重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中的表达

目的 利用黄芪毛状根表达人胸腺素α1.方法 合成人胸腺素α1基因,构建重组载体pCAMBIA1301-hTα1,以黄芪下胚轴为外植体,通过发根农杆菌C58C1介导转入黄芪毛状根中,取潮霉素抗性毛状根用PCR法检测人胸腺素α1基因的整合,SDS-PAGE、Western印迹法分析人胸腺素α1基因的表达.结果 潮霉素抗性毛状根整合并表达了人胸腺素α1基因.结论 重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中能够表达,为以黄芪毛状根为生物反应器工业化生产人胸腺素α1提供了实验基础.     

小花棘豆化学成分分离鉴定

目的：考察小花棘豆（OxytropisglabraDC．）的化学成分。方法：小花棘豆乙醇提取物反复采用硅胶、聚酰胺、SpehadexLH-20柱色谱等多种方法进行分离纯化,利用理化性质及波谱学方法进行鉴定结构。结果：从该药材中分离得到4个化舍物,分别鉴定为己内酰胺（caprolactam,1）,槲皮素-3-O-芸香糖苷（quercetin一3-O-β-D-rutinoside,2）,芹菜素-7-0-新橙皮糖苷（apigenin-7-O-neohesperidoside,3）,山奈酚-3-0-β—D-葡萄糖-7-0-β-D-葡萄糖苷（kaempeferol-3-O-β-D-glucopyranoside-7-0-β-D-glucopyranoside,4）。结论：化合物1、2、3为首次从该植物中得到,其中化合物1同时也是从该属中首次得到。     

人分泌型Klotho蛋白在CHO细胞中的稳定表达

目的 在CHO细胞中稳定表达人分泌型Klotho（hsKL）蛋白，制备具有天然结构的重组hsKL（rhsKL）蛋白。方法 用PCR法自克隆载体pBS—hsk1中克隆hsKL DNA，构建真核表达载体pcDNA3．1／Zeo（＋）-hskl。经核酸测序确证后，阳离子聚合物转染CHO细胞。用PCR法筛选具有Zeocin抗性的阳性细胞克隆，SDS—PAGE（银染色）法确定CHO细胞分泌蛋白的分子量，Western印记法鉴定CHO细胞的培养上清液中的rhsKL蛋白，确定稳定转染细胞株CHO—hsKL。结果 经PCR法克隆的序列与Gene Bank登录的bskl mRNA序列一致。将hsKL DNA定向插入pcDNA3．1／Zeo（＋），构建pcDNA3．1／Zeo（＋）．hsk1真核表达载体并通过阳离子聚合物转染CHO细胞获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDS—PAGE和Western blot分析显示，转染的CHO培养上清中含有分子量约为66kDa的rhsKL蛋白。结论 首次实现天然结构的hsKL蛋白的重组表达——获得稳定表达细胞株CHO—hsKL。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子在大豆毛状根中的表达

目的 利用基因重组技术在大豆毛状根中表达hbFGF.方法 将hbFGF基因克隆到pCambia1301载体,以大豆子叶节和下胚轴为外植体,通过发根农杆菌C58C1介导转入到大豆中.经潮霉素抗性筛选,PCR法检测hbFGF基因的整合.用Western blot印迹分析hbFGF的表达.结果 阳性毛状根中整合并表达了hbFGF基因.结论 克隆hbFGF基因并转染到大豆的毛状根中,在毛状根中表达.     

rhKPI/AβPP对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的保护作用

目的 用四氯化碳致大鼠慢性肝损伤，研究rhKPI／AβPP对大鼠肝损伤保护作用。方法 采用四氯化碳（CCL4）建立大鼠慢性肝损伤和肝纤维化模型，设rhKPI／AβPP高、中、小剂量组并与促肝细胞生长素组作对照。观察大鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、胆碱酯酶（CHE）碱性磷酸酶（肿）、白蛋白（ALB）、白球蛋白比（A／G）、γ谷氨酰转肽酶（γ-GT）、胆红素（T-BIL）、唾液酸（SA）、肝组织羟脯氨酸（Hyp）及肝脏组织病理改变。结果 rhKPI／AβPP可显著降低大鼠血清ALT、AST的活性及肝组织Hyp含量，抑制ALB和（A／G）比值的降低，减轻肝组织病理损伤程度。结论 rhKPI／AβPP对实验性慢性肝损伤具有保护作用和抗纤维化作用。     

白蛋白信号肽引导天然N-端的rBPTI在毕赤酵母中高效分泌表达

目的：探讨在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效分泌表达具有天然N-端序列的rBPTI。方法：将白蛋白信号肽(hsasp)和bpti基因连接并构建真核表达载体pPICZ/hsasp-bpti，电击转化毕赤酵母菌株X-33，用PCR法、SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制活性分析筛选阳性转化菌。结果：转染pPICZ/hsasp-bpti的毕赤酵母X-33工程菌能够高效地分泌表达rBPTI；培养上清中rBPTI含量约200 mg• L^-1；SDS-PAGE和质谱分析结果显示rBPTI相对分子质量分别为6 500和6 508；rBPTI的N-端测序结果表明其N-端15个氨基酸序列与天然BPTI完全一致；胰蛋白酶活性抑制分析结果表明，抑制常数Ki＝（2.6±0.1）×10^-9,与天然BPTI一致。结论：hsasp能够在毕赤酵母中高效地引导分泌表达天然N-端氨基酸序列的rBPTI,其表达量达200 mg• L^-1。     

胸腺五肽基因转化烟草及其表达的研究

目的研究在烟草中表达胸腺五肽（Thymopentin，TP5）。方法合成TP5基因，构建重组载体pB1121＋TP5，以烟草叶盘为外植体，通过根癌农秆菌介导转染烟草，取卡那霉素抗性植株用PCR方法筛选转染阳性植株及RT—PCR、质谱检测阳性植株叶片外植体中的TP5表达。结果抗性植株整合并表达TP5。结论成功构建了含TP5的植物表达载体pB1121＋TP5，并能在烟草中表达。     

人热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的在毕赤酵母(pichiapastoris)中高效表达人热休克蛋白70(hHSP70),制备具有天然与hHSP70相同结构和活性的重组hHSP70(rhHSP70)。方法用PCR法自人DNA文库中克隆hHSP70的DNA,构建真核表达载体pPICZα/hHSP70。经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X33。用PCR法筛选Zeocin抗性的转染阳性克隆,Westernblot法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的rhHSP70,筛选高表达工程菌。结果经PCR法克隆的hHSP70DNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hHSP70DNA定向插入pPICZα,构建pPICZα/hHSP70真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDSPAGE和Westernblot分析显示了甲醇诱导的培养基上清中含有rhHSP70,分子量72kD。氨基酸序列分析证实rhHSP70氨基端15个氨基酸与天然rhHSP70完全一致。rhHSP70表达量高达250mg·L-1。结论获得高效表达rhHSP70的毕赤酵母工程菌。     

脂肪来源基质细胞的扩增及多分化潜能研究

目的建立人脂肪来源的基质细胞(ADSCs)的分离和扩增方法,探讨ADSCs的多向分化潜能。方法采用胶原酶消化法分离扩增人ADSCs,测定其生长的经时变化、累积生长倍数等;应用不同因子诱导ADSCs向脂肪细胞及神经元样细胞分化并进行鉴定。结果每100ml脂肪抽吸物中可分离得到2×107~4×107个有核细胞,60d内扩增至P8;油红O染色、免疫细胞化学染色及RT-PCR证实ADSCs经诱导可分化为脂肪细胞及神经元样细胞。结论建立了ADSCs的扩增培养方法,扩增培养的ADSCs具有旺盛的增殖能力,并且具有向脂肪细胞及神经元样细胞分化的潜能。有望作为一种成体多能干细胞应用于组织工程及细胞治疗。     

抑肽酶在转基因烟草中的表达

目的　在烟草中高效表达抑肽酶(bpti)。方法　克隆抑肽酶基因,以烟草叶片为外植体,通过根癌农杆菌将其导入烟草,经卡那霉素抗性筛选和PCR扩增检测基因的整合;抽提转染植株叶片中的抑肽酶,进行活性测定。结果　抗性植株整合并高效表达了抑肽酶。结论　构建的含抑肽酶基因的植物表达载体pBI1 2 1 bpti具有正确的阅读框,并能在异源植物中表达。