培养基pH值对毛乳头细胞合成细胞外基质影响的组织化学研究

目的 研究不同pH值条件下毛乳头细胞的细胞外基质的合成情况及其与毛乳头细胞凝集性生长特性之间的关系.方法 通过用不同pH值的DMEM培养基培养低代毛乳头细胞12d,并对4种培养条件下的毛乳头细胞进行阿新蓝、过碘酸雪夫氏染色,观察染色反应的强弱.结果 阿新蓝-PAS联合染色后,pH6.8培养条件下的毛乳头细胞胞浆内以红色为主,仅含有少许蓝色.pH7.2、pH7.6培养条件下,大部分毛乳头细胞胞浆内既有红色又有蓝色,一部分细胞胞浆内则完全为蓝色,还有少部分细胞胞浆内完全为红色,而且毛乳头细胞在这两种培养条件下出现凝集性生长,毛乳头细胞凝集区域内红色和蓝色明显强于非凝集区.pH8.0培养条件下的毛乳头细胞胞浆内均为红色且未发现凝集性生长出现.结论 毛乳头细胞体外培养环境的最佳pH值为pH7.2～7.6,毛乳头细胞培养环境的酸碱度能够影响毛乳头细胞的细胞外基质的酸性黏多糖的合成.毛乳共细胞合成的酸性黏多糖与毛乳头细胞的凝集性生长有密切关系.     

毛乳头细胞凝集性生长对诱导毛囊样结构形成能力的影响

目的　以细胞外基质成分纤维连接蛋白促进培养的人头皮毛乳头细胞凝集性生长行为 ,观察毛乳头细胞的凝集性生长对诱导毛囊形成能力的影响。方法　传代培养的人头皮毛乳头细胞经细胞外基质纤维连接蛋白预处理后 ,促进形成凝集性生长团 ,再与毛囊上皮细胞共同移植于裸鼠皮下 ,分别于 8、12周进行组织学检查 ,观察毛囊形成及分化程度。结果　 8周后纤维连接蛋白预处理的毛乳头细胞组可见有毛囊样结构形成 ,未处理组仅见松散细胞团 ;12周后两组均可见有毛囊样结构形成 ,但纤维连接蛋白预处理组较未处理组诱导形成毛囊样结构分化更成熟 ;真皮成纤维细胞组未见有毛囊样结构形成。结论　毛乳头细胞的凝集性生长特性对其诱导毛囊形成的能力有密切的关系 ,细胞呈凝集性生长后 ,其生物学功能增强。     

人毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因cDNA文库的构建

目的 构建毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的消减cDNA文库。方法 分别提取凝集性生长和非凝集性生长状态下毛乳头细胞中的总RNA，应用SMART cDNA合成技术和抑制性消减杂交技术分离毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的cDNA片段并建立消减cDNA文库；利用PCR对随机挑选的100个白色菌落进行插入片段的验证，对其中证实有插入片段的30个克隆进行cDNA斑点杂交验证。结果 所构建的消减cDNA文库扩增后得到320个阳性克隆，随机挑选的100个阳性克隆中95％的均有长度在100—600bp的插入片段，cDNA斑点杂交验证显示27个(90．0％)克隆为阳性。结论 结合SMART cDNA合成技术，应用抑制性消减杂交成功地构建了毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因消减cDNA文库，为进一步筛选和克隆毛乳头细胞凝集性生长相关基因奠定了基础。     

毛囊真皮细胞的培养和组织化学研究

为了提高毛乳头细胞增减的成功率和工作效率，并观察体外培养条件下毛乳头细胞的组织化学性质。材料与方法采０．２％胶原酶Ｄ直接消化产砂皮毛囊下部真皮鞘组织，分离出来的毛乳头予以浮培养。真皮鞘细胞和毛乳头细胞分别是用ＤＭＥＭ培养基进行传代培训和多种组织化学染色。结果消化法显著降低了劳动强度，提高了培养成功率，加快了毛乳头细胞的生长，组织化学染色表明，毛头头细胞阿新兰，甲苯胺Ｏ和ＰＡＳ染色阳性，有异染性，尤     

人毛乳头细胞在不同传代时期某些细胞因子表达的变化

目的 观察毛乳头细胞在体外培养条件下的生长特性,为毛囊重建提供参考资料.方法 采用二步酶消化法分离正常人头皮毛囊的毛乳头细胞,在体外进行传代培养,用免疫组化方法观察不同传代毛乳头细胞生长因子表达的差异.结果 高代培养毛乳头细胞逐渐丧失其凝集性生长的特性,生长因子的表达逐渐消失.结论 毛乳头细胞的生长及其特性的保持受许多因素的影响,体外培养的毛乳头细胞与体内有差异.低代毛乳头条件培养基可恢复毛乳头细胞部分生长特性.     

硫酸软骨素、硫酸肝素对毛乳头细胞粘附及生长的影响

目的：探讨细胞外基质在毛囊生长发育中的作用,寻持毛乳头细胞（DPC）生长的调节因素。方法：用两步酸消化法分离培养DPC,并通过免疫组化α-平滑肌肌动蛋白（Actin）染色证实。测定硫酸软骨素A,硫酸软骨素C及硫酸肝素对DPC粘附及生长的影响。结果：两步酶消化法分离培养DPC效率高,纯度高,方法简单易行。硫酸软骨素A和硫酸肝素明显促进DPC粘附及生长,而硫酸软骨素C作用不明显。结论：某些细胞外基质可调节DPC的生长,从而影响毛囊的生长发育。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养

目的：建立分离和培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的方法,观察大鼠MSCs(rMSCs)的生物学特性。 方法：用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,在含10%限定性胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养,并传代扩增MSCs。 结果：rMSCs是骨髓粘附细胞中形态均一的同源细胞群,组织化学结果显示rMSCs PAS-过碘酸雪夫氏染色阳性,苏丹黑-B及碱性磷酸酶染色阴性。 结论：所建立的大鼠MSCs的分离和培养条件可分选出骨髓粘附细胞中一组独特的同源细胞群,该细胞群有其特殊的代谢特点。     

毛乳头细胞的高效快捷培养方法

目的：为了提高分离毛乳头的效率和培养细胞的成功率，建立一种新的培养方法。方法：采用0.2%胶原酶直接消化人头皮毛囊下部的真皮组织，对分离出来的真皮鞘细胞和毛乳头细胞分别用DMEM培养基进行培养，结果：消化法显著降低了劳动强度，提高了培养成功率。加快了毛乳头细胞的生长。结论：消化法是一种简捷快速的、高效的培养毛乳头细胞的方法。     

人脐血基质细胞分离培养的实验研究

目的：探讨人脐血CD34^ 细胞群中分离培养造血基质细胞的可行性。方法：分离人脐血CD34^ 细胞，采用Dexter法培养，对贴壁细胞进行观察和鉴定。结果：Dexter培养9～14d(平均11．2d)开始形成基质细胞集落，15～22d(平均19．6d)集落数量最多，培养28d贴壁细胞铺满培养皿底。细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、“小圆”类细胞为主；细胞化学染色：非特异性酯酶染色(NSE)、糖原染色(PAS)：100％阳性，过氧化物酶染色(POX)：阴性，碱性磷酸酶(ALP)：28％阳性；免疫组化染色：CD106：阳性96％，CD29：93％阳性，CD44：98％阳性，CD45：阴性，CD50：62％阳性，纤维粘连蛋白(Fn)：92％阳性，层粘连蛋白(Lm)：74％阳性，胶原Ⅳ：83％阳性。结论：人脐血中存在造血基质细胞的前体细胞。     

毛乳头细胞生长相关基因的筛选

研究表明 ,位于毛囊基底部的特殊间质成分———毛乳头在毛囊的生长发育、周期调控及维持毛发生长中起主导作用。毛乳头的功能障碍是导致毛囊周期失衡和脱发现象的主要起始因素。因此研究毛囊的生长发育、调控机制应不能脱离毛乳头细胞的功能状态。目前对毛乳头细胞的研究已发现一些活性蛋白及细胞因子对毛囊的生长有调节作用 ,但这些成分在毛囊生长调节中并不是关键因素 ,而是在生理 /病理发展过程中起辅助调节作用。在前期的研究中 ,我们证实了毛乳头在体外凝集性生长状态下较非凝集性生长状态生物学功能及诱导毛囊形成的能力均显著增强 ,…     

Screening and analysis of differentially expressed genes of dermal papillae cells with aggregative behavior

Objective: To screen and clone differentially expressed genes of dermal papillae cells (DPC) with aggregative behavior, and to explore the molecular mechanism of their aggregation. Methods: Total RNAs were extracted from DPC with and without aggregative behavior and double strand cDNAs were synthesized by using SMART cDNA synthesis, respectively.The cDNA fragments of differentially expressed genes in DPCs with aggregative behavior were isolated by suppression subtractive hybridization. Positive clones were screened by PCR method and verified by cDNA dot blot, Northern blot and then analyzed through homologous retrieving. Results: A subtractive cDNA library of DPC with aggregative behavior has been successfully constructed. The result of screening and cloniog of the library showed that, DPC with aggregative behavior could expresse genes related to homologous aggregation, proliferation and cycle control, including known genes (capping protein,paladin, vascular endothelial growth factor), hematopoietic stem/progenitor cells (HSPC) related clone ( HSPC011 and HSPC016) and a new gene. Conclusion: The construction of subtracted library of DPC lays solid foundation for screening and cloning new and specific genes related to aggregative behavior of DPC. Several genes might be cooperatively involved in the homologous aggregation, proliferation and cycle control of DPC.Among these genes, capping protein and palladin might be closely related to the aggregative behavior of dermal papilla cells, and VEGF and HSPC related clone would be responsible for the status of higher proliferation of dermal papilla cells.     

活血补肾合剂对人头皮毛乳头细胞中血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的:观察活血补肾合剂对人头皮毛乳头细胞增殖及其血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法:将12只正常雄性SD大鼠随机分为3组,即活血补肾合剂组、养血生发胶囊组和生理盐水组,分别以不同药物灌饲大鼠。3d后采血收集血清,以三种药物血清分别培养人头皮毛乳头细胞;MTT法检测三种药物血清对毛乳头细胞增殖的影响;以RT-PCR方法检测三种药物血清对毛乳头细胞VEGF mRNA表达的影响;用免疫印迹法检测三种药物血清对毛乳头细胞VEGF蛋白表达的影响。结果:活血补肾合剂组和养血生发胶囊组毛乳头细胞数目显著多于生理盐水组(P0.05);活血补肾合剂组VEGF mRNA及其蛋白表达高于养血生发胶囊组和生理盐水组(P0.05)。结论:活血补肾合剂可能是通过上调人头皮毛乳头细胞VEGF表达以促进毛乳头细胞增殖和毛发生长。     

毛乳头在毛囊生长周期中的变化和作用

目的 了解人毛乳头结构在毛发生长周期中的变化及其对毛发生长的调控作用.方法 将整形手术后取下的头皮在无菌条件下分离成游离的毛囊,在Williams E培养基中培养;通过横断毛囊和完整毛囊的培养来观察毛囊的生长状况和处于不同生长周期的毛囊的毛乳头结构变化.结果 分离后的完整毛囊在Williams E培养基中平均可继续生长12 d,平均生长速度为每天0.2～0.3 mm;静止期或生长初期毛囊的毛乳头呈圆形贴在毛球底部,快速生长的毛囊毛乳头变长呈锥形,结构疏松,与毛根紧密相接,当毛囊进入衰退期直至停止生长后毛乳头萎缩变小,并与毛根逐渐分离.在低位横断毛囊,毛囊可再生毛球并继续生长,但生长速度减慢;在高位横断毛囊,毛囊不能继续生长.结论 毛乳头在毛发生长周期中不断变化,生长期毛乳头体积增大,与毛母质联系紧密,它在毛囊的生长和生长周期中起着不可缺少的调控作用.     

体外培养毛乳头细胞的versican基因表达变化

目的 探讨versican基因及蛋白在体外培养的毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPC)中的表达变化,并研究其对DPC凝集性生长特性的影响.方法 利用酶消化法分离培养DPC,并进行体外培养传代,观察不同代次DPC凝集性生长特性的变化.应用Western blot、RT-PCR检测DPC的β-catenin、versican的表达情况,对比研究其与DPC凝集性生长的关系.结果 随着DPC由低代向高代分化,其凝集性生长特性逐渐减弱,versican表达水平逐渐降低.Wnt途径上调versican基因的表达,能够使高代DPC表达β-catenin、versican增强.结论 versican基因和蛋白水平的表达与DPC凝集性生长呈正相关;versican基因是调控DPC凝集性生长的重要基因,versican的表达对毛囊(hair follicle,HF)的形成起着十分重要的作用,并在维护HF周期中扮演重要角色.     

毛乳头细胞凝聚性生长差异表达基因的筛选及HSPC016全长克隆的生物信息学分析

目的　筛选与毛乳头细胞 (DPC)凝聚性生长相关的基因表达 ,全长克隆凝聚性生长相关基因HSPC0 16并进行生物信息学分析。方法　应用抑制性消减杂交技术 ,构建DPC凝聚性生长与非凝聚性生长的cDNA消减文库 ,克隆鉴定凝聚性生长特异表达基因。应用RACE技术 ,克隆DPC凝聚性状态下HSPC0 16全长表达序列 ,使用生物信息学手段分析其染色体定位、蛋白序列、结构域及功能。结果　成功构建了DPC凝聚性生长差异表达cDNA文库 ,筛选出DPC与细胞同源凝集、生长调控、分化发育及信号转导相关的基因 ,其中包括HSPC0 16。HSPC0 16全长cDNA为 4 0 0bp ,染色体定位于 3q2 1 31;HSPC0 16蛋白为 6 4aa,结构域属于PD0 5 3992家族 ,与T2FA基因功能域同源。结论DPC凝聚性生长的差异表达cDNA文库为进一步筛选并克隆DPC凝聚性生长相关基因奠定了基础 ,也为宏观分析多基因协同参与DPC生长调控和功能发挥提供了依据。HSPC0 16的生物信息学分析显示此基因与DPC基因转录调节有关     

大鼠触须毛乳头细胞的分离和培养

目的寻求一种简单有效的分离培养大鼠触须毛乳头细胞的方法。方法将大鼠触须毛囊完整拔出后,在37℃缓慢搅拌的条件下加入0.2%胶原酶Ⅰ消化3h,间断吹打使毛乳头游离,收集上清低速离心(300r/min)后收集毛乳头进行培养,计算其贴壁率,检测α-平滑肌肌动蛋白表达。结果全毛囊消化法能显著降低工作强度,减少污染机会,具有毛乳头贴壁快和细胞迁出时间短的优点。α-平滑肌肌动蛋白染色阳性。结论全毛囊消化法是一种简单有效的分离培养大鼠触须毛乳头细胞的方法。