刺激24h后的细胞,[Ca2＋]i上升明显减缓。结论LPS、IFN-γ可以活化星形胶质细胞,表现为[Ca2＋]i升高,TNF—α和NO分泌上调。     

TACE在小鼠动情周期的表达规律

目的:初步探讨肿瘤坏死因子α转换酶(Tumor necrosis faemr-α convening enzyme,TACE)在小鼠动情周期中的表达规律.方法:用RT-PCR及免疫组化方法分别检测动情周期各期小鼠子宫内膜TACEmRNA和蛋白的表达.结果:TACEmRNA在动情周期小鼠子宫内膜呈规律性表达,在动情期表达明显增强,与其它3期相比有显著性差异(P<0.01);其它3期间无显著性差异(P0.05).免疫组化分析显示TACE在子宫内膜的表达规律与RT-PCR一致.结论:TACE通过裂解EGFR家族多种配体释放其胞外区,从而激活EGFR信号途径,在子宫内膜的周期性变化中起着重要作用.