腺相关病毒介导癌胚抗原转染树突状细胞对免疫功能的调节作用

目的:近年来,树突状细胞参与调节作用的研究较多。实验拟验证重组腺相关病毒(rAAV)介导癌胚抗原基因转染树突状细胞后其的免疫调节作用的变化。方法:实验于2006-06/2006-11在美国阿肯色大学医学院基因治疗中心完成。①实验方法:取健康人外周血(自愿捐献),采用改良Ficoll密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞,取贴壁细胞,分为rAAV/CEA转染组和空白对照组,均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、肿瘤坏死因子-α诱导树突状细胞前体细胞成熟,将成熟树突状细胞与末梢血淋巴细胞按比例混合培养,可得到激活的细胞毒性T淋巴细胞。②实验评估:采用流式细胞仪检测树突状细胞表面标志表达,细胞毒性T淋巴细胞的免疫表型变化,细胞毒性T淋巴细胞γ-干扰素表达。采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测树突状细胞的白细胞介素12和白细胞介素10表达。结果:①rAAV/CEA转染树突状细胞的CD14较空白对照组降低,共刺激分子CD40、CD80、CD83、CD86表达均较空白对照组高。②成熟树突状细胞细胞因子表达中,rAAV/CEA转染组的白细胞介素12较空白对照组升高,白细胞介素10降低。③与空白对照组比较,rAAV/CEA转染组能高表达CD8 T细胞和其表型CD69,CD8/CD56的T细胞比例上调,CD25 CD4 的T细胞减少。④rAAV/CEA转染的细胞毒性T淋巴细胞表达相对较高水平的γ-干扰素,与杀伤实验结果相吻合。结论:rAAV/CEA转染树突状细胞能够激活细胞毒性T淋巴细胞的特异性杀伤作用,与树突状细胞和细胞毒性T淋巴细胞等免疫细胞表面标志变化和细胞内细胞因子水平变化相关。     

CMVpp65基因修饰的树突状细胞刺激自身T细胞活化

巨细胞病毒（CMV）感染易发生于慢性移植物抗宿主病（cGVHD）患者，其特异性免疫依赖于T细胞活性。本研究探讨CMVpp65基因修饰的树突状细胞（DC）对自身T细胞的活化作用。采用具有高效转染非分裂细胞的慢病毒系统将CMV全长pp65基因导入鼠源性DC；采用CpG—DNA诱导DC细胞成熟；采用流式细胞术及免疫荧光方法测定T淋巴细胞抗原及IFNγ表达。结果表明：慢病毒感染DC的感染复数（multiplicity of infection，MOI）为50，最佳感染效率可达30％-40％；表达pp65基因的成熟DC能刺激自身naiveT细胞表达CD69；表达PP65蛋白的成熟DC能够刺激自身CD4^＋或CD8^＋T细胞分泌IFNγ。结论：pp65基因修饰、CpG—DNA诱导成熟的DC能体外激活CMV特异性T淋巴细胞。     

丙肝病毒siRNA表达载体构建及抗病毒作用研究

目的进行丙型肝炎病毒（HCV）RNA干扰（RNA interference RNAi）作用研究。方法本实验选择HCV NS3基因片段作为靶序列,合成含有靶序列的DNA片段并克隆到pGCsi-U6/Neo/GFP/siNeGative载体中,构建可表达具有发夹结构双链siRNA的真核表达质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/A,并转染Hela细胞,用HCV攻击该细胞,通过TCID50和HCV负链RT-PCR检测该载体对HCV感染细胞的保护效果。结果通过测序及荧光显微镜观察证明载体构建成功,实验组TCID50明显高于对照组,且RT-PCR结果显示pGCsi-U6/Neo/GFP/A转染组的HCV负链RNA表达量显著低于对照组。结论证实重组质粒表达产物能成功地使模型细胞中的HCV NS3基因沉默,并间接抑制了病毒的复制,本实验的成功无疑为HCV的治疗及蛋白功能的研究打下坚实的基础。     

小鼠白细胞免疫球蛋白样受体2干扰RNA对树突状细胞表面CD11c、CD80和CD86的影响及意义

目的探讨小鼠树突状细胞(DC)表面白细胞免疫球蛋白样受体2(LILRB2)改变对DC的CD11c、CD80和CD86表型的影响及意义。方法应用20 ng/ml重组小鼠粒细胞集落刺激因子(r GM-CSF)+20 ng/ml IL-4刺激小鼠骨髓细胞生长,隔日进行细胞换液,第5天实验组转染LILRB2受体干扰RNA,空白对照组转染空质粒,对照组单纯换液。培养过程中观察细胞形态学变化,并于转染72 h后,光镜下观察DC形态,用流式细胞仪测定细胞表面CD11c、CD80和CD86分子表达。结果光镜下对照组与实验组均可见DC细胞形态,流式细胞仪测定实验组CD11c(0.662±0.174)(n=12)与空白对照组CD11c(0.675±0.237)和对照组(0.688±0.076)分子表达无明显差异(P>0.05)。实验组DC细胞表面CD80(0.626±0.060)较空白对照组CD80(0.406±0.163)(n=12)和对照组CD80(0.409±0.100)表达均增加(P<0.05)。实验组DC细胞表面CD86(0.730±0.102)较空白对照组CD86(0.497±0.278)和对照组CD86(0.368±0.073)表达均增加(P<0.05)。结论应用LILRB2受体干扰RNA不影响DC细胞表面CD11c分子表达,而增加细胞表面CD80和CD86分子表达。细胞表面CD80和CD86分子作为免疫反应的重要协同刺激分子在抗原提呈细胞表面表达升高,则激活T细胞免疫反应的能力增强。     

脂质体介导HBcAg基因转染人树突状细胞的实验研究

目的通过脂质体介导乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因转染人体内专职抗原提呈的树突状细胞(DC)的方法,使HBcAg基因在树突状细胞中表达,构建树突状细胞疫苗。方法分离健康人外周血单个核细胞,在粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)的诱导下培养DC。在培养的第5天,应用脂质体PEI介导将含有编码HBcAg 基因的质粒(pJW4303／HBc)转染入DC,再以免疫印迹技术(Western-Blotting)验证其表达产物。结果经以质粒pJW4303 为真核表达载体的HBcAg目的基因转染后的树突状细胞有效表达了HBcAg抗原。结论经该方法转染后的DC目的基因可有效表达HBcAg,为以DC为基础的免疫治疗奠定了新的基础。     

MHC五聚体方法检测基因疫苗体外诱导的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞

目的 探讨MHC五聚体方法检测在体外用抗B细胞淋巴瘤基因疫苗(简称基因疫苗)刺激PBMC生成抗原特异性CTL的效率.方法 用于细胞培养的4份血液标本来自2例B淋巴细胞肿瘤患者(1例为滤泡性淋巴瘤患者,另1例为毛细胞白血病患者)和2名健康对照者.分别检测上述标本中PBMC受基因疫苗刺激后CTL生成情况.PBMC贴壁培养获得DC前体,在重组细胞因子GM-CSF和IL4的支持下诱导培养DC,采用基因枪方法将基因疫苗质粒导入DC,RT-PCB方法检测转染后细胞IgHV1-GM-CSF mRNA的转录,ELISA方法检测细胞因子GM-CSF的表达,并验证转染是否获得有效表达.转染后的DC再与从PBMC中获得的淋巴细胞共培养,诱导抗原特异性的CTL;共进行2次DC刺激,共计培养24 d,分别在培养前、培养第7天、第17天及第24天收获培养细胞,培养分为转染基因疫苗组和转染对照质粒组,流式细胞术分析培养细胞中CD3+ CD8+细胞亚群的水平;用针对基因疫苗抗原肽抗原表位的MHC五聚体荧光抗体检测CTL产生水平.结果 基因枪颗粒轰击方法转染DC后,RT-PCR结果显示转染得到了表达;转染基因疫苗组的DC中GM-CSF含量为(28±6)ng/106个细胞,而转染对照质粒组的DC中GM-CSF含量为(10±3)ng/106个细胞,差异有统计学意义(t=5.191,P<0.01).分析培养后的T淋巴细胞亚群,显示随着培养时间的延长,CD3+CD8+细胞亚群比例明显增加,转染对照质粒组在培养前、培养第7天、第17天和第24天的比例分别为(34.24±2.72)%,(46.06±3.08)%,(65.34±4.26)%,(73.86±4.85)%,而在转染基因疫苗组,其比例分别为(32.28±2.08)%,(45.32±3.81)%,(63.37±4.21)%,(75.01±3.20)%.两因素方差分析显示培养不同时间点的CD3+CD8+细胞亚群比例差异有统计学意义(F培养时间=176.966,P<0.01),但转染因素本身对其产生的影响差异无统计学意义(F转染因素=0.657,P>0.05).MHC五聚体检测结果显示转染基因疫苗组的DC能够诱导针对该表位的抗原特异性CTL产生,CTL水平随着DC的刺激逐渐增高;在培养第24天,健康对照者最高获得2.03%的CTL,滤泡性淋巴瘤患者的CTL达4.36%,而毛细胞白血病患者为3.89%.结论 MHC五聚体方法能够有效检测基因疫苗诱导的抗原特异性CTL;该方法对于抗肿瘤细胞免疫的检测、肿瘤患者的细胞免疫状态及早期预后判定可能是一项有前景的临床检验方法.     

负载HPV16E6基因树突状细胞疫苗的构建

目的以阳离子脂质体为载体,构建载入人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16E6)基因树突状细胞(DC)疫苗,研究其安全性及转染效率。方法将pcDNA3.1-HPV16E6质粒与阳离子脂质体混合形成复合物后转染树突状细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪及免疫细胞化学检测基因表达效率。结果转染后的DC可见胞浆内颗粒增多,胞质突起增加,细胞生长良好。免疫细胞化学、流式细胞仪结果DC转染率49.8%。结论阳离子脂质体可用于DC疫苗构建,具有高效性及安全性。     

含癌胚抗原片段的重组腺相关病毒转染树突状细胞疫苗的体外杀伤作用

目的：观察研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）转染含癌胚抗原（CEA）片段的重组腺相关病毒后所诱导的特异性T细胞对直肠癌细胞株LOVO和SW480的体外杀伤作用。方法：抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血，分离单核细胞，体外培养，使用含CEA片断的重组腺相关病毒转染未成熟DC，诱导特异性T细胞。检测体外培养的DC和CTL活性，并使用MTT法检测细胞毒性T细胞（CTL）对LOVO细胞的杀伤作用。结果：转染或未转染的体外培养的成熟DC高表达CD40、CD86、IL-12，诱导的细胞毒性T细胞高表达IFN-γ；转染后DC诱导特异性细胞毒性T细胞可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LOVO细胞。结论：重组腺相关病毒转染DC，不明显改变DC表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能，可诱导自体细胞毒性T细胞增殖，含CEA片断的腺相关病毒转染DC诱导自体细胞毒性T细胞对LOVO细胞有明显杀伤作用，DC疫苗可以作为直肠癌患者免疫治疗的有效补充。     

嵌合抗原受体设计的NK细胞在多发性骨髓瘤中的应用研究

目的:通过建立CAR(CD138-CD28-CD3ζ)-NK细胞,探讨CAR(CD138-CD28-CD3ζ)-NK细胞对多发性骨髓瘤的抗肿瘤作用。方法:把抗CD138scFv-CD28-CD3连接到pc DNA3.1质粒,使用三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞,收集病毒后感染NK92MI细胞系,应用嘌呤霉素筛选阳性细胞株;通过RT-PCR及Western blot检测CAR在NK92MI细胞系的表达,流式细胞术检测NK92MI细胞分泌细胞因子cd107a的能力。结果:经过基因工程技术,体外构建了CAR基因片段,基因测序验证基因序列正确。通过病毒包装技术,获得表达该片段的病毒株。经过病毒转染实验,获得表达CAR融合蛋白的稳转NK细胞株。PCR及Western blot证实,CAR融合蛋白在NK细胞表达。细胞杀伤实验证实CARNK细胞分泌细胞因子cd107a的能力明显优于对照组,具有明显的杀伤多发性骨髓瘤细胞的效应。结论:CAR能在体外构建并在NK92细胞表面表达,CARNK细胞能杀伤表达CD138抗原的多发性骨髓瘤细胞株,从而发挥抗骨髓瘤效应。     

急性呼吸综合征患者外周血树突状细胞表型和功能的变化

目的 探讨严重急性呼吸综合征病毒(SARSV)感染对树突状细胞(DC)表型和功能的影响。方法 采用流式细胞仪检测SARS发病期患者(9例)和正常人(7例)DC的表型；分离培养DC和T淋巴细胞，用混合淋巴细胞反应检测SARS患者和正常人DC对T淋巴细胞增殖的诱导作用。结果 SARSV感染抑制了DC类刺激分子CD80、CD86和HLAⅡ类分子HLA—DR以及与DC成熟有关的分子CD83的表达；抑制DC诱导T淋巴细胞增殖的能力。结论 SARSV可抑制DC的分化成熟和抗原递能力。     

重组9型腺相关病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞

背景：重组9型腺相关病毒对心肌细胞具有良好的亲和力,是目前研究基因治疗心肌梗死的理想载体。目的：观察携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒（r AAV9-e GFP）对小鼠骨髓间充质干细胞的转染效率。方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒以不同感染复数（1×105,1×106,1×107）转染体外培养的第4代小鼠骨髓间充质干细胞,并在转染后1-7 d连续用荧光倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞中增强型绿色荧光蛋白阳性表达情况,寻找最佳感染条件;采用流式细胞仪检测最佳感染复数下携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒对小鼠骨髓间充质干细胞的转染效率。结果与结论：转染后第1天,感染复数为1×107组可见增强型绿色荧光蛋白开始表达,转染后第2天,感染复数为1×105、1×106组开始表达;各组增强型绿色荧光蛋白表达强度随感染复数值的增高而增强,同时增强型绿色荧光蛋白的表达强度随着时间延长而逐渐增强;转染后第5天达到高峰,此时感染复数为1×107组转染效率约8%,结果表明携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒对小鼠骨髓间充质干细胞转染效率较低。     

负载HPV18E7基因脐带血树突状细胞的体外抗食管癌研究

目的制备人脐带血CD34^＋造血干细胞来源的负载HPV18E7基因的树突状细胞（DC）疫苗,并观察其在体外对人食管癌细胞的杀伤活性。方法采用微磁珠分选系统（MiniMACS）从脐带血单个核细胞中分离CD34干细胞,以重组人粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子（rh—GM-CSF）和重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）各200ng／ml和100U／ml诱导其向DC分化,采用阳离子脂质体DMRIE-C介导HPV18E7基因进入DC,制备DC疫苗。倒置相差显微镜下观察DC的生长情况和形态变化;流式细胞仪检测疫苗表面目的基因E7蛋白的表达情况;MTY法检测DC疫苗致敏的同种异体外周血T淋巴细胞在体外对表达HPV18E7的食管癌细胞EC-109的杀伤活性。结果脐带血CD34^＋干细胞在细胞因子诱导下,细胞体积增大,形状由圆形变得不规则形,细胞数量增多,形成细胞集落。经过14d的培养,大部分的细胞从集落上脱落下来成为成熟的DC,具有典型的树枝状突起。E7蛋白的阳性表达率为47．5％,说明基因转染成功。DC疫苗致敏的淋巴细胞在体外对EC-109细胞的杀伤活性明显强于未转基因DC致敏的淋巴细胞组、T淋巴细胞组和对照组（P〈0．01）,且随效靶比的增高而增强（P〈0．05）。结论人脐带血干细胞在细胞因子的诱导下能扩增分化为DC,经肿瘤相关病毒抗原基因转染获得的DC疫苗,高表达目的基因蛋白,并能显著增强淋巴细胞对相应人食管癌细胞的体外杀伤效应。     

腺相关病毒2／1型载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究探讨重组腺相关病毒2／1型（recombinantadeno—associatedvirus2／1,rAAV2／1）作为载体在不同转染复数、不同时间点转染大鼠骨髓间充质干细胞（bonemalTOWmesenchymalstemcells,BMMSC）的效率及对其生长的影响。用含有增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）报告基因的rAAV2／1（rAAV2／1-EGFP）,以感染复数（multiplicityofinfection,MOI）分别为1×10^4、1×10^5、1×10^6转染体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞,在3、7、14天时荧光显微镜下观察EGFP的表达,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况．以评估rAAV2／1对BMMSC存活、增殖、分化能力的影响。应用流式细胞仪检测rAAV2／1-EGFP对BMMsC的转染效率及荧光指数（fluorescenceindexnumber,FU。结果表明：转染24小时后即可观察到BMMSC发出的绿色荧光,荧光强弱不一,随着时间的延长,荧光的强度逐渐增强,7天后达到稳定的状态;在3、7、14天时不同MOIrAAV2／1-EGFP转染BMMSC的活力、增殖倍数、分化能力无明显变化（P〉0．05）;在同一感染复数时,7天比3天和14天比7天的增殖倍数显著增强（P〈0．01）。流式细胞仪检测显示,rAAV2／1-EGFP转染BMMSC的转染率和荧光指数随着MOI增加（1×10^4、1×10^5、1×10^6）和培养时间（3、7、14天）的延长而有不同程度的增加（P〈0．05）。结论：rAAV2／1-EGFP能有效地转染BMMSC,随转染复数的增加和短期内随转染时间的延长,转染率和荧光指数明显增加。在转染过程中rAAV2／1-EGFP对细胞的活力、生长无影响。对于改造BMMSC,rAAV2／1是一种有效的基因转移载体。     

丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定研究

目的构建含丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体,为C蛋白与宿主蛋白相互作用机制研究奠定基础。方法聚合酶链反应(PCR)法扩增HCV 1b基因型C蛋白基因,经EcoR I和Pst I双酶切后插入到诱饵载体pGBKT7中,构建含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Core,经酶切分析及核酸测序分析加以鉴定。醋酸锂法将pGBKT7-Core转化入酵母菌株Y2HGold,蛋白印迹法检测C蛋白的表达,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性作用及对报告基因的激活作用。结果重组质粒pGBKT7-Core中的C蛋白基因为576 bp,经核酸测序分析与NCBI中注册的HCV 1b基因型C蛋白基因序列一致;转化酵母菌后检测到C蛋白的表达;HCV C蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性,且对报告基因无激活作用。结论含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体构建成功,表达稳定。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的实验

背景:以骨髓间充质干细胞作为种子细胞,把干细胞和基因治疗结合起来是研究中枢神经系统损伤和肿瘤治疗新的思路和趋势.目的:观察腺病毒载体绿色荧光蛋白基因(Ad-GFP)在兔骨髓问充质干细胞转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰骨髓间充质干细胞的可行性.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-08/2009-03在南方医科大学完成.材料:新西兰大白兔,雌雄不拘,质量2.0-3.0 kg.方法:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad.GFP(1×10~3～1×10~(10)PFU/mL)转染骨髓间充质干细胞,细胞计数法分析转染率.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导感染Ad-GFPBMSCs向神经样细胞的定向分化.结果:3-6代骨髓间充质干细胞表面标志CD34、CD45阴性,而CD29、CD44阳性.当病毒滴度为1×10~7PFU/mL时感染率为55%,1×10~9,1 ×10~(10)PFU/mL感染率均为85%,但1×10~(10)PFU/mL时出现细胞病理现象,7 d荧光表达最强,28 d仍可见荧光表达.感染Ad-GFP的骨髓间充质干细胞经β-巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶表达阳性.结论:合适滴度的Ad-GFP可以高效感染骨髓间充质干细胞,对细胞的生物学特性影响较小,不影响诱导分化功能,骨髓间充质干细胞可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞.     

Production of recombinant adeno-associated virus vectors using a packaging cell line and a hybrid recombinant adenovirus.

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors are under consideration for a wide variety of gene therapy applications. One of the limitations of the rAAV vector system has been the difficulty in producing the vector in sufficient quantity for adequate preclinical and clinical evaluation. A common method for vector production involves large-scale transient transfection of multiple plasmids into cultured cells. Because this approach might not be feasible for clinical scale manufacturing, we have sought approaches for rAAV vector production that avoid transient transfection procedures. In previously reported work, we generated an AAV packaging cell line that produces infectious rAAV when the vector genome is transfected into the cell line as plasmid DNA. We have now extended this approach by constructing a hybrid recombinant adenovirus (rAd) that contains a complete rAAV vector genome in the E1 region. This hybrid virus is used to deliver the rAAV genome to the packaging cell line (in the place of plasmid transfection). rAAV is produced when the packaging cell line is infected with the hybrid adenovirus and wild-type adenovirus. This method avoids the need for plasmid transfection and is adaptable to large-scale manufacturing processes.     

Lipofectamine介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷.胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应.目的:观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达.设计、时间及地点:细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成.材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18-20 g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养.连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供.Lipofectamine~(TM)2000脂质体为Invitrogen产品.方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行Xhol和BamHI双酶切,用于转染.取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine~(TM)2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48 h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达.结果:质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5 kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度.流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性.plRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强.结论:脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值.     

HPV-16 E7负载的DC-CIK对宫颈癌细胞的杀伤效应研究

目的研究HPV-16 E7抗原肽负载的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞共培养Ag-DC-CIK对人宫颈癌细胞siha的杀伤效应。方法采集健康人外周血,分离提取单个核细胞(PBMC),分别诱导生成DC和CIK细胞,观察细胞形态,流式细胞仪检测DC摄取能力及其表面分子CD83、CD86和CIK细胞CD3、CD8、CD56的表达。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)的水平。实验分为5组:效应细胞CIK、DC-CIK、Ag^1-DC-CIK、Ag^2-DC-CIK、Ag^M-DC-CIK,分别与靶细胞siha共培养,细胞计数试剂盒(CCK8)法检测效应细胞对siha活性的影响,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测效应细胞对siha的杀伤效应。结果DC成熟后,摄取能力减弱,CD86、CD83表达上调,上清液中IL-12水平增高;与DC共培养的CIK细胞,CD3^+CD8^+、CD3^+CD56^+细胞比例提高,分泌IFN-γ能力增强;与CIK细胞、DC-CIK组相比,Ag^1-DC-CIK、Ag^2-DC-CIK、Ag^M-DC-CIK组均表现出对siha细胞更强的杀伤效应。结论成功构建Ag-DC-CIK共培养体系,获得两组有效的HPV-16 E7蛋白抗原肽,为治疗宫颈癌提供了新思路。     

丙肝核心抗原-CD40L胞外段真核表达载体的构建及其免疫原性分析

目的构建丙肝核心抗原-CD40L胞外段融合蛋白真核表达载体,并探讨其免疫原性。方法应用基因重组技术在原有载体的基础上构建真核表达载体pcDNA3.1-core-CD40L并加以鉴定。该表达质粒肌肉内注射免疫小鼠,ELISA法检测小鼠外周血中抗丙肝核心抗体,流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚型,real time PCR法检测外周血单个核细胞内细胞因子,CTL杀伤实验检测小鼠脾淋巴细胞的杀伤活性。结果构建了真核表达载体pcD-NA3.1-core-CD40L,该载体能诱发小鼠产生高滴度的抗丙肝核心抗原的抗体,流式和real time结果证实该质粒能诱使小鼠T淋巴细胞由T0期向Th1和Th2转换,并以Th1为主,CTL杀伤结果显示该表达质粒能诱使小鼠产生高水平的细胞杀伤能力。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-core-CD40L,该质粒能够在小鼠体内正确表达,并能诱发高水平的细胞杀伤活性。