应用Hoefer GE 200 Gel Eluter纯化重组的LTB

目的：纯化基因重组表达的大肠杆菌毒素B亚单位（LTB），方法：采用Hoefer GE 200 Gel Eluter从聚丙烯酰胺凝胶中回收LTB蛋白，SDS－PAGE，HPLC分析其纯度，western-blot分析其免疫学性质，结果：电洗脱1次可获得300ug重组蛋白，纯化蛋白经Tricine-SDS-PAGE电泳表现为单一蛋白质带，HPLC检测纯度为99．46％，免疫印迹证实其保持有免疫学活性。结论；该系统纯化LTB蛋白操作方便，快捷，所得蛋白纯度好，回收率高。     

人表皮丝集蛋白的纯化和鉴定

丝集蛋白是类风湿关节炎相关的自身抗体。利用乙醇沉淀、HiPrep 16/10 QXL凝胶结合高效液相色谱离子交换层析(HPLC)纯化人表皮丝集蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳确定相对分子质量,并采用免疫印迹法(Western blot)、用抗丝集蛋白单克隆抗体进行鉴定。所获得的表皮细胞丝集蛋白相对分子质量44 000,纯度达到电泳纯,经免疫印迹法鉴定,抗原性良好。表明利用乙醇沉淀法结合HPLC系统,可高效、简便、快速地分离和纯化人表皮丝集蛋白。     

人CD28-Fc融合蛋白在真核细胞中的表达与纯化

目的建立稳定表达CD28-Ig融合蛋白系统,提供用于研究的CD28-Ig融合蛋白。方法构建高表达的真核细胞表达载体,利用FAD批准的、可用于生产人用重组蛋白药物的CHO细胞进行表达,MTX加压筛选出稳定表达的细胞株。蛋白A纯化获得电泳纯融合蛋白。结果经RT-PCR,SDS-PAGE及Western印迹鉴定,CHO细胞上清中纯化的蛋白是CD28与Ⅰg的融合蛋白,并获得纯度较高的融合蛋白。结论成功建立CD28-Ig融合蛋白表达体系,并获得稳定表达融合蛋白的细胞株,为T细胞活化第二信号系统的基础研究奠定了基础。     

穿膜肽-EGFP融合蛋白的表达、纯化与鉴定

目的 构建EGFP-CPPs融合基因载体,表达、纯化并鉴定EGFP-CPPs融合蛋白。方法 通过碱基合成的方法合成含有CPPs基因序列的EGFP上游引物,PCR扩增后收集CPPs-EGFP融合基因片段并电泳鉴定,将融合基因表达载体转染大肠杆菌并扩增表达,收集表达蛋白后过层析柱纯化,蛋白电泳检测表达蛋白分子量,蛋白飞行质谱分析检测蛋白序列,体外细胞实验验证其穿膜功能。结果 电泳检测可见与CPPs-EGFP分子量对应的电泳条带,构建质粒测序含有目的基因序列。蛋白电泳检测到纯度较高的融合蛋白,其蛋白序列与目的序列一致。体外细胞实验证实了融合蛋白的穿膜功能。结论 成功制备了具有穿膜功能的CPPs-EGFP融合蛋白,为其促进抗体-蛋白微球偶联物进入肿瘤细胞发挥治疗作用的研究奠定了基础。     

乳腺癌特异性转导小肽融合表达载体的构建以及目的蛋白的表达

目的构建乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。方法合成PI的DNA序列,将其定向插入到p EGFPN2中,经双酶切获取PI-EGFP的核苷酸序列,再将其克隆入原核表达质粒pET-28a(+),构建出pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;重组质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用His-tag对蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹免疫分析(Western blot)鉴定纯化蛋白质。结果成功构建了pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;其经诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以可溶性形式存在;SDS-PAGE分析显示,在相对分子量约33kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经His TALONTM Cartridge亲和层析纯化获得了高纯度的重组的PI-EGFP融合蛋白,Western blot鉴定结果显示获得了目的蛋白。结论成功构建出乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白原核表达载体,并能够表达出PI-EGFP的融合蛋白,为进一步研究小肽的乳腺癌特异性转导功能奠定基础。     

脂肪细胞新蛋白My027原核表达、纯化及生物活性研究

目的通过原核表达获得大量脂肪新蛋白质My027,并在体外初步研究其生物活性。方法RT-PCR法扩增出My027片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-My027。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,经亲和层析法获得融合蛋白,利用SDS-PAGE、Western印迹及质谱进行鉴定。在还原性谷胱甘肽存在的条件下,将纯化得到的融合蛋白作用于乙二醛酶Ⅰ的底物甲基乙二醛,通过分光光度法检测产物乳酸谷胱甘肽的生成。结果融合蛋白以水溶形式分泌于大肠埃希菌BL-21胞浆中,纯化后的目的蛋白SDS-PAGE、Western印迹及质谱证实高效表达,氨基酸序列正确。结论人脂肪细胞新蛋白质My027在pGEX-4T-2原核表达载体中可获高效表达,所纯化蛋白具有类似于乙二醛酶Ⅰ的作用。     

Stxl-A亚单位的原核表达、复性及抗原性鉴定

目的 构建志贺毒素1-A亚单位(Stxl-A)原核表达质粒,使其在大肠埃希菌中表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其抗原性及应用价值.方法 以大肠埃希菌0157 DNA为模板扩增Stxl-A基因,重组克隆入原核表达载体pET32a( ),转化大肠埃希菌B121(DE3),异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,包涵体经镍柱柱上复性和纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定.结果 重组质粒经双酶协鉴定和测序分析后证实构建成功.重组蛋白经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,其表达量占细菌总蛋白量的15%左右,主要以包涵体形式存在,通过镍柱柱上复性获得纯化的可溶性Stxl-A蛋白,纯度达95%以上,Western印迹检测显示特异性条带.结论 成功构建了pET32a( )/Stxl-A重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Stxl-A蛋白,为进一步制备抗Stxl-A抗体和研究其生物学功能奠定了基础.     

重组人leptin的复性、纯化和免疫学及生物学活性鉴定

对重组人leptin(rh-leptin)蛋白进行复性及纯化,并鉴定其免疫学及生物学活性.将由大肠杆菌(E.coli)重组表达获得的rh-leptin,复性、纯化后进行SDS-PAGE电泳和Western印迹杂交鉴定其特异性,并通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验检验其生物学活性.结果表明通过对rh-leptin进行复性和纯化,获得了高纯度的具有免疫学和生物学活性的rh-leptin蛋白,可供进一步研究应用.     

抗早孕因子单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立分泌抗EPF(Early pregnancy factor,早孕因子)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化单抗并鉴定.方法用本实验室已纯化的早孕和肿瘤源性EPF作为抗原刺激Balb/c小鼠,用免疫后的小鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞(NS-1)融合,经4次克隆化,获得可稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,注入Balb/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-A亲和层析纯化,SDS电泳和Western-blot等方法分析纯化结果.结果融合后获得一株稳定分泌抗EPF抗体的细胞株(C3D11),克隆化后,获得稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,将增殖后的细胞注射Balb/c小鼠腹腔获得腹水型单抗,以亲和层析法纯化,SDS-PAGE分析显示纯化后去掉了大部分杂蛋白,免疫印迹分析抗体纯度较高,与抗原匹配性良好.结论本研究制备的EPF单克隆抗体为特异性抗EPF抗体.     

TP47蛋白在梅毒血清学诊断中的应用

目的采用原核基因工程技术重组表达梅毒螺旋体TP47蛋白,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法PCR扩增获得TP47基因片段并构建pET28b-TP47原核表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白质表达。经镍柱纯化后通过质谱技术进行鉴定。采用免疫印迹法测定其与梅毒患者血清的免疫反应性。建立基于重组TP47抗原的ELISA间接法并对30份TPPA阳性血清和75份TPPA阴性血清进行方法学验证。结果PCR扩增获得约1．1kb的基因片段,成功构建原核表达载体pET28b-TP47。重组蛋白在细菌中以包涵体形式表达,约占菌体蛋白含量的70％,分子量约39000Mr,经纯化后其纯度约95％。经质谱分析表明重组蛋白为TP47蛋白。免疫印迹法证实TP47蛋白能够与梅毒患者血清发生特异性反应,ELISA测定TPPA阳性血清和阴性血清的符合率分别为97％（29／30）和97％（73／75）。结论通过DNA重组技术成功获得了梅毒螺旋体TP47蛋白,证实其与梅毒阳性血清具有良好的反应性,为研发新一代梅毒感染诊断试剂盒奠定了基础。     

Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort

Development of hemoglobin-based blood substitutes requires production of highly purified hemoglobin. Process of hemoglobin purification by ion exchange chromatography in flow-through mode was researched and optimized. Three kinds of media including, QMA Spherosil LS (Biosepra, France) and Q Sepharose Big Beads (Amersham Bioscience, Sweden), and an anion exchange membrane column, Mustang Q (PALL, USA) were investigated and compared. Adding polyethylene glycol (PEG) as an escort in ion exchange chromatography improved the purity and recovery, and the recovery in the chromatography was increased from 75 to 95%. The mechanism of PEG effects on chromatography was discussed. The optimal chromatography step, in combination with hypotonic dilution hemolyzing and membrane separation, formed an integrated hemoglobin purification process. The total recovery in the process was 87.6%. The activity of hemoglobin was well preserved: P50 23.2 mmHg, and Hill coefficient 2.31. The product appeared as a single band in SDS-PAGE, and GF-HPLC showed only one peak. The purity of the prepared hemoglobin was more than 99.9%. The optimized process is time saving and suitable for large-scale preparation of hemoglobin to provide materials for further preparation of blood substitutes.     

重组广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（AcCystatin）的理化性质研究

目的研究重组广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（AcCystatin）的理化性质及其生物学功能。方法原核表达质粒pGEX-4T-1-AcCystatin经诱导表达、纯化酶切后获得纯化AcCystatin,采用Edman降解法N-端氨基酸测序进行重组蛋白鉴定。分别检测其紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱和对人源Cathepsin B、Cathepsin G、Cathepsin L和Cathepsin S酶的抑制活性,分析AcCystatin理化性质。结果重组AcCystatin蛋白经纯化、酶切后相对分子质量约为13600,纯化效果良好,氨基酸测序结果与理论氨基酸序列完全相同。光谱学检测结果显示重组AcCystatin可形成二硫键,二级结构中α-螺旋、β-折叠和无规卷曲分别占39.57%、35.28%和25.25%。酶抑制实验结果显示AcCystatin可显著抑制Cathepsin B、Cathepsin L和Cathepsin S酶的活性,但对CathepsinG酶活性无明显作用。结论获得的可溶性AcCystatin重组蛋白产量大、纯度高、蛋白结构折叠正常,具有良好的生物学活性,为AcCystatin免疫调节机制的深入研究奠定了实验基础。     

SARS-CoV抗原的纯化与鉴定

目的 纯化灭活SARS-CoV为研制马抗SARS-CoV免疫球蛋白提供抗原。方法将灭活的SARS-CoV悬液超滤浓缩,用Sepharose 4 Fast Flow分子筛和阴离子交换柱层析纯化,用高效液相色谱、SDS-PAGE和电镜观察测定抗原的纯度。结果将01、02和03三批SARS-CoV悬液分别进行11．2倍、12．5倍和25．0倍超滤浓缩,抗原的回收率依次为48．6％、46．3％和55．6％,凝胶过滤层析后抗原的回收率依次为81．6％、79．3％和86．0％。再经阴离子交换梯度层析进一步提高了抗原的纯度和浓度,蛋白的比活性由纯化前的0．11U/μg增加到1．44U／μg。电镜下观察到SARS-CoV抗原颗粒完整,呈圆形或椭圆形状,直径在80～120nm之间。SDS-PAGE显示主要条带位于Mr 43000～66000之间,经质谱扫描分析确定该成分为Mr 46000。高效液相层析法分析抗原纯度为97．0%。马抗SARS-CoV免疫球蛋白中和抗体效价在1：6400～1：12800之间。结论本研究为制备高效价的马抗SARS-CoV免疫球蛋白奠定了基础。     

放射性3,3’-二碘甲腺氨酸（（131）I-T2）的合成

目的：获得放射性3,3’-二碘甲腺氨酸（131I-T2）,为下一步硫酸化得到3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物（131I-T2S）作准备。方法：采用氯胺T法以131I标记3-单碘甲腺氨酸（3-T1）,凝胶柱层析法及纸层析法分离、纯化。测定标记率、放射化学纯度和标记物稳定性,并鉴定标记物的免疫活性。结果：131I标记率为65.1%±4.5%（n=5）,标记物的放化纯度为96.5%±1.1%（n=5）。经-20℃储存10d后放化纯度仍〉90%。结论：氯胺T法可获得较高碘标记率及较稳定的标记物。     

新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化

目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。     

组氨酸标签人β干扰素在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定

目的 在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白,并进行蛋白纯化和生物活性测定.方法 提取人Bel-7402细胞总DNA为模板,经PCR获得人β干扰素编码基因片段.将此基因插入表达载体pET-16b,重组克隆,经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和条件优化.表达产物经West...     

带鱼过敏原的分离、鉴定与纯化

目的分离、鉴定和纯化带鱼特异性过敏原。方法采用Coca’s提取液提取带鱼蛋白；十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western—blotting分析其中的过敏原；阴离子交换层析对过敏原进行分离纯化。结果带鱼粗浸液蛋白分子量在8～130kDa之间；Western—blotting检测到分子量为12、18、25、27、29、34、38、54和60kDa的过敏原蛋白；通过离子交换层析分离得到较纯的分子量为18、38kDa的过敏原蛋白，且具有免疫活性。结论发现了带鱼中多种过敏原，并对2种过敏原分离纯化，为带鱼过敏的诊断和治疗奠定了理论基础。     

抗人大肠癌单链抗体与绿色荧光蛋白融合基因的构建和表达

目的构建并表达绿色荧光蛋白(GFP)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,产生具有荧光的抗体。方法将鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的基因克隆到pET28a(+)-GFP的表达载体,转化到大肠杆菌BL21中进行融合基因ND-1-scFv/GFP诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化,免疫印迹和荧光显微镜方法验证融合蛋白的表达。结果 ND-1scFv被克隆到表达载体pET28a(+)-GFP中,诱导表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量为58kDa。SDS-PAGE灰度扫描结果显示纯化后的蛋白纯度为90%,荧光显微镜检测显示,表达有目的蛋白的大肠杆菌BL21具有明显的绿色荧光。结论成功构建并表达融合基因ND-1-scFv/GFP,为该单抗的肿瘤特异成像研究奠定了基础。E.coli     

原核高效制备人乳头瘤病毒16型L1病毒样颗粒

目的通过原核表达系统高效制备人乳头瘤病毒(HPV)16晚期蛋白L1病毒样颗粒(VLPs)。方法构建HPV16L1基因序列优化前后的PET30aHPV16L1重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3);用IPTG诱导目的基因表达,两步层析方法纯化HPV16L1蛋白;电镜下观察纯化产物形成VLPs的情况。结果成功构建大肠杆菌工程菌,高效可溶表达(目的蛋白约占总蛋白的38%)并纯化HPV16L1蛋白,纯度达95%以上,电镜下观察,发现纯化后的目的蛋白为直径50 nm左右,形态与天然病毒颗粒高度相似。结论在大肠杆菌原核系统中高效、简易地制备了HPV16L1VLPs,为诊断试剂和疫苗的研制奠定基础。     

疏水层析法和凝胶过滤法分离HI47抗CD20 F(ab'''')2之比较

目的　比较疏水层析和凝胶过滤两种方法分离纯化HI4 7抗CD2 0F(ab’) 2 的优缺点。方法　采用亲和层析柱protein G对发酵菌体裂解液进行粗纯化,分别采用疏水层析法和凝胶过滤法进行抗CD2 0F(ab’) 2 的分离纯化:疏水层析采用梯度洗脱,80 %B液洗脱2 0min ,10 0 %B液洗脱30min ;凝胶过滤以5 0mmol LPB缓冲液(pH 7.0 ) ,0 .8mL min洗脱4h。结果　粗纯化产物主要含F(ab’) 2 、Fab’,含量分别为19.6 %、5 9.7%。采用疏水层析法1h即可完成分离,F(ab’) 2 回收率为6 7% ,纯度为89.3% ;凝胶过滤4h完成分离,F(ab’) 2 回收率为6 5 % ,纯度为90 .5 %。FACS结果表明,两者结合Raji细胞的阳性率分别为99.93%和99.97%。结论　疏水层析分离纯化抗CD2 0F(ab’) 2 简单、快速、回收率高、纯度高,适用于大规模的工业化生产。