人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测

目的 构建肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒，为进一步研究其相互作用蛋白奠定基础。方法 将人肝再生增强因子的编码序列重组入pGBKT载体中，经酶切及序列分析鉴定构建正确后，转化酵母AHl09菌株，转化子在SD／-His／-Trp选择培养基上培养；滤纸法β-半乳糖苷酶活性测定；Westem blot检测目的蛋白表达情况。结果 正确地构建了人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-hALR，其酵母AHl09转化菌在SD／-Trp培养基上30℃培养65h，长出φlmm菌落，而在SD／-Trp-His培养基上不生长，β-半乳糖苷酶活性检测呈阴性。Westem blot结果显示目的蛋白以35KD的融合蛋白形式表达。结论 诱饵质粒pGBKT7-hALR对宿主菌AHl09没有毒性作用，能稳定表达目的蛋白，不能自身激活报告基因，可用于酵母双杂交的筛选工作。     

人TLR2胞外区基因酵母表达载体的构建及表达研究

目的在真核生物酵母细胞中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因。方法以重组质粒pAdTrack-TLR2为模板,应用PCR方法扩增TLR2胞外区基因,克隆到pMD18-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母菌Y187,测定其在Y187中的自激活现象及毒性,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果成功扩增出TLR2胞外区基因,测序结果与GenBank中序列一致。酶切回收的目的基因成功克隆入酵母表达载体pGBKT7中并转化酵母菌Y187后证实无重组质粒的自激活作用,Western blot分析显示该基因在酵母细胞中表达。结论成功构建了TLR2胞外区基因的酵母表达载体,并在酵母细胞Y187中正确表达,为后续研究奠定了基础。     

人胰腺细胞cDNA 文库中丙型肝炎病毒NS4B 结合蛋白基因的筛选

目的 从人胰腺细胞cDNA 文库中,采用酵母双杂交方法 筛选HCV NS4B 包膜蛋白的相互作用蛋白.方法 人胰腺细胞cDNA 文库先进行扩增,随后纯化及鉴定,然后将鉴定好的人胰腺细胞cDNA 文库质粒转化入酵母菌株Y187.构建pGBKT7-NS4B 作为诱饵质粒,随之转化酵母菌株AH109,用色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109 与Y187,用四缺培养基及X-α-gal 筛选蓝色酵母菌落,提取相应质粒,电转化感受态菌DH5α后再提取质粒,测序仪测序,结果 使用PUBMED 进行序列比对.结果 成功构建pGBKT7-HCV NS4B 重组质粒,并从人胰腺cDNA 文库中筛选出7 种与HCV NS4B 蛋白相结合的蛋白基因,包括CDK5RAP3、辅脂肪酶、胰石蛋白、凝乳蛋白、弹性蛋白酶2A、糜蛋白酶和胆盐刺激酯酶.结论 HCV NS4B 蛋白可能通过与所筛选出前述蛋白中参与代谢过程的相关蛋白结合,影响糖、脂类代谢过程.     

酵母双杂交系统3筛选人源核不均一核糖核蛋白E1的功能伙伴

背景:酵母双杂交系统3是目前最常用的筛选相互作用蛋白质的技术平台.目的:运用酵母双杂交系统3筛选人源核不均一核糖核蛋白E1的相互作用子.方法:构建酵母细胞表达载体hnRNP E1-pGBKT7/c-myc,转化酵母菌AH109,Western blot证实蛋白表达,进行毒性和自激活检验,与转化了cDNA文库的酵母菌Y187接合,经过营养删除、滤膜反应以及回交试验筛选酵母文库中与hnRNP E1相互作用的蛋白.结果与结论:hnRNP E1蛋白能在酵母中正常表达,对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象.经缺陷培养基3次传代及滤膜反应初步筛选出了16个候选基因,再经NCBI基因比对(BLASTN和BLASTP)及酵母细胞中的免疫沉淀反应最终获得了8个候选蛋白.提示hnRNP E1可能参与特定细胞内的复制,转录,mRNA运输、细胞周期、细胞自噬及免疫应答的过程,并且可能参与某些遗传病的发病过程.     

核仁素的蛋白质-RNA杂交体系诱饵载体的构建及表达

[目的]将核仁素开放阅读框构建到Hybrid Hunter蛋白质-RNA杂交系统pYESTrp3"饵"载体,明确其在酵母细胞中的表达,排除自身激活作用,验证其能否用于蛋白质-RNA杂交体系筛选cDNA文库.[方法]设计引物,从真核表达载体pEGFP-N1-C23上,扩增出C23开放阅读框,经EcoR I和Not I双酶切后,克隆到蛋白质-RNA杂交的"饵"载体pYESTrp3质粒上,构建成载体pYESTrp3-C23.阳性克隆经EcoRI和Not I双酶切鉴定后,转入酵母中,用酵母蛋白抽提物作Western杂交,证实其表达;滤膜印记杂交验证其有无自身激活作用.[结果]所构建的载体pYESTrp3-C23双酶切后,片段大小正确;转入酵母菌L40-ura3/pHybLex/Zeo-MS2后,提取酵母质粒,PCR扩增出预期大小的片段,Western杂交出现阳性条带;滤膜杂交,转有pYESTrp3-C23和阴性对照pYESTrp3的酵母菌落没有激活报告基因,而GAL4全长的阳性对照菌落变为蓝色.[结论]含有C23的"饵"载体构建正确,在酵母细胞中能表达出C23蛋白,并且没有自身激活报告基因的功能,能够应用于蛋白质-RNA杂交体系.     

酵母双杂交系统筛选和验证与RARα-V相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术筛选与RARα-V相互作用的蛋白,研究RARα-V的作用靶点及其生物学功能.方法 构建诱饵质粒pGBKT7-RARα-V,利用酵母双杂交技术从K562细胞cDNA文库中筛选与RARα-V相互作用蛋白的基因序列,并通过酵母回转试验与GST pull-down技术进行验证.结果 成功构建诱饵质粒,且没有毒性、渗漏和自激活现象;利用酵母双杂交技术筛选到16个能与RARα-V相互作用的蛋白质;经酵母回转试验得到8个阳性克隆;并经GST pull-down技术在体外验证了RARα-V与JTV-1蛋白的相互作用.结论 在细胞内RARα-V与多种蛋白有相互作用,白血病的发病机制可能与这些蛋白相互作用所致的生物学功能改变有关.     

NS3TP2蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP2蛋白的功能,在真核生物酵母细胞中表达NS3TP2蛋白基因。方法用多聚酶链反应(PCR)的方法扩增NS3TP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析。结果成功构建NS3TP2蛋白基因酵母表达载体,Western免疫印迹显示了NS3TP2蛋白在酵母细胞中的表达。结论NS3TP2蛋白在酵母中表达成功。     

大鼠糖皮质激素受体结构域酵母双杂交系统的构建

目的构建大鼠糖皮质激素受体(GR)各个结构域的酵母双杂交系统,以研究不同结构域在糖皮质激素非基因组效应的作用。方法采用RT-PCR方法扩增GR各个结构域基因片段,酶切回收,将其连接至酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGADT7,构建重组质粒pGADT7-GRAB,pGADT7-GRCD,pGADT7-GRC,pGADT7-GRD,pGADT7-GREF,并经鉴定,测序,体外转录,翻译等方法验证。结果RT-PCR扩增的各GR结构域基因片段电泳后,大小正确,酶切回收后,与质粒pGADT7过夜连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选重组质粒,测序结果与Genebank中GR序列比对完全正确。重组质粒经体外转录、翻译试验方法证实重组质粒中的GR基因片段能够正确合成各个GR结构域蛋白。结论构建大鼠糖皮质激素受体结构域酵母双杂交系统重组质粒,为研究糖皮质激素受体在非基因组效应中的作用奠定了基础。     

小鼠SK2基因亚克隆的构建和鉴定

背景:小电导Ca2+激活钾(small conductance Ca2+-activated potassium channels,SK channels)通道存在于大多数可兴奋性细胞并存动作电位的复极化中发挥着重要作用.但SK通道与Ca2+及其他分子的偶合及调控途径尚未明确.目的:为观察SK2通道基因区段与Ca2+及其他分子的偶合及调控,构建pGBAT7和SK2基因片段重组子.方法:根据SK2基因的全长序列,设计3个SK2基因片段引物,经PCR扩增,测序鉴别后,分别亚克隆到酵母表达质粒pGBKT7.构建的pGBKT7-SK2亚克隆通过电转染法分别转染到酵母AH109菌中并被激活.pGBKT7-SK2亚克隆从酵母AH109菌中提取,电泳和测序鉴定.结果与结论:SK2目的基因PCR扩增产物分别为411,546,729 bp.成功构建了3个含有411,546,729 bp的pGBKT7-SK2亚克隆,电泳和测序鉴别表明构建的pGBKT7-SK2亚克隆完全符合设计要求.转染到酵母AH109菌中pGBKT7-SK2亚克隆可被激活,为探讨SK2通道与其他分子的功能相关提供了重要的物质基础.     

利用多位点Gateway技术构建小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子慢病毒载体

背景:平滑肌肌动蛋白α基因是相对局限于在血管平滑肌细胞中表达的少数几个基因之一,公认是血管平滑肌细胞表型转化的标志。目的:利用多位点Gateway技术构建慢病毒载体pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α控制绿色荧光蛋白基因的表达。方法:设计合成含有attB位点的小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子引物,构建pUp-平滑肌肌动蛋白α;通过LR反应将pUp-平滑肌肌动蛋白α和pDown-绿色荧光蛋白(含att位点的绿色荧光蛋白入门克隆)连接到目的载体pDEST-puromycin,得到pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白表达载体;经PCR和测序鉴定,将载体质粒瞬时转染C2C12细胞系,并且用免疫荧光染色检测基因的表达。结果与结论:成功构建pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;细胞转染实验以及免疫荧光检测证实构建的报告基因载体可以反映平滑肌肌动蛋白α基因的表达情况。     

截短的丙型肝炎病毒核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因在Sf9细胞中的融合表达

目的构建含截短的HCV核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒表达载体,探讨其在Sf9细胞中的表达和抗原性。方法用PCR法扩增截短的HCV核心蛋白基因片段(Ct)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,将其插入转座子载体pFastBac1,构建成重组表达载体pFastCt-EGFP,转化大肠埃希菌DH10Bac,获得重组杆状病毒穿梭质粒BacmidCt-EGFP,转染昆虫Sf 9细胞。结果SDS-PAGE和western blot鉴定表明成功表达了分子量约40 000的融合蛋白。以ELISA法检测发现该融合蛋白能与28份抗HCV抗体阳性血清中的15份发生反应,阳性率为53.6%。结论该融合蛋白在昆虫Sf 9细胞中成功表达并具有一定的抗原性。     

rAAV/HCV核心抗原基因转染树突状细胞的实验研究

目的:研究rAAV/丙型肝炎病毒核心抗原基因[hepatitis C virus(HCV)core gene]转染树突状细胞(dendritic cell,DC)的可行性。方法:构建重组质粒AAV(d16-95)/Core p5(简称rAAV/Core),并以pSH3包装系统制备该病毒。分离外周血单个核细胞(DC前体细胞),以rAAV/Core病毒转染DC前体细胞(基因转染组),采用巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4、肿瘤坏死因子-α诱导成熟。3d后,收集部分DC,以流式细胞仪检测rAAV/Core转染效率及HCV核心抗原在DC中的表达情况。7d后,收集细胞,PCR/Southern blot分析rAAV/Core DNA在DC染色体的整合情况。显微镜下观察DC形态,流式细胞仪检测DC表面分子标志CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86的表达情况。结果:rAAV/Core成功转染DC,质粒DNA整合到DC染色体上,HCV核心抗原基因在DC内表达,DC成熟不受病毒转染影响,具有典型DC外观并高表达特异的成熟DC表面标志。结论:rAAV/Core转染和制备DC的成功为丙型病毒性肝炎的DC免疫治疗打下实验室基...     

人 BMP2和 OPG共表达真核载体的构建与骨质疏松基因治疗相关性的研究

Boneisadynamictissue，thelevelofbonemassreflectsthebalanceofboneformationandresorption，whichinvolvesthecoor－dinateregulationofbone－formingcells（osteoblasts）andbone－resorbingcell（osteoclasts）．Avarietyoflocalgrowthfactorsandcytokinesaswellassystemicpeptideandsteroidhormonesregulatethedifferentiationofimmatureprecursorcellsandtheactivityofmaturecellsinboththeosteoblasticandtheosteoclasticlineage，suchasbonemorphogeneticprotein－２（BMP－２）andosteoprotegenin（OPG）犤１犦．Inaddition，…     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

MK—EGFP融合蛋白的构建和表达

目的克隆中期因子（midkine，MK）的编码序列，构建MK—EGFP融合表达质粒，诱导表达并亲合纯化。方法用RT—PCR技术从人胚胎组织中获得MK编码基因，构建原核表达质粒pET—MK-EGFP；转化大肠杆菌，诱导表达重组蛋白；纯化回收后鉴定生物活性。结果重组质粒经酶切测序与预期相符，融合蛋白表达后的指示荧光于激光共聚焦显微镜下清晰可见，MK在其中保持了原有的完整构象和生物活性。结论MK—EGFP重组质粒构建正确，融合蛋白大量表达，并具有完整的生物学活性。     

乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达

目的用基因工程的方法获得乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)编码区的基因片段,构建重组质粒并在大肠杆菌中表达抗原蛋白。方法用PCR法扩增HBcAg基因片段,构建含有HBcAg基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中以IPTG诱导重组蛋白的表达,并用Western blot对重组蛋白进行检测。结果重组HBcAg在大肠杆菌中得到表达,Western blot检测显示在预期位置出现特异性条带。结论成功构建HBcAg原核表达系统并获得重组HBcAg,为该重组蛋白的相关功能研究奠定了基础。