人热休克蛋白110在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达人热休克蛋白110（hHSP110）,制备具有与天然hHSP110相同生物活性的重组人HSP110（rhHSP110）。方法用PCR法自质粒pBacPAK中克隆hHSP110的DNA,构建真核表达载体pPICZα/hHSP110。经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X-33。用PCR法筛选Zeocin抗性的转染阳性克隆,用Western blot法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的rhHSP110,筛选高表达工程菌。结果经PCR法克隆的hHSP110DNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hHSP110DNA定向插入pPICZα,构建pPICZα/hHSP110真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性的阳性克隆。SDS-PAGE和Western blot分析显示了甲醇诱导的培养基上清中含有rhHSP110。rhHSP110表达量达120mg/L。结论克隆hHSP110基因并构建和筛选出高效表达rhHSP110的毕赤酵母工程菌,表达的rhHSP110具有天然rhHSP110相同的生物活性。     

重组人HER2/neu ICD在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的 用毕赤酵母表达体系制备具有与天然HER2/neu ICD相同结构和活性的重组HER2/neu ICD.方法 PCR法自质粒pCMV中克隆HER2/neu ICD基因,构建真核表达载体pPICZα/HER2/neu ICD,电转化至毕赤酵母菌株X-33.对基因转染Zeocin抗性阳性的克隆,采用PCR法筛选出稳定表达HER2/neu ICD的菌株.最后用SDS-PAGE鉴定甲醇诱导的培养上清液中的HER2/neu ICD.结果 构建pPICZα/HER2/neu ICD真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆;PCR法筛选了稳定表达HER2/neu ICD的菌株;SDS-PAGE分析显示甲醇诱导后表达上清中含有HER2/neu ICD,分子量约为84 kDa.结论 成功构建pPICZα/HER2/neu ICD真核表达载体并筛选出稳定表达HER2/neu ICD的毕赤酵母工程菌.     

人HER2/neu胞外区在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的在毕赤酵母中高效表达HER2／neu胞外区，制备具有与天然HER2／neu相同结构和生物学活性的重组人HER2／neu胞外区（rhHER2／neu ECD）。方法用RT-PCB法自人mBNA中克隆her2／neu ECD基因，构建真核表达载体pPICZα/her2/neu ECD。经核酸测序确证后，电转化毕赤酵母菌株X-33。用PCB法筛选基因转染后Zeocin抗性阳性的克隆，用SDS-PAGE法筛选高表达HER2／neu ECD工程菌，用Western印迹法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的HER2／neu ECD。结果经BT-PCB法克隆的her2／neu ECD基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致。将her2／neu ECD基因定向插入pPICZα，构建pPICZα/her2/neu ECD真核表达载体，经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆。SDS-PAGE和Western印迹法分析证实了甲醇诱导的培养基上清中含有HER2／neu ECD，分子量110kDa。HER2／neu ECD表达量达120mg／L。结论克隆her2／neu ECD基因并构建和筛选出高效表达HER2／neu ECD的毕赤酵母工程菌。     

甲型流感病毒M2e与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的 将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株.方法 通过RT-PCR扩增HSA基因,构建pPICZα-HSA质粒,将人工合成的M2e序列与pPICZα-HSA质粒分别经BstBI 和KpnI 酶切消化后连接,构建真核表达载体pPICZα-HSA/M2e,线性化后电转化毕赤酵母X-33.用PCR法筛选Zeocin抗性阳性的克隆,SDS-PAGE和Western印迹法筛选高表达HSA/M2e菌株.结果 经RT-PCR法克隆的HSA基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致,构建的pPICZα-HSA/M2e真核表达载体,经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆.SDS-PAGE和Western印迹分析证实了甲醇诱导的培养基上清中含有HSA/M2e,分子量约为68 kD.结论 成功构建了分泌表达重组HSA/M2e融合蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础.     

重组人载脂蛋白E3在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的 在毕赤酵母中高效表达重组人载脂蛋白E3(rhApoE3),制备与天然hApoE3具有相同结构和活性的rhApoE3.方法 用RT-PCR法自人肝组织RNA克隆hApoE3的cDNA,构建真核分泌型表达载体pPICZα/hApoE3.经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X33.甲醇诱导后进行SDS-PAGE、Western印迹分析,筛选高表达工程菌.结果 经PCR法克隆的hApoE3 DNA序列与GenBank登录的序列一致.SDS-PAGE和Western印迹分析均在分子量约34kD出现特异性条带,rhApoE3表达量达150mg/L.结论 在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生rhApoE3,获得高效表达rhApoE3的毕赤酵母工程菌.     

蛔虫抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

目的在毕赤酵母表达系统中表达蛔虫抗菌肽cecropin P1并检测其生物活性。方法根据毕赤酵母的密码子偏好性,人工设计并合成3条cecropin P1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到cecropin P1基因,构建重组载体pMD18-T-CecP1。双酶切pMD18-T-CecP1,将cecropin P1基因克隆到载体pPICZα-A信号序列α-因子之后,构建酵母分泌表达载体pPICZα-A-CecP1,用SacⅠ将其线性化后转化毕赤酵母X-33,采用Zeocin抗性筛选阳性菌株并进行诱导表达,发酵上清进行SDS-PAGE分析,抑菌试验鉴定其抑菌活性。结果获得酵母分泌表达载体pPICZα-A-CecP1。SDS-PAGE证实pPICZα-A-CecP1/X-33甲醇诱导产物的分子质量单位为6.3 ku。表达产物对大肠埃希菌DH5α的生长有抑制作用。结论应用毕赤酵母表达系统能表达cecropin P1。该抗菌肽具有抑菌作用。     

汉坦病毒S基因毕赤酵母表达系统的构建

目的构建汉坦病毒HTN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统。方法应用RT-PCR法扩增汉坦病毒Z10株和L99株编码核蛋白的S基因,将扩增产物分别与pGEM-T-Easy载体连接,经序列分析后双酶切,分别定向克隆入载体pPICZαΑ和pPICZαC,继而将重组质粒以SacⅠ线性化并电转化入毕赤酵母X33感受态细胞,用Zeocin筛选高拷贝转化子进行鉴定。结果PCR扩增产物约为1290bp,与T载体相连测序结果与Genbank相应序列比较,核苷酸序列同源性分别为99.84%和99.92%,其编码蛋白质二级结构均无改变。定向克隆获得pPICZα-ΑZ10S和pPICZ-αL99S,分别电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株PpX33-Z10S和PpX33-L99S,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论成功构建汉坦病毒HIN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统,为进一步研究奠定基础。     

弓形虫SAG2基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究

目的 在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达弓形虫SAG2基因,探索一种新的有效活化机体抗弓形虫免疫反应的疫苗。方法 以重组质粒pET23a-SAG2为模板,亚克隆目的片段SAG2至酵母菌分泌表达载体pPICZαA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot）分析。以整体重组酵母菌作为疫苗腹腔免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的免疫反应。结果 成功构建了pPICZαA-SAG2毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为22 ku的蛋白。Western blot显示,22 ku蛋白可被抗-His标签抗体识别。结论 在毕赤酵母菌中成功表达了SAG2基因。整体重组酵母活菌具有免疫原性。     

人分泌型Klotho蛋白在CHO细胞中的稳定表达

目的 在CHO细胞中稳定表达人分泌型Klotho（hsKL）蛋白，制备具有天然结构的重组hsKL（rhsKL）蛋白。方法 用PCR法自克隆载体pBS—hsk1中克隆hsKL DNA，构建真核表达载体pcDNA3．1／Zeo（＋）-hskl。经核酸测序确证后，阳离子聚合物转染CHO细胞。用PCR法筛选具有Zeocin抗性的阳性细胞克隆，SDS—PAGE（银染色）法确定CHO细胞分泌蛋白的分子量，Western印记法鉴定CHO细胞的培养上清液中的rhsKL蛋白，确定稳定转染细胞株CHO—hsKL。结果 经PCR法克隆的序列与Gene Bank登录的bskl mRNA序列一致。将hsKL DNA定向插入pcDNA3．1／Zeo（＋），构建pcDNA3．1／Zeo（＋）．hsk1真核表达载体并通过阳离子聚合物转染CHO细胞获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDS—PAGE和Western blot分析显示，转染的CHO培养上清中含有分子量约为66kDa的rhsKL蛋白。结论 首次实现天然结构的hsKL蛋白的重组表达——获得稳定表达细胞株CHO—hsKL。     

日本血吸虫组织蛋白酶L2(SjCL2)基因巴氏毕赤酵母表达载体的构建

目的　扩增SjCL2基因 ,构建巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2 ,为进一步研究其蛋白酶的功能奠定基础。方法　运用RT -PCR技术 ,从日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫总RNA中扩增获得SjCL2基因 ;将其定向克隆至巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB质粒 ;经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序分析SjCL2基因并确定其读码框的正确插入。结果　利用RT -PCR技术从日本血吸虫成虫总RNA中扩增到约 1Kb大小的SjCL2基因 ,通过双酶切分析、PCR鉴定以及DNA序列分析确定SjCL2基因被克隆到巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB中。 结论　成功构建了含有SjCL2基因编码区序列的巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2质粒     

亚低温对大鼠脑缺血再灌注损伤后HSP70 、TNF-α、NF-κB表达及损伤神经细胞凋亡的影响

目的：观察亚低温对大鼠脑缺血再灌注损伤后HSP70（热休克蛋白70），TNF－α（肿瘤坏死因子－α），NF－κB（核蛋白因子－κB）表达及损伤神经细胞凋亡的影响，方法：采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，大脑中动脉阻塞2h，再灌注损伤10h，用免疫组织化学法和原位缺口末端标记（TUNEL）法分别检测假手术组，对照组和亚低温组HSP70，TNF－α，NF－κB表达水平和凋亡细胞百分率。结果：亚低温组HSP70表达水平对照组显著升高（P＜0．05），而TNF－α，NF－κB表达水平和凋亡细胞百分率明显低于对照组（P＜0．05），结论：亚低温下调大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF－α，NF－κB表达水平和上调HSP70表达水平可能与其抗损伤神经细胞凋亡作用有关。     

Ku70反义寡核苷酸增强甲状腺癌细胞的辐射敏感性

目的 研究DNA修复基因Ku70反义寡核苷酸(ASODN)对甲状腺癌细胞辐射敏感性的影响.方法 设计合成特异性靶向Ku70的ASODN,以不同浓度转染人甲状腺髓样癌细胞(TT),并设脂质体和正义寡核苷酸(SODN)对照组进行比较.采用Western印迹技术检测各组细胞中Ku70蛋白表达水平.利用不同剂量60 Co γ射线照射细胞后,细胞克隆形成实验检测细胞存活分数.CCK-8法、Annexin-V/PI染色法分析ASODN对细胞活力和细胞凋亡的影响.彗星电泳法比较γ射线照射后DNA双链断裂的修复效率.结果 转染ASODN各组细胞Ku70蛋白表达均较脂质体对照组、SODN组明显降低,并呈浓度依赖性;照射后细胞存活率降低(P＜0.01),凋亡率显著增加(P＜0.01),DNA双链断裂的修复效率降低(P＜0.01).结论 ASODN能够特异性地下调甲状腺癌细胞Ku70的表达,抑制γ射线照射后细胞存活和DNA双链断裂修复,提高肿瘤细胞的辐射敏感性.     

白花丹参叶制剂对局灶性脑梗死HSP70及细胞凋亡的影响

目的观察热休克蛋白70(HSP70)、神经细胞凋亡在大鼠局灶性脑梗死后不同时程的表达,探讨二者的关系及白花丹参叶制剂对其的影响.方法采用光化学法诱导大鼠局灶性脑梗死模型,HSP70免疫组织化学染色,并用TdT-介导duTP-生物缺口末端标记(TUNEL)方法检测凋亡细胞.结果免疫组化显示白花丹参叶制剂预处理组与单纯局灶性脑梗死组各时间点相比阳性反应均有明显的增多(P＜0.05).TUNEL结果显示,白花丹参叶制剂预处理组各时间点凋亡细胞均有统计学意义.结论白花丹参对脑梗死具有保护作用.     

HSP70反义寡脱氧核苷酸促进MRC-5细胞衰老的研究

目的 采用反义寡核苷酸技术了解HSP70与细胞衰老之间的关系.方法 设正义组、反义组,在转染后12,24 h,3,5 d,分别用流式细胞技术和免疫荧光技术检测HSP70蛋白水平、凋亡细胞比例和细胞周期.在转染后第2、4、6天,分别收集正义组、反义组和空白对照组细胞爬片进行SA-β-Gal染色.结果 各时间点反义组蛋白表达均低于正义组（P＜0.05）,凋亡细胞比例均高于正义组（P＜0.05）.随观察期延长,处于G1期的细胞数逐渐增多,但反义组均高于正义组（P＜0.05）.相同时间点反义组SA-β-Gal染色阳性细胞（蓝染细胞）数均较正义组和空白对照组多,随观察期延长,各组蓝染细胞均增多.结论 HSP70反义寡脱氧核苷酸下调MRC-5细胞HSP70的表达,使细胞出现G1期阻滞,促进细胞衰老.     

胰岛素对全脑缺血再灌注大鼠脑HSP70表达的作用

目的探讨胰岛素对脑缺血再灌注损伤的中枢保护机制。方法通过胸部挤压建立心脏骤停后完全性全脑缺血再灌注模型,观察HSP70在脑组织的表达情况。结果与对照组相比,胰岛素并不能显著上调缺血大脑的HSP70表达。结论胰岛素对全脑缺血大鼠大脑的HSP70表达没有显著影响。     

左归丸对老年性痴呆模型鼠脑神经元HSP70及超微结构的影响

目的 探讨左归丸对老年性痴呆(Alzheimer病,AD)动物模型HSPT0及超微结构的影响.方法 模型组以D-半乳糖腹腔注射合并A13注射海马制备AD动物模型,各治疗组分别在造模的同时灌胃左归丸和抗脑衰胶囊、哈伯因.采用生化法检测各组大鼠脑匀浆AchE,运用RT-PCR测定各组海马HSP70的表达并用透射电镜观察各组海马神经元超微结构的变化.结果 左归丸能明显抑制模型鼠脑组织中AchE活性,上调HSP70的表达,抑制细胞凋亡.超微结构观察发现模型组海马神经元显现凋亡早期的形态特点,各治疗组和对照组对凋亡皆有抑制作用.结论 左归丸对痴呆鼠海马神经元细胞凋亡有抑制作用,其机制可能与其抑制模型鼠脑组织中AchE活性、上调HSP70的表达和改善神经元细胞损害有关.     

三七总皂甙与参麦注射液对大鼠脑出血后脑水肿、行为学变化的影响

目的 比较观察三七总皂苷及参麦注射液对脑出血大鼠脑组织损伤和脑水肿的作用.方法 采用胶原酶与肝素复合法造成大鼠脑出血模型,造模后3 h,各组按试验设计给药,在相应时间点先对大鼠进行神经行为学评分,测定脑组织含水量、细胞形态学的变化,TNF-α及HSP70表达.结果 三七、参麦均能够改善神经功能缺失症状,在第4天与模型组比较差异显著(P＜0.05).三七及参麦组能够减轻脑组织水肿,于第4天、第7天改善明显,与模型组比较差异显著(P＜0.05),与甘油作用相似,但起效较慢.三七和参麦均能够使大鼠脑出血后TNF-α表达降低、HSP70表达升高,以4 d、7 d与模型组比较有显著性差异(P＜0.05).结论 三七和参麦可以改善脑出血后神经功能缺陷症状;能减轻脑出血后脑水肿;可以抑制脑组织TNF-α的表达,增加HSP70表达,疗效优于甘油;综合各指标分析和比较,三七的作用较参麦好.     

艾灸预处理对脑缺血大鼠HSP70蛋白及HSP70mRNA表达的影响

目的探讨艾灸预处理的预防性脑保护作用机制。方法健康Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、假手术组、脑缺血组、脑缺血预处理组、艾灸预处理组。正常组正常饲养;假手术组仅暴露四条血管,不发生脑缺血;脑缺血组全脑缺血10min;脑缺血预处理组先缺血预处理3 min,再灌注24 h后再次全脑缺血10 min。艾灸预处理组先给予艾灸预处理7 d,再行全脑缺血10 min。各组分别于手术后24、48、72 h取脑,采用免疫组化法、原位杂交法检测海马CA1区HSP70蛋白及HSP70mRNA的表达。结果脑缺血组24 h HSP70蛋白表达达到高峰,72 h蛋白含量显著降低(P<0.01)。脑缺血预处理组、艾灸预处理组可见较多HSP70蛋白表达,较缺血组明显增高(P<0.01)。艾灸预处理组术后24、48 h HSP70蛋白的表达较缺血预处理组明显增高(P<0.01、P<0.05);72 h HSP70蛋白的表达明显降低,与缺血预处理组比较具有显著性差异(P<0.01)。结论艾灸预处理能诱导脑缺血大鼠海马CA1区HSP70 mRNA、HSP70蛋白的表达。其预防性脑保护作用可通过促进HSP70蛋白及HSP70mRNA表达高峰...     

热休克蛋白70对内毒素诱导的肝脏NF-κB信号转导通路的影响

目的探讨热休克蛋白70对内毒素（LPS）诱导的肝脏NF-κB信号转导通路的影响。方法雄性昆明种小鼠70只随机分为3组,对照组（n=10）、LPS诱导组（n=30）、亚砷酸钠（SA）预处理组（n=30）,分别于处理后0.5 h、1.5 h和6 h在麻醉下开腹取肝脏,Western blot方法检测肝脏NF-κB P65、NF-κB P50和IκB的表达。结果 SA预处理可抑制NF-κB P65和NF-κB P50蛋白的表达,增强肝脏IκB蛋白的表达。结论亚砷酸钠（SA）刺激机体产生HSP70,可通过影响肝脏信号转导,从而抑制相关炎症通路,减轻LPS所致的急性肝损伤。     

Anti-DFS70 among HIV-positive individuals – A prospective study

Anti-DFS70 is an anti-nuclear antibody directed against the DFS70 protein, which is produced in response to several stressful events. Since its discovery, this autoantigen–antibody complex has drawn the attention of many researchers, yet many questions remain unanswered. The DFS70 protein is crucial for HIV integration into the host DNA; however, the relationship between anti-DFS70 and HIV is unknown. A protective role of anti-DFS70 against HIV is possible due to the competition between the HIV integrase and the anti-DFS70 antibody on the same target site on DFS70.The current study aimed to assess the prevalence of anti-DFS70 in HIV-positive individuals seeking for possible interrelation.A total of 100 HIV-positive individuals followed up at the HIV unit at Sheba Medical Center were tested for the detection of anti-DFS70. A total of 92 non-HIV subjects, randomly selected, were tested and compared as controls. Chemiluminescence assay by QUANTA Flash was performed to evaluate the presence of anti-DFS70 antibodies.None of the HIV-positive individuals had a positive test result for anti-DFS70 (0%) compared to 10 out of 92 non-HIV individuals (10.9%).This is the first study addressing the prevalence of anti-DFS70 in HIV-positive patients. The rate of anti-DFS70 positivity was found to be significantly lower in HIV-positive individuals than in non-HIV individuals (p = 0.002). The absence of anti-DFS70 in HIV-positive subjects might imply that individuals who lack these antibodies are more susceptible to HIV infection. Further studies with large populations are needed to confirm this hypothesis.