巢式MS-PCR法检测恶性血液病细胞株APC基因启动子甲基化状态

本研究旨在应用巢式甲基化特异性PCR（nMS—PCR）法检测10种恶性血液系统肿瘤细胞株APC基因启动子的甲基化状态,并探究其在肿瘤发生发展中的作用,同时筛选出APC基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,将其作为研究基因甲基化与表达关系的细胞模型。采用nMS—PCR扩增亚硫酸盐修饰后的10种肿瘤细胞株基因组DNA,检测其APC基因启动予区CpG岛的甲基化状态。结果表明,CA46、U266、Molt4、K562、HL-60、CEM、AKR、U937、Raji细胞的APC基因启动子区均未甲基化,而Jurkat细胞的APC基因启动子区出现甲基化。结论：用nMS—PCR可以准确地检测出恶性血液病细胞株APC基因的甲基化状态,该方法操作简便,可用于检测各种肿瘤细胞基因的甲基化状态。     

巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用

目的　介绍巢式甲基化特异性聚合酶链反应 (nMSP)法 ,探讨了最佳PCR扩增条件 ,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法　将基因组DNA变性成为单链 ,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA ,将所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶 ,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因特异引物 ,进行巢式聚合酶链反应扩增 ,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果　在 3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子甲基化。用甲基化特异性聚合酶链反应法 (MSP)和nMSP法分别检测 34例非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清 ,p16基因启动子甲基化阳性率分别为 5 3% (18/34)和 74 % (2 5 /34) ,nMSP法具有更高的灵敏度。结论　筑巢式甲基化特异性聚合酶链反应是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法 ,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。     

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应在胃癌p16基因甲基化检测中的应用

目的　改进甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,采用半巢式MSP检测胃癌组织p16基因启动子区CpG岛的甲基化状态。方法　用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后 ,采用半巢式MSP(引物分别为MS ,M1A和MS ,M2A) ,分析了 6 0例胃癌组织及相应正常组织中p16基因的甲基化状态。结果　单独用MSP ,胃癌组织中p16基因甲基化的发生率为 80 %。采用半巢式MSP ,甲基化发生率为86 7% ,比单独采用MSP提高了几个百分点 ,并提示胃癌病例的p16基因启动子区存在甲基化发生的不同模式。结论　半巢式MSP能够有效地提高灵敏度和减少假阳性。同时 ,免疫组化的结果也说明了p16基因异常甲基化与胃癌组织P16蛋白的表达密切相关。     

多发性骨髓瘤患者p16基因结构改变及启动子区甲基化的研究

目的探讨p16基因结构及启动子区CPG岛甲基化在多发性骨髓瘤(MM)发病中的作用.方法利用PCR-单链构象多态性、甲基化特异性PCR(MSP)技术研究骨髓瘤细胞株U266、LP1、KM3及MM患者p16基因结构改变及启动子区CPG岛甲基化状态.结果KM3细胞株为p16基因外显子2的同源缺失;U266、LP1细胞株及55.56%MM患者的p16基因启动子区存在CPG岛甲基化现象,p16基因甲基化与MM分期无关(P>0.05).结论p16基因甲基化在MM中较为常见,这可能为MM的治疗提供借鉴.     

恶性血液病细胞系分泌型卷曲相关蛋白基因启动子CpG岛甲基化状态的检测及意义

为了研究分泌型卷曲相关蛋白（secreted frizzled—related protein,SFRP）家族基因启动子CpG岛的甲基化状态,探讨SFRP基因启动子区CpG岛的异常甲基化状态与恶性血液病发病机制的可能联系,采用甲基化特异性PCR（Methylation—specificPCR,MSP）的方法检测了9种恶性血液病细胞系及正常人外周血单个核细胞中sFRP基因启动子区的甲基化状态。结果显示：9种恶性血液病细胞系中SFRP1、2基因启动子区均呈高甲基化状态,CA46、HL60和U937细胞中的SFRP4基因以及U266细胞中的SFRP5基因启动子区呈部分甲基化状态,其他细胞系SFRP4、5基因启动子均呈完全甲基化状态。正常人外周血单个核细胞中SFRP1、2,4、5基因启动子区均呈非甲基化状态。结论：SFRP基因启动子区异常甲基化模式与恶性血液病的发生密切相关。SFRP基因启动子区的甲基化状态有可能成为恶性血液病新的分子诊断标记物。     

急性白血病患者p15与p16基因甲基化检测及mRNA表达水平的定量分析

近年研究发现肿瘤细胞中存在DNA甲基化分布异常。即在肿瘤细胞中同时还存在基因组某些区域，特别是在一些抑癌基因的启动子区域高甲基化现象。抑癌基因启动子及转录起始区高甲基化可能也是导致抑癌基因失活和细胞恶性转化的机制之一。抑癌基因p15(CDK2B)和p16(CDK2A)均位于人类9号染色体短臂(9p21)，编码两种细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制性蛋白，参与细胞增殖与分化的调节。为探讨p15与p16在白血病细胞的甲基化状态及与表达水平的关系，我们应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术检测40例初诊急性白血病(AL)患p15和p16甲基化状态，同时用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-QPCR)技术检测p15和p16基因mRNA表达水平。     

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应对肿瘤细胞株p15基因甲基化或缺失状态的检测

本研究分析多种恶性肿瘤细胞株的p15基因甲基化或缺失状态,阐明p15基因甲基化或缺失在肿瘤发生发展中的作用。运用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应(hemi-nested methylation specific polymerase chain reaction,hn-MSP)分析20种恶性肿瘤细胞株和正常人单个核细胞或细胞株的p15基因甲基化及缺失状态,并评价该方法的敏感性和特异性。结果表明:在所有的细胞中,Molt-4、Raji、KG1、CA46、SW480、NCE、SMMC-7221、NCI-H446细胞为部分甲基化,hn-MSP检测p15基因甲基化敏感性可达到1×10-5。正常人单个核细胞、HL-60、HeLa、HepG2、293、SGC7901、U266、CEM细胞则为p15非甲基化,而K562、NB4、GMC、Jurkat似乎显现p15基因缺失或突变。结论:p15基因甲基化或缺失在多种肿瘤,特别在恶性血液病中有较高的发生率,且对疾病的进展及预后有密切的关系,hn-MSP具有较高的敏感性和特异性,值得在临床推广应用。     

急性白血病死亡相关蛋白激酶基因表达及启动子区甲基化状态研究简

本研究通过对急性白血病病人及体外肿瘤细胞株的DNA甲基化及基因表达的实验,探讨死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase,DAPK）基因在急性白血病中的表达情况及其启动子区域甲基化的状态,并分析两者之间的相关程度.应用RT-PCR检测DAPK基因在白血病细胞及正常骨髓细胞中的表达;用巢式甲基化特异性PCR（n-MSP）法检测急性白血病患者及细胞株DAPK基因启动子甲基化状况;从第二轮巢式MSP扩增出的随机产物中挑选2个随机引物,交予专业机构克隆后进行序列分析.结果表明：DAPK基因在10例正常对照者骨髓标本中均有表达,DAPKmRNA在急性白血病病人骨髓标本中表达平均值为0.61 ±0.40,低于正常对照者,差异有显著性（P＜0.05）,其中52.94％（9/17例）的急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本DAPKmRNA表达降低或缺失,急性髓系白血病病人数据为41.18％ （42/102）;细胞株U-937显示基因表达正常,HL-60表达缺失;102例急性髓系白血病病人骨髓标本中33例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为32.4％（33/102）;17例急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本中8例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为47％ （8/17）;7例正常人骨髓标本DAPK启动子区均为非甲基化;细胞株U-937 DAPK启动子区非甲基化,HL-60 DAPK启动子区甲基化.ALL组与AML组患者骨髓细胞DAPKmRNA表达与其启动子甲基化均呈显著负相关（ALL组r=-0.855,P＜0.05;AML组r=-0.343,P＜0.05）,提示两者有密切的关联.结论：急性白血病患者中DAPK基因启动区甲基化与其mRNA的异常表达或失表达有关.     

急性白血病LRP15基因启动子区甲基化及其表达分析

为了探讨LRP15基因在急性白血病（AL）患者中的表达情况及其与启动子区CpG岛甲基化的关系，采用甲基化特异PCR（MSP）方法检测AL患者LRP15基因启动子区甲基化状态，并用RT—PCR方法检测该基因在这些患者中的表达情况。结果发现，LRP15基因在缓解与非缓解状态白血病患者中的表达分别为47．6％和16．7％，其启动子区甲基化比例分别为38．1％和72．2％。LRP15基因的表达与其启动子区甲基化之间无相关（P=0．0087）。结论：AL患者LRP15基因启动子区的甲基化不完全是导致LRP15基因表达沉默的原因。     

巢式MSP法检测急性白血病患者P16基因甲基化状态

为了研究p16基因甲基化和缺失与急性白血病发病的关系,探讨其在成人急性白血病发生发展中的生物学意义,应用巢式甲基化特异性聚合酶链反应（nested methylation specific polymerase chain reaction,n-MSP）分析了82例各种亚型的急性白血病患者在初诊或复发不同阶段p16基因的甲基化和缺失状态,并且在基因组硫化修饰PCR后克隆测序验证结果的准确性。结果表明：82例急性白血病（AL）患者p16基因甲基化的出现率为39.0%,其中急性髓系白血病（AML）患者为41.4%,24例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者为33.3%;初治AL患者为36.6%,而复发患者则为54.5%。82例AL患者中有6例p16基因缺失,缺失率为7.3%,在AML、ALL患者中分别为1.7%和20.8%。16例健康自愿者或非恶性血液病患者p16基因则未发生甲基化或缺失。结论：在成人急性白血病的发生发展中,p16基因甲基化比p16基因纯合缺失更具有意义;p16基因表达异常与成人急性白血病的发生发展密切相关。     

结直肠癌患者p16基因甲基化的检测

目的检测p16基因启动子区异常甲基化发生情况,探讨p16基因异常甲基化作为结直肠癌临床辅助诊断分子生物学标志物的可能性。方法选取2004年5月至2004年12月第三军医大学西南医院及贵州省人民医院普外科住院的结直肠癌患者53例,所有患者均经病理学诊断证实,并按Dukes病理分期分为四期,提取肿瘤组织DNA,分别应用巢式甲基化特异性PCR(nested methylation specific polymerase chain reaction,nested-MSP)及甲基化特异性PCR(methylation specific polvmerase chain reaction,MSP)方法,检测患者肿瘤组织中p16基冈的异常甲基化情况;比较MSP及nested-MSP两方法的灵敏度。结果应用MSP方法,Dukes A、B期患者和Dukes C、D期患者p16基因的甲基化率分别为23.8%和59.4%,两组比较有显著性差异(P<0.05);应用nested-MSP方法,Dukes A、B期患者和Dukes C、D期患者p16基因的甲基化率分别为52.4%和84.4%,两组比较有显著性差异(P<0.05)。应用MSP与nested-MSP方法检测肿瘤组织p16基因甲基化的阳性率分别为45.3%(24/53)、71.7%(38/53),两组比较有显著性差异(P<0.01)。结论应用nested-MSP方法检测肿瘤组织p16基因甲基化的灵敏度明显高于普通的MSP方法,分析患者DNA的p16基因异常甲基化有可能成为结直肠癌辅助诊断及预后评估的有效方法之一。     

银屑病患者骨髓CFU-HPP集落形成及集落细胞p16基因启动子甲基化的研究

本研究检测银屑病患者骨髓高增殖潜能集落形成单位（CFU-HPP）的集落形成能力及集落细胞p16基因启动子甲基化状态,并探讨两者之间的关系。收集了24例银屑病患者及正常对照者骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,并于含SCF/GM-CSF/IL-3/IL-6细胞因子组合的甲基纤维素半固体培养液中,培养14天计数CFU-HPP集落,然后收集集落。提取纯化集落细胞的DNA,经亚硫酸盐修饰后,采用甲基化特异PCR（MSP）检测CFU-HPP集落细胞的p16基因启动子甲基化状态。结果发现：在甲基纤维素半固体培养基中,银屑病患者骨髓CFU-HPP集落数显著低于正常对照（t=5.91,p〈0.01）,且集落形态较小;正常对照骨髓CFU-HPP集落细胞的p16基因启动子甲基化阳性率较高（66.7%）,而银屑病患者骨髓CFU-HPP集落细胞p16基因启动子甲基化阳性率（37.5%）低于正常人。结论：银屑病患者骨髓CFU-HPP细胞集落形成能力降低;银屑病患者骨髓CFU-HPP集落细胞的p16基因甲基化降低可能与其相对较低的CFU-HPP集落形成能力密切相关。     

恶性血液病细胞株中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的初探

本研究探讨基因IEX-1启动子区CpG岛甲基化状态的改变及其与恶性血液病发生的相关性.应用MSP的方法检测9种恶性血液病细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态,并把经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阳性对照,把正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阴性对照.结果显示:在NB4、Molt4.、Raji细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈高甲基化状态;在CA46、CEM、U937、K562、HL-60、Jurkat细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈部分甲基化状态;在正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子区CpG岛呈非甲基化状态;经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子CpG岛呈高甲基化状态.结论:IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的改变与恶性血液病有一定的相关性.     

Runx3基因在肝细胞癌中甲基化状态分析及临床意义

目的通过检测肝细胞癌组织中Runx3基因启动子区域甲基化状态,探讨Runx3基因启动子区域异常甲基化在肝细胞癌发生、发展过程中的临床意义。方法采用DNA甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）（MSP）技术对81例肝细胞癌患者肿瘤组织及其癌旁正常组织Runx3基因启动子区域甲基化状态进行检测。结果在肝细胞癌组织中,Runx3基因启动子区域甲基化率占43．2％（35／81）,而在相对应的癌旁正常组织中,Runx3基因启动子区域仅发现1例异常甲基化现象,其甲基化率占1．2％（1／81）（P〈0．01）;Runx3基因启动子区域甲基化状态与临床病理参数的关系差异均无统计学意义。结论Runx3基因启动子区域甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一,与肝细胞癌发生早期密切相关,可作为肝细胞癌早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点。     

runx3启动子区域甲基化在急性白血病中意义的初步研究

为了探讨runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病发病机制中的作用及其临床意义，采用甲基化特异性PCR（MS—PCR）检测CHRF、U937、K562细胞系及40例急性白血病患者和10例正常人骨髓或外周血runx3基因启动子区域的甲基化情况，并用RT—PCR方法检测各系runx3基因的表达情况。结果发现，健康人及细胞系中均未检测到甲基化。而检测到该基因的表达；40例急性白血病患者甲基化检测阳性率35％（14／40），明显高于正常人0％，差异有统计学意义（P〈0．05），其中AML30．43％（7／23），ALL41．18％（7／17），P〉0．25，两者无明显差异。甲基化检测阳性患者均未检测到runx3基因的表达。存在runx3启动子区域甲基化患者化疗前骨髓原始细胞数均高于runx3启动子区域未甲基化患者（P〈0．01），而且首次化疗后完全缓解率低于未甲基化者（P〈0．05），差异有显著性。结论：runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病的发病机制中起一定的作用，其检测对估计白血病预后具有临床意义。     

痰标本p16基因启动子区甲基化联合血清细胞角蛋白19片段和癌抗原15-3对非小细胞肺癌的诊断价值

目的 评价痰液标本中p16基因启动子区甲基化联合血清中细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment,CYFRA 21-1)和癌抗原15-3(CA15-3)的检测对非小细胞肺癌(NSCLC)的诊断价值.方法 用巢式甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测100例NSCLC患者痰液p16基因启动子区甲基化联合化学发光法检测患者血清中CYFRA21-1和CA15-3的水平,评价3种肿瘤标志物联合检测对NSCLC的诊断价值.结果 NSCLC患者痰液中p16基因启动子区甲基化阳性率为61.0%;NZCLC患者血清中CYFRA21-1和CA15-3的实验敏感度分别为58.0%和38.0%;联合检测可明显提高NSCLC的检出率,敏感度79.0%,明显高于各种肿瘤标志物单项检测.结论 痰液标本中p16基因启动子区甲基化联合血清中CYFRA21-1和CA15-3的检测可明显提高NSCLC的检出率,为早期诊断NSCLC提供了依据.     

Dickkopf-1基因在宫颈鳞癌组织中的甲基化研究

目的检测Dickkopf-1(DKK1)基因在宫颈鳞癌组织中的甲基化状态,分析其临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测28例宫颈炎、20例CINⅠ、31例CINⅡ~Ⅲ及36例宫颈鳞癌组织中DKK1基因启动子区甲基化情况,并分析宫颈鳞癌组织中DKK1基因甲基化水平与临床病理特征之间的相关性。结果宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ~Ⅲ和宫颈鳞癌组中DKK1基因甲基化阳性率分别为10.7%、10%、32.3%和44.4%。宫颈鳞癌组织的甲基化阳性率明显高于宫颈炎和CINⅠ组,DKK1基因启动子甲基化与肿瘤分化程度以及肿瘤的直径相关。结论 DKK1基因启动子区甲基化检测可能为宫颈鳞癌的诊断以及鉴别诊断提供一个新的检查方法。     

急性髓系白血病患者dapk基因启动子甲基化改变的研究

本研究旨在分析中国人群急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者死亡相关蛋白激酶(deathassociated protein kinase,DAPK)基因启动子的甲基化状况及其临床相关性。应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术对112例AML患者骨髓标本dapk基因甲基化状态进行检测。结果表明:13例对照组均未发生dapk基因启动子甲基化,而112例AML患者中82例(73.2%)发生dapk基因甲基化,dapk基因甲基化改变与患者的性别、年龄、白细胞、血红蛋白、血小板计数、AML分型以及染色体异常等结果均无相关性(p0.05)。结论:dapk基因甲基化是AML中的一个常见分子事件。