人胃癌MGC80—3细胞系基因组文库的构建

本文报道用Lambda Charon4A为载体构建人胃癌细胞系MGC80—3基因组文库的全过程。用限制性内切酶EcoRI不完全酶解MGC 80—3 DNA,分离获得15—20kb“目的”基因片段,再通过T4DNA连接酶的作用使之与Lambda Charon4A载体臂进行重组,经体外包装反应和Xgal呈色反应鉴定获得了9.4×10~5重组噬菌体,经低密度平皿扩增后,构建了一个人胃癌MGC 80—3细胞系基因组文库,为进一步开展胃癌基因的分离研究奠定了基础。     

杜氏盐藻对氯酸盐的敏感性及氯酸盐抗性株的分离

目的 考察杜氏盐藻对氯酸盐的敏感性及其在分离盐藻氯酸盐抗性株中的作用.方法 测定了不同浓度的氯酸钾和氯酸钠对杜氏盐藻的抑制作用,并利用确定浓度的氯酸盐从盐藻化学诱变库中分离氯酸盐抗性株.结果 杜氏盐藻对氯酸钾的敏感浓度(细胞致死浓度,下同)为100 mmol/L,对氯酸钠的敏感浓度为200 mmol/L.利用200 mmol/L氯酸钠作为筛选剂,从化学诱变库中筛选了3株氯酸盐抗性突变株.结论 盐藻对氯酸盐中度敏感,可以利用氯酸盐抗性分离杜氏盐藻硝酸盐还原酶突变株,从而建立盐藻筛选标记体系,为利用转基因盐藻生产抗癌药物血管抑素奠定基础.     

HBV3′末端缺失preS/S基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆HBV 3′末端缺失preS/S基因,构建真核表达载体,转染真核细胞,为进一步进行功能研究奠定基础.方法采用PCR方法从乙型肝炎病毒全基因组中克隆preS/S基因,构建真核表达载体pcDNA3-preS/S,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定,通过脂质体转染Hela细胞系进行表达研究.结果1)克隆了3′末端缺失的preS/S基因;2)构建preS/S真核表达载体;3)转染细胞及G418筛选后得到preS/S基因稳定表达的细胞株.结论3′末端缺失的preS/S基因能够在胞内表达,此研究为基因的功能研究奠定了一定的基础.     

survivin基因RNAi逆转录病毒载体设计与构建方法实验研究

目的　设计和构建survivin基因的表达si RNA逆转录病毒重组载体,探讨胶质瘤分子病因及用于基因治疗的可行性。方法　利用在线软件si Direct设计干扰survivin基因靶序列,合成回文DNA序列退火后克隆至线性化p SUPER质粒载体,重组质粒载体双酶切电泳鉴定和测序分析,再转染phoenix细胞产生病毒转染低分化SHG4 4 - 9胶质瘤细胞株。利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。Western blot测定转染后SHG4 4 - 9细胞survivin表达量。结果　p SU PER表达si RNA重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入6 0 bp序列与原序列一致,位置正确。测定p SUPER.retro- S1、p SU PER.retro- S2病毒滴度值分别为5 .5×10 5CFU/ m l和5 .75×10 5CFU/ ml,干扰效率分别为70 .5 %和接近10 0 .0 %。结论　survivin基因的表达si RNA逆转录病毒重组载体的构建成功,不但为研究胶质瘤分子病因和基因治疗提供了有用工具,而且也为研究高表达survivin的其它肿瘤构建了新的平台。     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，构建真核表达载体，本研究拟探索该基因在肿瘤基因治疗中的应用基础。方法 根据GenBank数据库提供的CD基因核苷酸序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法，从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因，并与pcDNA3．1定向连接，构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体pcDNA3．1-CD，并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定。结果克隆了大肠杆菌CD基因，并构建了真核表达载体，经限制性内切酶酶切、PCR扩增和DNA测序证实了其正确性。结论 pcDNA3．1-CD真核表达载体构建成功。     

抗人肺腺癌单抗5F-11噬菌体抗体库的构建及表达

目的　构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法　利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬菌体表达文库。结果　制备了库容为 8× 10 7pfu/ml的噬菌体展示文库。随机抽取未经筛选的克隆进行酶切 ,酶切图谱呈多样性 ,富集后的酶切图谱则显示特异构型的噬菌体得到富集。检测 30个噬菌体克隆上清 ,其中 2 3个与A2 细胞有较强反应。结论　本研究获得了抗人肺腺癌单抗 5F 11的单链抗体 ,为拓展抗体的应用创造了条件。     

定向编辑CTLA4 基因的向导RNA体外合成体系的构建及其编辑效率

目的：基于CRISPR/Cas9 基因编辑技术原理体外合成定向编辑细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA4)基因的向导RNA(small guide RNA,sgRNA)。方法：（1）使用Crispr 网站对CTLA4 位点的sgRNA进行预测并设计出3 个sgRNA（sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3）,构建sgRNA 重组质粒,将其转染293T 细胞,48 h 后提取基因组DNA,利用T7EN1 核酸内切酶筛选活性较高的sgRNA序列;（2）以筛选到的sgRNA重组质粒为模板,设计引物并用PCR扩增体外合成sgRNA的DNA模板片段,进一步优化体外转录条件,转录出sgRNA,并利用Cas9 核酸酶体外检测转录纯化sgRNA的切割效率;（3）将sgRNA与转录得到的Cas9 mRNA 电转化入肺癌患者CD3+T细胞,实现靶基因敲除。结果：T7EN1 核酸内切酶实验证实了sgRNA2 序列靶向敲除效率最高,效率达到66%;优化体外合成体系后,转录得到的CTLA4 sgRNA2 产量高,具有较高的活性,在靶点上成功切开了DNA双链,Cas9 核酸酶检测出其切割效率达到了65%;最终可在肺癌患者CD3+T细胞中有效敲除CTLA4 基因,CTLA4 分子的表达从46%降低到22%,T7E1 核酸内切酶实验进一步证实了其编辑效率为56%。结论：体外成功构建了具有较高编辑效率的定向编辑CTLA4基因的sgRNA,为后续针对该基因制定相应的免疫治疗策略奠定了基础。     

PcDNA3.1-Tum-5基因真核表达载体的构建

构建携带Tum-5基因真核表达载体PcDNA3.1-Tum-5.方法 利用巢式PCR扩增人胚肾细胞株HEK293 cDNA获得Tum-5基因,并利用DNA回收试剂盒进行回收;同时扩增、提取pcDNA3.1质粒,并将其与Tum-5基因分别进行EcoRV和XhoI双酶切,回收相应条带,通过T4DNA连接酶进行连接,转化DH5α感受态细胞,获得阳性克隆.获得质粒DNA后行KpnI和XhoI双酶切,克隆并测序酶切产物.结果 巢式PCR扩增出的产物与目的 基因大小相同;重组质粒经双酶切电泳分析,与预期结果一致;对连接点两端进行测序,结果显示接头两端序列连接正确,插入序列与载体读码框架相匹配.结论 本方法可以成功构建人Tum-5基因表达载体,为进一步研究Tum-5基因功能提供了理论依据.     

人肺癌细胞cDNA表达文库的构建

用磁珠从肺癌细胞株A549中直接分离mRNA.以随机六聚体为引物,在M-MLV反转录酶作用下,合成cDNA第一链,在RNaseH和DNA聚合酶的共同作用下合成双链cDNA,经T_4DNA聚合酶使其末端平齐化后,连接到经EcoRI酶切后消平的质粒表达载体中,电击转化E.coliDH5α.该文库大小约为9.0×10~5,重组子阳性率达85%,插入的cDNA长度约在0.5～4kb之间.以该文库cDNA为模板,应用PCR方法,首次从肺癌细胞中获得了死亡蛋白酶CPP32基因.该cDNA文库的构建为筛选调节肺癌细胞死亡的其它基因打下了基础.     

人白细胞介素-2真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建高效表达人IL－2的真核表达质粒,为IL－2的肿瘤基因治疗提供重要的工具。方法运用PCR扩增出人IL－2基因,经BamHI及EcoRI双酶切后,回收片段与BamHI及EcoRI处理的表达载体pcDNA3在T4DNA连接酶的作用下连接,并用多种限制性内切酶对重组质位进行酶切鉴定。结果PCR扩增片段的长度约为480bp,重组质粒经酶切显示,构建的质粒中含480bp的IL－2插人片段,将此重组质粒命名为pcDNA3－IL－2。结论本研究结果为进一步研究表达IL－2质粒的肿瘤基因治疗及免疫调节作用打下了基础。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

Management of intracranial metastases of differentiated carcinoma of thyroid

Summary Brain metastases in differentiated carinoma of the thyroid is a rare occurrence. We treated five documented cases of carcinoma of thyroid with brain metastases out of 400 cases of thyroid cancer treated between 1972 to 1993. 4 were females out of which one was pregnant during the appearance of brain metastases. All cases were treated with thyroidectomy, and radioiodine as primary therapy. Brain metastases developed 6 months to 11 years following treatment of the primary and were treated with radiotherapy and suppressive levothyroxine. We observed the beneficial effect of suppressive thyroxine and the poor prognosis associated with pregnancy and withdrawl of thyroid replacement therapy. 3 of the 5 patients are alive 12–23 months after treatment for brain metastases, while 2 patients died at 4 months and 7 years post brain metastases due to pulmonary and hepatic failure, respectively.     

Clinico-Pathological Study of 50 Cases of Tumours of Larynx

Otoacoustic emissions have been advocated in the management of otitis media with effusion. However, otoacoustic emissions cannot differentiate different types of hearing loss. This study was conducted to find factor that can differentiate otitis media with effusion from other common causes of hearing loss in children. Children were enrolled in the study and divided in four groups consisting of 25 ears each after pure tone and impedance audiometry: (1) Otitis media with effusion group, (2) Normal ear group, (3) Sensory-neural hearing loss group, (4) Chronic suppurative otitis media group. Otoacoustic emissions were recorded and results were analyzed statistically. The normal hearing group had significant difference from other groups but total band reproducibility of transient evoked otoacoustic emissions did not show any statistical difference in the cases groups. In distortion product otoacoustic emissions, group 1 showed significant difference from group 3 and group 1 had significant difference from all other groups at 4 kHz. The study did not find any factor that differentiates otitis media with effusion from other diseases. Although, distortion product otoacoustic emissions can indicate otitis media with effusion but impedance audiometry should be the main tool in the management of otitis media with effusion.     

胆囊腺瘤癌变的相关因素分析

目的:探讨胆囊腺瘤癌变与临床因素的相关性。方法:应用ROC曲线,计算胆囊腺瘤癌变的肿瘤大小临界值。应用χ2独立性检验,计算胆囊腺瘤癌变与临床因素的相关性、临床表现与肿瘤位置的相关性。结果:肿瘤良恶性临界值为2.27 cm。胆囊腺瘤癌变与患者的性别、年龄、是否合并结石无明显相关性（P＞0.05）,而与肿瘤大小、肿瘤数目、形态、超声下是否有血流(P＜0.05)等临床病理特征有明显相关性。临床症状与肿瘤是否位于胆囊颈部有明显相关性(P＜0.05)。结论:胆囊腺瘤在超声扫描下表现为单发、无蒂、有血流、直径大于2.27 cm,应高度怀疑已有恶变。肿瘤位于胆囊颈部可引起右上腹胀痛、疼痛向右背部放射、恶心呕吐等临床表现。     

胰腺实性假乳头状瘤7例临床病理特征并文献复习

目的探讨胰腺实性假乳头状瘤（SPTP）的临床病理特征以及免疫组化特点。方法对7例SPTP进行临床、组织病理、免疫表型的观察并复习相关文献。结果 7例SPTP,男女之比为2∶5,平均年龄34岁,仅3例有临床症状。6例发生于胰腺,有1例发生在胰腺外。肿瘤均呈囊实性;组织学上肿瘤细胞形态较一致,呈巢状排列,并形成假乳头状结构,部分瘤细胞呈透明细胞样细胞改变;间质黏液样变性、异物巨细胞反应及胆固醇样结晶。免疫组化结果显示：瘤细胞Vimentin、AAT呈强阳性,EMA均呈阴性;部分病例NSE、Syn、CgA、CD56、CD10、、AE1/AE3、PR局部阳性。4例术后随访30～114个月,患者均未发现复发及转移。结论 SPTP少见,多见于年轻女性,以实性、假乳头结构为主要组织学特征,并伴有其它多种组织学结构及多向分化的免疫组化表型。免疫组织化学检测结果对SPTP诊断具有重要价值,AAT、Vimentin阳性是诊断SPTP的可靠依据。